一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种程序性死亡受体‑配体1(PD‑L1)的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD‑L1蛋白的方法，包括如下步骤：1)配制恒定浓度的PD‑L1核酸适体与不同浓度的细胞外囊泡样品混合物；2)将样品混合物放置到微量热泳动(Microscale Thermophoresis，MST)装置进行测量；3)测量每个不同细胞外囊泡浓度的样品混合物的荧光，并且将得到的归一化荧光相对于时间作图，拟合MST轨迹线，再根据MST轨迹线的归一化荧光相对于细胞外囊泡的浓度作图，拟合细胞外囊泡浓度与归一化荧光相关的结合曲线，从而实现对细胞外囊泡表面PD‑L1蛋白的检测。与现有技术相比，本发明的方法灵敏度高，操作简便，检测快速高效、样品消耗少量，价格经济实惠，具有广泛推广的潜力。

权利要求

1.一种程序性死亡受体-配体1（PD-L1）的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法，所述方法为非疾病诊断目的的方法，包括如下步骤：

1）配制恒定浓度的PD-L1核酸适体与不同浓度的细胞外囊泡，将恒定浓度的PD-L1核酸适体与不同浓度的细胞外囊泡分别混合，制得一系列样品混合物；所述PD-L1核酸适体序列如SEQ ID No.1所示；

2）将该系列样品混合物放置到微量热泳动（MST）装置进行测量；

3）测量每个不同细胞外囊泡浓度的样品混合物的荧光，并且将得到的归一化荧光相对于时间作图，拟合MST轨迹线，再根据MST轨迹线的归一化荧光相对于细胞外囊泡的浓度作图，拟合细胞外囊泡浓度与归一化荧光相关的结合曲线，从而实现对细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的检测。

2.如权利要求1所述的程序性死亡受体-配体1（PD-L1）的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法，其特征在于：所述细胞外囊泡包括外泌体。

3.如权利要求1所述的程序性死亡受体-配体1（PD-L1）的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法，其特征在于：所述细胞外囊泡为外泌体；所述样品混合物中，外泌体的浓度范围为22.2～668.3 µg/mL。

4.如权利要求1所述的程序性死亡受体-配体1（PD-L1）的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法，其特征在于：所述样品混合物中，PD-L1核酸适体的浓度为0.05～0.2 nM。

5.如权利要求1所述的程序性死亡受体-配体1（PD-L1）的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法，其特征在于：所述PD-L1核酸适体序列为5’端CY5标记。

6.如权利要求1所述的程序性死亡受体-配体1（PD-L1）的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法，其特征在于：所述细胞为肿瘤细胞。

7.如权利要求6所述的程序性死亡受体-配体1（PD-L1）的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法，其特征在于：所述肿瘤为转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、胃癌或乳腺癌。

8.如权利要求1所述的程序性死亡受体-配体1（PD-L1）的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法，其特征在于：所述微量热泳动装置为Monolith NT.115。

说明书

一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体检测细胞外囊泡表面

PD-L1蛋白的方法

技术领域

[0001] 近年来，精准医疗的液体活检技术已被广泛用于癌症早期筛查、辅助诊断、药物疗效预测以及监测等领域。对PD-1/PD-L1抑制剂的疗效进行精准预测和动态监测成为临床界最关注的问题。本发明涉及一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法，这将有助于PD-L1表达水平检测新方法的推进。

背景技术

[0002] 随着科学技术的发展，作为新的肿瘤治疗革命性技术，免疫治疗尤其是免疫检查点治疗发展迅猛，成为目前肿瘤研究领域的重要方向之一。其中基于PD-1/PD-L1抗体的免疫疗法是当今肿瘤免疫治疗领域的研究热点，备受关注，开启肿瘤治疗的新模式。

[0003] 基于PD-1/PD-L1抗体的免疫疗法已被批准用于多种晚期肿瘤的治疗，尽管部分肿瘤患者能从中获益，但并不是所有的肿瘤患者都能获益。而对于对药物没有响应的患者，不但治疗无效，还要承受治疗的副作用以及昂贵的治疗负担，所以知道哪些病人会有效果是很重要的。有研究表明，PD-L1在肿瘤细胞表面高表达，那么，PD-L1的高表达则意味着当PD-1与PD-L1的结合被阻断时，使用PD抑制剂的疗效更好，患者获益几率更大。因此，肿瘤细胞PD-L1表达水平被认为是PD-1/PD-L1抗体药物治疗的疗效预测指标，而用药之前检测患者的PD-L1水平可以指导是否需要用药治疗。所以，PD-1/PD-L1抗体药物的使用，需要补充检测PD-L1的表达，然后根据患者自身的情况来选择是否能用药。

[0004] 通过免疫组织化学测定肿瘤细胞PD-L1的表达水平能够直接反映癌症患者对PD抑制剂应答率。然而，肿瘤细胞PD-L1的表达水平并不是一成不变的，而是动态变化的。化疗、放疗等都能影响肿瘤PD-L1的表达。因此肿瘤细胞PD-L1表达水平并不能作为PD-1/PD-L1抗体药物治疗疗效的唯一预测指标。

[0005] 细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是细胞旁分泌产生的一种亚细胞成分，实质上是一组纳米级颗粒，包括外泌体(exosome)、膜微粒(microparticle，MP)、微囊泡(microvesicle，MV)等。几乎所有的细胞都能产生细胞外囊泡，其中含有脂质、蛋白质、核酸(DNA、mRNA及microRNA、lncRNA、circRNA等)等多种母细胞来源的生物活性成份，这些信息物质包裹在囊泡中或携带于膜上。特定类型的细胞外囊泡有望成为辅助疾病诊断及预后判断的新分子标记物，在抗肿瘤治疗、再生医学、免疫调节等方面也有着广阔前景。而在一项新的研究中发现肿瘤细胞释放的外泌体表面也表达PD-L1，且也可直接结合T细胞并抑制这些T细胞的抗癌活性。所以，鉴定出肿瘤细胞分泌的外泌体也表达PD-L1为肿瘤免疫逃逸以及免疫检查点机制提供了新见解。所以监测外泌体的PD-L1表达水平有可能成为癌症患者预测PD-1/PD-L1抗体药物治疗疗效的另一种方式。

[0006] 目前，常用的PD-L1检测方法包括免疫组织化学技术(immunohistochemistry，IHC)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等两种，其中IHC在膜性形式PD-L1(mPD-L1)检测应用最广泛，但是也具有不足，比如，染色的抗体多样性，染色技术及条件的不统一；结果判读主要通过人为定性，有一定的主观性；而ELISA在可溶性形式PD-L1(sPD-L1)占据主要地位，但是该方法的操作复杂繁琐，耗时，样品消耗量大，不是一个经济实惠的选择。另外，以上两种方法都会用到抗体，针对抗体存在不稳定、易失活、以及成本高的缺点，因此，需要更稳定，更有效，和更低成本的PDL1的结合配体进行PD-L1表达水平的检测，以及PD-L1的检测方法有待进一步创新和推广。

[0007] 微量热泳动(Microscale Thermophoresis，MST)是近年来兴起的一种测定生物分子相互作用的新技术。它基于荧光标记分子在温度梯度内的定向移动，能够在均相溶液中灵敏、快速地测量生物分子间的相互作用。生物分子的电荷、质量、构象和水化层发生改变均可使生物分子在温度梯度场中的运动速率发生变化，通过这种变化来分析生物分子间的相互作用，适合于蛋白质、核酸、小分子等多种物质的相互作用研究。它的优势在于：测试方式优于传统技术，可应用于任意缓冲液中操作，无需要表面固定；使用材料少量，最少只需要4μL样品；更高效，操作简便、无需纯化样品；应用范围广泛，可以检测任何生物分子间的相互作用，即使体积较大、不稳定的样品也同样适用，比如脂质体、外囊泡、外泌体。

[0008] 核酸适体(aptamer)是经指数富集配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)获得，能和靶标高亲和、高特异性结合的功能性单链寡核苷酸。相比于抗体，核酸适体具有可化学合成、批次差异小、分子量小、热稳定性高等诸多优点，是一种具有优异性能的分子检测工具，在生化分析检测领域具有重要的应用价值。

[0009] 随着精准医疗的不断发展，PD-L1在细胞外囊泡的表达检测有可能成为伴随或辅助诊断的标记物，这将有助于临床医生有效地筛选PD-1/PD-L1治疗的潜在获益患者。PD-L1的检测方法不断创新，这将是精准医学和个体化医疗的一大进步，但仍需要更多的研究。

发明内容

[0010] 本发明的主要目的在于克服现有技术中检测肿瘤细胞PD-L1的表达水平的不确定性，不全面性，以及检测方法步骤繁琐、操作复杂耗时、样品消耗量大、价格昂贵等问题，提供一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法，用高特异性，高亲和力识别PD-L1的核酸适体去检测细胞外囊泡表面表达的PD-L1，通过微量热泳动设备去检测它们之间的结合，该方法操作简便，快速高效、价格经济实惠，灵敏的灵敏度高，检测样品消耗少量。

[0011] 本发明采用如下的技术方案：

[0012] 一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法，包括如下步骤：

[0013] 1)配制恒定浓度的PD-L1核酸适体与不同浓度的细胞外囊泡，将恒定浓度的PD-L1核酸适体与不同浓度的细胞外囊泡分别混合，制得一系列样品混合物；

[0014] 2)将该系列样品混合物放置到微量热泳动(Microscale Thermophoresis，MST)装置进行测量；

[0015] 3)测量每个不同细胞外囊泡浓度的样品混合物的荧光，并且将得到的归一化荧光相对于时间作图，拟合MST轨迹线，再根据MST轨迹线的归一化荧光相对于细胞外囊泡的浓度作图，拟合细胞外囊泡浓度与归一化荧光相关的结合曲线，从而实现对细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的检测。

[0016] 其中，所述PD-L1核酸适体序列如SEQ ID No.1所示，为：

[0017] 5'-TACAGGTTCTGGGGGGTGGGTGGGGAACCTGTT-3'。

[0018] 优选地，所述PD-L1核酸适体序列可为5’端CY5标记。

[0019] 优选地，所述细胞外囊泡为肿瘤细胞系分泌的包括外泌体。

[0020] 优选地，所述细胞外囊泡为外泌体时，所述样品混合物中，外泌体的浓度范围可为22.2～668.3μg/mL。

[0021] 优选地，所述样品混合物中，PD-L1核酸适体的浓度可为0.05～0.2nM。

[0022] 优选地，所述细胞可为肿瘤细胞。

[0023] 优选地，所述肿瘤可为转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、胃癌或乳腺癌等。

[0024] 优选地，所述微量热泳动装置可为Monolith NT.115。

[0025] 优选地，所述样品混合物进行检测前，不需要进行过多的孵育，现配现测，整个检测过程约10min，且所需体积最少为4μL。

[0026] 由上述对本发明的描述可知，与现有技术相比，本发明的一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体检测细胞外囊泡表面PD-L1蛋白的方法灵敏度高，操作简便，检测快速高效、样品消耗少量，价格经济实惠，具有广泛推广的潜力。

附图说明

[0027] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

[0028] 图1为来自黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体的代表性透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)图像。比例尺，100nm。

[0029] 图2为纳米颗粒追踪分析仪(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)表征黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体的粒径大小。在图2中，纵坐标为外泌体浓度，横坐标为粒径大小。

[0030] 图3为黑色素瘤细胞系A375的细胞裂解液(W)微囊泡(M)以及外泌体(E)的蛋白质印迹分析(Western Blot)，分别分析了PD-L1，CD63，Actin三种蛋白，其中PD-L1即为程序性死亡受体-配体1，CD63为外泌体膜上富含参与外泌体运输的跨膜蛋白，即外泌体标记物，Actin是肌动蛋白，为内参蛋白。且所有泳道都装有相同量的总蛋白质。

[0031] 图4为通过流式细胞术考察黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体PD-L1，CD63两种蛋白的表达，其中图A为CD63抗体与外泌体的结合情况，图B为PD-L1抗体与外泌体的结合情况，图C为CY5标记PD-L1核酸适体与外泌体的结合情况，且外泌体是通过吸附作用缀合到乳胶醛珠上。在图4中，横坐标为荧光强度。

[0032] 图5为通过激光共聚焦荧光显微镜考察黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体PD-L1蛋白的表达，分析CY5标记PD-L1核酸适体与外泌体PD-L1蛋白的结合情况。且外泌体是通过吸附作用缀合到乳胶醛珠上。

[0033] 图6为通过微量热泳动(Microscale Thermophoresis，MST)检测PD-L1核酸适体与黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体PD-L1蛋白的结合情况。其中图A是测量每个不同外泌体浓度的毛细管内的荧光，并且将加热点中的归一化荧光相对于时间作图，得到MST迹线。在图A中，纵坐标为荧光强度，横坐标为时间。图B是将MST迹线的相对归一化荧光(ΔFnorm)相对于外泌体的浓度作图，拟合得到外泌体浓度与ΔFnorm相关的结合曲线，图中右侧标记从上到下分别为668μg/mL、579μg/mL、490μg/mL、401μg/mL、312μg/mL、223μg/mL、134μg/mL、89μg/mL、67μg/mL、22μg/mL、0μg/mL。在图B中，纵坐标为相对归一化荧光，横坐标为外泌体浓度。CY5标记PD-L1核酸适体的浓度保持恒定在0.1nM，而外泌体浓度范围是从668.25到22.275μg/mL不等。通过Fnorm＝Fhot/Fcold计算归一化荧光(Fnorm)。ΔFnorm＝Fnorm(外来体的高浓度)-Fnorm(空白)，其中Fhot和Fcold代表MST迹线的限定时间点的平均荧光强度。

具体实施方式

[0034] 下面通过实施例具体说明本发明的内容：

[0035] 实施例1差速离心法提取黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体

[0036] 对于从黑色素瘤细胞系A375细胞培养上清液中提取的外泌体，避免来自胎牛血清中外泌体的干扰，通过在100000×g下过夜离心胎牛血清以除去外泌体，获得无牛外泌体的胎牛血清(FBS)。然后，将细胞在补充有10％外泌体耗尽的FBS和1％(v/v)青霉素-链霉素的培养基中于37℃培养。孵育60小时后，收集细胞培养物上清液并在4℃下2000×g离心20分钟(Eppendorf，5424R)以除去细胞和细胞碎片，收集上清液并在4℃下16500×g离心45分钟以除去大量的微囊泡(Eppendorf，5424R)。将微囊泡沉淀重悬浮于PBS中，保存于冰箱4℃。而上清液在4℃以100000g离心2小时后收集外泌体(Beckman Coulter，Optima XPN-90)。将沉淀的外泌体重悬浮于PBS中，并通过在100000×g下超速离心2小时收集，重复一次，最后将外泌体重悬浮于PBS中并保存于4℃。

[0037] 实施例2黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体形态学表征

[0038] 为了鉴定外泌体，需要对外泌体进行形态学分析。那么，为了将纯化的小囊泡表征为外泌体，可以通过透射电子显微镜和纳米颗粒追踪分析仪来表征。首先，通过透射电子显微镜来表征外泌体的形貌大小，具体操作：外泌体被滴在碳涂层的铜网格上，静置1分钟(用镊子夹铜网要轻，防止铜网夹破)，在室温下用2％乙酸双氧铀染色1分钟后，用滤纸沿着边缘将染液吸干，铜网放在灯下烤10分钟，使用透射电子显微镜(Tecnai，G2spirit FEI，USA)观察拍照。而对于外泌体的浓度和粒径大小分布，通过纳米颗粒追踪分析仪(Particle Metrix，Zeta View，Germany)测量。

[0039] 结果如图1至图2所示，图1为来自黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体的代表性透射电子显微镜图像。比例尺，100nm。从图中可以清楚直观的看到双层膜状外囊泡，这是外泌体的典型结构。图2为纳米颗粒追踪分析仪表征黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体的粒径大小。从图中可以看到外泌体的平均粒径大小为134.4nm，与文献中报道的30～150nm一致。以上两个结果表明已经成功提取了外泌体。

[0040] 实施例3验证黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体表达PD-L1

[0041] 成功提取了外泌体后，重要的是表征外泌体表达的蛋白，例如CD63和PD-L1，可以通过蛋白质印迹法鉴定。使用12％SDS-PAGE电泳分析，分别上样细胞裂解液(W)微囊泡(M)以及外泌体(E)，上样蛋白质总量相等，三块胶平行跑；之后并转移到硝酸纤维素膜上，再将印迹用封闭缓冲液(Beyotime Biotechnology)在室温下封闭1小时，洗涤后在4℃下分别与PD-L1、CD63和Actin一抗孵育过夜，洗涤后与HRP缀合的二抗(Cell Signaling Technology)一起室温孵育2小时；洗涤后用ECL检测试剂(Pierce)显色膜上的印迹，化学发光成像仪进行成像拍照。其中CD63用作外泌体标记物。Actin用作内参蛋白。

[0042] 结果如图3所示，图3为黑色素瘤细胞系A375的细胞裂解液(W)微囊泡(M)以及外泌体(E)的蛋白质印迹分析，分别分析了PD-L1，CD63，Actin三种蛋白。从图中可以看到只有外泌体有CD63表达，进一步确认成功提取了外泌体。而对于PD-L1，细胞裂解液、微囊泡、以及外泌体都有表达，成功验证了提取的外泌体上有表达PD-L1。另外，Actin作为内参蛋白，细胞裂解液、微囊泡、以及外泌体都有表达，证明实验没有问题。

[0043] 外泌体太小，无法直接通过流式细胞仪和共聚焦成像进行可靠分析。为了克服这个问题，将外泌体通过吸附作用缀合到大小约为3μm乳胶醛珠上。然后用荧光标记的抗体检测乳胶醛珠-外泌体复合物，并通过流式细胞术和共聚焦成像分析。这有利于外泌体表面蛋白的快速半确定性表征。首先，通过一二喳淋甲酸检测法(BCA)定量的10μg外泌体与5μL乳胶醛珠在1.5mL微量离心管中孵育15分钟，然后加入PBS至最终体积1mL，孵育2小时。接下来，添加100μL包含1M甘氨酸和20％BCA(w/v)的封闭溶液，孵育30分钟。最后，以5000rpm离心3分钟，除去上清液，重悬乳胶醛珠-外泌体复合物沉淀并离心洗涤两次，最后重悬浮于50μL PBS(0.5％BSA)中，并保存于4℃。所有步骤均在室温下进行。接下来，将5μL乳胶醛珠-外泌体复合物分别在100μL PBS(0.5％BSA)中与5μL外泌体蛋白抗体(PD-L1和CD63抗体)以及200nM CY5标记的PD-L1核酸适体(PD-L1核酸适体如SEQ ID No.1所示)室温下孵育40分钟。
5000rpm离心3分钟，除去上清液，重悬乳胶醛珠-外泌体复合物沉淀并离心洗涤两次，重悬浮于50μL PBS(0.5％BSA)中，最后使用流式细胞仪(Beckman Coulter，CytoFLEX)通来测量乳胶醛珠-外泌体-抗体或核酸适体复合物的荧光强度，以及通过激光共聚焦荧光显微镜检测乳胶醛珠-外泌体-核酸适体复合物的荧光信号。不相关的同种型匹配的一抗(Control)和随机序列(RS)作为阴性对照。

[0044] 结果如图4至图5所示，图4为通过流式细胞术考察黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体PD-L1，CD63两种蛋白的表达，其中图A为CD63抗体与外泌体的结合情况，图B为PD-L1抗体与外泌体的结合情况，图C为CY5标记PD-L1核酸适体与外泌体的结合情况。从图A中可以看到，CD63抗体相对于对照抗体有更大的偏移，说明外泌体有表达CD63，再次补充证明成功提取了外泌体。从图B中可以看到，PD-L1抗体相对于对照抗体有更大的偏移，再次补充证明提取的外泌体上有表达PD-L1。从图C中可以看到，PD-L1核酸适体相对于随机序列有更大的偏移，证明PD-L1核酸适体可以特异性结合外泌体表面的PD-L1，即外泌体表面的PD-L1蛋白可以被PD-L1核酸适体识别并检测。图5为通过激光共聚焦荧光显微镜考察黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体PD-L1蛋白的表达，分析CY5标记PD-L1核酸适体与外泌体PD-L1蛋白的结合情况。从图中可以看到，随机序列没有荧光或者很弱的荧光，而PD-L1核酸适体相对随机序列荧光较强，再次补充证明PD-L1核酸适体可以识别、结合并检测外泌体表面的PD-L1。

[0045] 实施例4 PD-L1核酸适体通过微量热泳动检测黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体PD-L1蛋白

[0046] 首先，制备CY5标记PD-L1核酸适体(PD-L1核酸适体如SEQ ID No.1所示)的稀释液。首先，通过NanoTemper分析软件确定PD-L1核酸适体的最佳浓度为0.1nM。但是，在结合缓冲液中制备最终反应混合物时，需要与外泌体连续稀释液进行1:1(v/v)的混合，从而在每个稀释步骤中将PD-L1核酸适体浓度降低50％，因此，应制备CY5标记PD-L1核酸适体为0.2nM。

[0047] 然后，制备外泌体连续稀释液。对于这个实验，需要检测12个浓度的外泌体，所以准备12个200μL离心管，标记离心管从1到12；然后在管1中添加20μL外泌体原液，在离心管2至12中分别添加10μL结合缓冲液，再将管1的10μL外泌体原液转移至管2并进行混匀，将取10μl转移至下一个管并对剩余管重复该稀释，最后从管12中丢弃10μL。因此，最后得到12个
10μL的外泌体稀释液系列。

[0048] 接着，制备最终反应混合物，即为CY5标记PD-L1核酸适体与外泌体反应混合液。为了最小化移液误差，个体结合反应的最佳体积为20μL(10μL核酸适体溶液+10μL外泌体稀释液)。所以，将10μL的0.2nM核酸适体工作溶液分别加入到10μL的每种外泌体稀释液中，并通过上下移液几次非常好地混匀样品，然后将样品混合物填充到优质毛细管(MO-K025Premium Capillaries，Beijing，China)中。再将毛细管放置到毛细管托盘上，然后插入MST装置(MicroScale Thermophoresis instrument Monolith NT.115，NanoTemper Technologies，Munich，Germany)进行测量。

[0049] 最后，测量每个不同外泌体浓度的毛细管内的荧光，并且将得到的归一化荧光相对于时间作图，拟合MST轨迹线，再根据MST轨迹线的归一化荧光相对于外泌体的浓度作图，拟合外泌体浓度与归一化荧光相关的结合曲线，从而实现对外泌体表面PD-L1蛋白的检测。

[0050] 结果如图6所示，图6为通过微量热泳动检测PD-L1核酸适体与黑色素瘤细胞系A375分泌的外泌体PD-L1蛋白的结合情况。其中图A是归一化荧光相对于时间作图，得到的MST迹线。图B是将MST迹线的相对归一化荧光(ΔFnorm)相对于外泌体的浓度作图，拟合得到外泌体浓度与ΔFnorm相关的结合曲线。从图A中可以看到，MST迹线在外泌体浓度范围内存在很好的分布，而从图B建立的外泌体浓度与ΔFnorm相关的结合曲线显示出PD-L1核酸适体可检测的外泌体浓度范围为22.275～668.25μg/mL。

[0051] 以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。