确定荧光强度的方法和显微镜

摘要

由本发明解决的第一个问题在于，在超分辨率显微术中确定绝对荧光强度，这目前为止已经通过调整计算来确定，但随后系统性太低，或者通过孔径测光来确定，但具有相对大的误差和较低速度。由本发明解决的第二个问题在于，目前为止在超分辨率显微术中轴向定位准确度已经是相对低的。解决第一问题在于，通过背景强度值来校正荧光强度值，该荧光强度值在分离的强度分布的部分区域之上积分并来源于第一单独图像，该背景强度值在相同图像区域之上积分并来源于所述图像区域不合荧光的另一个单独图像。解决第二问题在于，可以通过各来源于强度分布的不同部分区域且以该方式校正的两个荧光强度值来确定轴向位置。2.3.超分辨显微术。

权利要求

1.一种确定荧光强度的方法，其中进行以下步骤：

a)使用显微镜记录样品的多个二维单独图像，其中相同样品区域包含在所述单独图像中的每一个中，并且在记录所述单独图像期间不同发射体被激发以发射荧光，使得在所述单独图像中的至少一个中，发射体的荧光发射的至少一个衍射受限强度分布被隔离，b)用隔离的强度分布确定所述单独图像，其特征在于以下步骤：

c)通过积分所述单独图像的相关像元件的记录的强度，确定在所述隔离的强度分布的部分区域中，特别是在整个隔离的强度分布中的第一强度值，d)确定所述单独图像中的至少另一个，其至少在与所述隔离的强度分布的部分区域对应的图像区域中没有荧光发射，e)通过积分另一个单独图像的相关像元件的记录的强度，确定在所述另一个单独图像的图像区域中的第二强度值，以及f)确定调整的荧光强度为所述第一强度值和所述第二强度值之间的差值。

2.根据权利要求1所述的方法，其中

-在步骤d)中，确定多个其他单独图像，其中的每一个至少在与所述隔离的强度分布的部分区域对应的相应的图像区域中没有荧光发射，以及-在步骤e)中，通过积分所述其他单独图像中的每一个的相关图像区域的像元件的记录的强度并除以确定的其他单独图像的数目，确定所述第二强度值。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤a)之前提供所述样品，其中用在光激发下闪烁的至少一个可光切换的荧光染料、可光激活的荧光染料或荧光染料将所述样品标记为发射体。

4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在所述部分区域中所述隔离强度分布的相关像元件和所述其他单独图像的相关像元件被积分，所述部分区域对应于具有为所述显微镜的点扩散函数的半高全宽的1.46和2.26倍之间的半径的离散化圆形区域，特别是具有为所述点扩散函数的半高全宽的1.86倍的半径的离散化圆形区域。

5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，用于基于二维单独图像确定荧光发射体在第三空间维度中的坐标，其中附加地进行以下步骤：g)基于步骤a)至f)确定所述隔离的强度分布的第二部分区域的第二调整的荧光强度，其中所述第二部分区域不同于所述第一部分区域，特别是小于所述第一部分区域并且特别是包含在其中，以及为了确定所述第二强度值，i)积分在所述单独图像或所述其他单独图像中的相关图像区域的像元件的记录的强度，或者ii)将所述第一部分区域的第二强度值缩放至所述第二部分区域的面积，以及h)基于所述第一调整的荧光强度和所述第二调整的荧光强度，特别是基于所述第一调整的荧光强度和所述第二调整的荧光强度的商，确定所述发射体的坐标值。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一部分区域和所述第二部分区域具有特别是圆形区域的相同形状，但是特别地在关于彼此同心布置中具有不同尺寸。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中在步骤a)中，特别是通过将检测束路径分束为不同光学路径长度的两个区段中直到检测，特别是分束到相同检测器的不同区域中，同时地记录具有在所述第三空间维度中不同的聚焦位置的两个单独图像。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中在步骤h)之前，基于所述第二部分区域中的强度分布的模型函数，通过曲线拟合来校正或替换所述第二调整的荧光强度，其中最初确定的第二调整的荧光强度用在曲线拟合中。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中特别是使用在所述第三维度中不同的坐标值的荧光强度的商的保存的表格，基于指定的校准值来确定所述坐标值。

10.一种评估包含用至少一个荧光染料标记的样品的荧光事件的强度分布的二维显微镜图像的方法，其中所述强度分布具有与显微镜的点扩散函数的范围对应的相应的衍射相关的范围，并且荧光事件中的单独一个的至少一个强度分布被隔离，所述方法包括以下步骤：-确定在所述无重叠的强度分布的第一部分区域中，特别是在整个隔离的强度分布中的积分的第一强度值，-确定在所述无重叠的强度分布的第二部分区域中的积分的第二强度值，其中所述第二部分区域不同于所述第一部分区域，特别是小于所述第一部分区域并包含在其中，以及-基于所述第一强度值和所述第二强度值，特别是基于所述两个强度值的商，确定所述隔离的强度分布的光度特征变量。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，基于所述光度特征变量，所述隔离的强度分布被分配第三空间维度中的位置，特别是与所分配的位置一起储存所述显微镜图像。

12.根据权利要求9或10所述的方法，其中为了记录所述显微镜图像，所述样品通过至少一个光源来辐照并通过光接收器以衍射受限的方式来记录，使得至少一个荧光事件发生，其在所记录的图像中引起具有与所述显微镜的点扩散函数的范围对应的衍射相关范围的至少一个隔离的强度分布。

13.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中用至少一种类型的可转换的荧光团将所述样品(22)标记为发射体，并且最初所述可转换的荧光团的子集被转换成可激发状态，然后记录所述单独图像中的每一个，使得所转换的可激发的荧光团至少局部具有与由体积的倒数所规定的密度相比更低的密度，该体积出于衍射相关原因是不可分辨的，以及所述样品通过至少部分具有激发光的光源来辐照，并且为了记录所述单独图像，通过显微镜物镜将由所述样品发射的荧光辐射以衍射展宽方式成像到至少一个光接收器上。

14.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，所述荧光事件源自光谱上不同发射的荧光染料类型，其中特别是在确定强度之前，所述单独图像的像元件的光谱解混或分离。

15.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中通过具有亚衍射受限的准确度的曲线拟合来确定荧光事件的隔离的强度分布的形心的二维位置。

16.一种控制单元(34)或者计算机程序，特别是在数据载体上储存的计算机程序，设定为执行如前述权利要求中任一项所述的方法。

17.一种显微镜(1)，具有照明束路径和检测束路径，所述照明束路径具有在样品(22)中激发至少一种类型的荧光染料的光源(11、23)，同样特别是用于光激活或光切换荧光染料的光源(11、23)，所述检测束路径具有显微镜物镜(21)和布置在其下游的光接收器(12、

28)；以及具有连接到所述光源(11、23)和所述光接收器(11、28)的、如权利要求16所述的控制单元(34)。

说明书

确定荧光强度的方法和显微镜

[0001] 本发明涉及一种确定荧光强度的方法，其中使用显微镜记录样品的多个二维单独图像，其中相同样品区域包含在单独图像中的每一个中，并且在记录单独图像期间不同发射体被激发以发射荧光，使得在单独图像中的至少一个中，发射体的荧光发射的至少一个衍射受限强度分布被隔离，并且具有该隔离的强度分布的单独图像被确定并且其总强度被确定。

[0002] 在本发明的上下文中，术语荧光被认为包括任何类型的发光，特别是包含磷光。如果显微镜图像中的强度分布具有与显微镜的点扩散函数的范围对应的衍射相关范围，则该强度分布是衍射受限的。如果强度没有与其他发射体的强度分布重叠——如果强度分布高于统计背景，则它被隔离。

[0003] 诸如系统生物学的研究领域依靠量化的数据，该研究领域寻找使用量化模型来描述生物系统。因此目前已经可以使用仅具有低准确度的荧光显微术(例如使用“飞点式”显微镜(Pawley：“生物共聚焦显微术(Biological Confocal Microscopy)”，Springer出版社，第三版、2006年、第6页)或者通过“钙成像”(Pawley，第529页))来确定这样的数据，因为大量误差和噪声源引起强度波动。荧光事件的绝对强度是寻求的变量的示例。误差源的示例是荧光事件的泊松分布的大方差、显微检测体积的尺寸的不确定性、检测器噪声、所使用的荧光团的光物理性质(诸如量子效率、激发和效率光谱及漂白行为)。其他不确定性是不同荧光团类型之间的差异、照明的不均匀性以及样品的背景荧光和自发荧光。随着检查的体积以及因此检查的分子的数量变得更小并且显微镜的空间分辨率能力增加，这些误差变得更大(或者承载更大的权重)。

[0004] 然而，所使用的显微镜的高分辨率能力对于高空间准确度是必须的。分辨率能力取决于已知的显微镜物镜的点扩散函数(PSF)，其总是具有与零不同的范围(空间上：不同于零的体积)，这是由于由显微镜物镜中的样品接收的光的衍射，因此将诸如荧光分子的点状光源光学地成像到有限区域上。显微镜的分辨率能力因此在原理上是受限的(阿贝1873)。然而，产生具有比根据所述基本极限允许的更高分辨率(下文称为“超分辨率”)的图像的若干方法在现有技术中是已知的。

[0005] WO 2006/127692 A2公开了增加分辨率能力的可光切换的荧光染料的用途(‘光激活的定位显微术”，PALM)。使用激活波长处具有极低强度的光，极少量的随机分布的荧光染料分子(荧光团)被转换为可激发的状态(激活的)，并且随后使用具有激发波长的光以已知的方式激发成荧光。剩余的未激活的荧光团不能由激发波长来激发荧光。由于随机分布，激活和激发的荧光团总体空间上以一距离分离，使得以衍射受限的方式成像的、从荧光事件得到的点源的强度分布不会彼此重叠(也就是说隔离)。这特别是适用于二维图像上的投射，其中由于衍射加宽，强度分布在若干像元件(照片元件；像素)之上延伸，然后逐渐消失到背景噪声中。在PALM方法中，具有总体上不会重叠的相应少量的荧光事件的大量单独图像被记录。仅当最后激活的荧光团已经漂白或转变成未荧光状态时，在此重复激活。通过曲线拟合基于衍射加宽的强度分布用单独图像中的亚像素分辨率定位单独荧光事件的原点，其中高斯分布的形式的模型函数适配于测量的二维强度分布并进入高分辨率得到的图像。

[0006] 已知所述单独荧光团定位的其他变型，其在用于隔离的进程的方面上不同。在已知的STOR显微术(“随机光学重建显微术”，STORM)中，只要在单独图像中已经记录足够的光子，例如通过第二光源将成对使用的荧光团切换回到它们的原始状态(去激活的)。还存在PALMIRA(“具有独立运行的采集的PALM”)、FPALM(“荧光PALM”)、dSTORM(“直接STORM”)以及GSDIM(“基态耗尽和单独分子返回”)的方法。

[0007] 出于定位的目的，在所有这些方法中所使用的曲线拟合还可以用于：基于适配的模型函数的体积来确定荧光事件的绝对强度。然而，它已经被发现是作为本发明的部分：在该情况下系统上对于荧光事件获得了极低的绝对强度。

[0008] 此外，已知在显微术中通过起源于天文学的孔径测光(AP)来确定绝对强度。其例如描述在在生物物理学期刊，2010年11月第99期的第3102页中由S.J.Holden等人发表的“在TIRF显微术中限定单分子FRET分辨率的极限(Defining the Limits of Single-Molecule FRET Resolution in TIRF Microscopy)”中。然而，AP展示出相对大的误差。另外，使用AP需要以彼此之间很大距离来大大地隔离激发的发射体，以便于能够在荧光强度分布的环境中记录足够的统计背景。这减缓了记录方法，因为在整个样品中允许同时激发极少的发射体，并且必须记录更多单独图像以对此进行补偿。

[0009] 所有超分辨率显微术方法中的其他问题是第三维度。理想上将有以下可能性：能够不仅在二维而且在三维上将位置分配给所有标识的荧光发射体，而不需要耗时调整显微镜的聚焦。在这种情况下，应该同样能够轴向地(也就是说沿着检测物镜的光轴)获得超分辨率。

[0010] 出于该目的，现有技术提供若干方法。第一光学精密方法基于双螺旋线形式的显微镜的双射深度相关的点扩散函数(“PSF工程”)的形成，如在US 2010/278400 A1中。如在US 2014339439 A1中的更简单的方法基于以下事实继续进行：可以从衍射受限的强度分布的范围推断发射体的轴向定位，其通过将高斯分布形式的模型函数适配到测量的强度分布从曲线拟合来确定。然而，由于PSF的轴向对称，由此不可能为焦平面之外的发射体分配唯一的轴向位置，而是仅分配距焦平面的唯一距离。

[0011] 3D定位的其他方法提供像散的刻意印象，其中如在US 2011/002530 A1中，基于强度分布的得到的变形来推导发射体的轴向位置。因此，在焦平面的两侧上唯一分配成为可能。然而，伴随像散的离焦导致横向定位准确度的恶化。第三种方法是同时记录具有“常规”(在轴向方向上对称的)PSF的两个不同焦平面，如在US 2009/242798 A1中。与基于强度分布的范围简单确定轴向位置相比较，因为原理上唯一的轴向位置可以分配到每一个强度分布，而在此扩大了应用的轴向区域(景深)。

[0012] 然而，在所有这些方法中的轴向定位的分辨率和准确度与横向分辨率和准确度相比是相对较低的。

[0013] 本发明是基于指定在引言部分中提及的类型的方法和进行它的显微镜的目的，这使得可以以尽可能短的测量持续时间用低误差来确定记录的荧光事件的绝对强度。在发展例中，它们附加地允许以高空间分辨率和低误差来确定发射体的轴向位置。

[0014] 该目的通过具有在权利要求1或权利要求10中指定的特征的方法以及通过具有权利要求17所指定的特征的显微镜来实现。

[0015] 在从属权利要求中指定本发明的有利改进。

[0016] 本发明特别地但不是排他地设计为使用超分辨率显微术方法。以隔离方式激发在样品中存在的荧光发射体的所有方法在此是可能的，特别是PALM、FPALM、PALMIRA、STORM和dSTORM。

[0017] 根据本发明，除了在引言部分中提及的步骤以外，该目的通过进行以下的步骤来实现：

[0018] -倘若强度分布高于统计背景，通过积分单独图像的相关像元件的记录的强度，在隔离的强度分布的(第一)部分区域中，特别是在整个隔离的强度分布中确定第一强度值Iraw作为原始强度值，

[0019] -确定单独图像中的至少另一个，其至少在与隔离的强度分布的(第一)部分区域对应的图像区域中没有荧光发射(其高于统计背景)，特别地没有在第一单独图像的(第一)部分区域中包含的隔离的强度分布属于的发射体的发射。

[0020] -通过积分另一个单独图像的相关像元件的记录的强度，在另一个单独图像的图像区域中确定第二强度值IBG作为背景强度值，以及

[0021] -确定调整的荧光强度I作为第一强度值Iraw和第二强度值IBG之间的差值Iraw-IBG。

[0022] 本发明的核心因此是时间序列的其他图像用于背景校正，以代替在相同单独图像中隔离的强度分布的环境。与常规的孔径测光相比，获得背景校正的较高准确度，因为省略了以下不必校正的假设：可以从一个样品区域得出关于另一个样品区域的背景方面的结论。因为与常规的孔径测光相比较的强度分布的环境不参与评估，与AP相比较，对在隔离的强度分布之间足够距离的需求显著减弱，这加速了隔离并因此加速了图像记录。然而，与现有技术相比较的最重要的差异在于：相对于适配的模型函数的体积确定，根据本发明所确定的绝对荧光强度的系统准确性更高。

[0023] 隔离在此通过激活和激发以已知的方式来发生，如上文所描述的超分辨率定位方法之一，例如在WO 2006/127692 A2或US 2009/242798 A1中。有利地，在记录步骤之前可为此提供样品，其中用在光激发下闪烁的至少一个可光切换的荧光染料、可光激活的荧光染料或荧光染料将样品标记为发射体。

[0024] 作为对分离激活的替代例，可以进行隔离，如在DE 10 2015 121 920中，其内容通过用比荧光染料的黑暗状态的平均寿命更短的曝光持续时间记录单独图像在这个范围并入本文，该荧光染料包含在样品中，能够闪烁。因为在小时间尺度内近乎所有荧光染料闪烁，在使用高度感光检测器和对应地短曝光持续时间时，可以省略可专门激活的或可转换的荧光染料。因此，还可以省略激活步骤。然而，这样的检测器是昂贵的。

[0025] 有利地，可以确定多个其他单独图像，其中的每一个至少在相应的图像区域中与没有荧光发射的隔离的强度分布的部分区域(保存用于统计背景)相对应，并且可以通过对其他单独图像中的每一个的相关图像区域的像元件的记录的强度进行积分并除以所确定的其他单独图像的数目来确定第二强度值IBG。以这种方法，可以改进背景强度的准确度以及因此确定荧光强度的准确度。如果隔离仅仅基于闪烁(在不专门激活的情况下)，则图像记录频率优选地应该比样品中包含的一个或多个荧光染料的闪烁频率更高，特别是显著更高。

[0026] 确定荧光强度的特别高准确度可以在以下时候来实现：部分区域中隔离强度分布的相关像元件和其他单独图像的相关像元件被积分，该部分区域对应于具有为显微镜的点扩散函数的半高全宽的1.46和2.26倍之间的半径的离散化圆形区域，特别是具有为所述点扩散函数的半高全宽的1.86倍的半径的离散化圆形区域。

[0027] 本发明的其他方面涉及基于二维单独图像确定荧光发射体在第三空间维度中(特别是在显微镜物镜的轴向方向上)的坐标(定位)，为此除了基于第一强度值Iraw，1和第二强度值IBG，1来确定调整的第一荧光强度I1以外，本发明提供了以下步骤：

[0028] -基于与第一调整的荧光强度I1相同的步骤(也就是说基于专用的第一强度值Iraw，2和专用的第二强度值IBG，2)来确定隔离的强度分布的第二部分区域的第二调整的荧光强度I2，其中第二部分区域不同于第一部分区域，特别是小于它并且特别是包含在其中，以及为了确定第二强度值I2，i)积分在单独图像或其他单独图像中相关图像区域的像元件的记录的强度，或者ii)第一部分区域的第二强度值缩放至第二部分区域的面积，以及[0029] -基于第一调整的荧光强度和第二调整的荧光强度，特别是基于第二调整的荧光强度I2和第一调整的荧光强度I1的商I2/I1，确定发射体的坐标值。

[0030] 换言之，对于相同强度分布的两个不同部分区域(具体地在相应的部分区域中各来自原始强度和背景强度)，确定绝对荧光强度I1和I2。以这种方法，可以特别地用具有比现有技术更高的准确度的超分辨率来在第三空间维度中定位发射体。实验上，已经可以用具有16nm的准确度的超分辨率来确定轴向位置。所确定的坐标可以在此描述绝对位置，但是它不是必须的。还可以是另一个、z依赖的变量，特别是光度特征变量。

[0031] 实施例是有利的，其中第一部分区域和第二部分区域具有特别是圆形区域的相同形状，但是特别地在关于彼此同心的布置中具有不同尺寸。这允许用最高准确度在第三维度中定位。在此可以使用诸如正方形或高阶多边形(具有n＝5、6、7、8...的n边形)的其他形状。然后，还可以仅使用这样的圆形区域或这样的多边形的径向段作为部分区域。

[0032] 例如，如果第一部分区域是含有调整的强度I1，的圆形环，第二部分区域是圆形环内部的含有调整的强度I2的圆形区域，还可以代替地将含有调整的强度I1＝I1’+I2的圆形环的外圆的总区域用作第一部分区域。上述提及的商的得到的倒数彼此仅相差了绝对值1：。

[0033]

[0034] 实施例具有特别的优势，其中特别是通过将检测束路径分束到不同光学路径长度的两个区段中直到检测，特别是分束到相同检测器的不同区域中，同时地记录具有在第三空间维度中不同的聚焦位置的两个单独图像。在大深度区域中，可以用以这种方式所获得的更大景深进行高度分辨轴向定位。特别地，对于这种类型的检测可以使用来自US 2009/242798 A1的方法和显微镜，其内容在这种程度上并入本文中。在实验中，可以在大于800nm的深度区域中展示轴向超分辨率。

[0035] 可以有利的是，基于第二部分区域中的强度分布的模型函数通过曲线拟合来校正或替换第二调整的荧光强度，其中最初确定的第二调整的荧光强度用在曲线拟合中。以这种方法，还可以考虑亚像素强度信息。特别地，如果第二部分区域仅包括很少的全部像素，则这可以是有利的。优选地用固定(指定的)半高全宽来进行曲线拟合。

[0036] 特别是使用在第三维度中不同的坐标值的荧光强度的商的保存的表格，基于指定的校准值可以便利地确定坐标值。这允许确定在第三维度中的绝对位置。附加地，可以校正用该方式已经确定的坐标以补偿折射率的偏差，如M.Bohmer和J.Enderlein在J.Opt.Soc.Am.B 20，554-559(2003)中的“通过宽视场落射荧光显微术的单分子的取向成像(Orientation imaging of single molecules by wide-field epifluorescence microscopy)”或者D.Para等人在J.Phys.Chem.A 108，6836-6841(2004)中的“三维分子取向研究的离焦单分子图像的图像分析(Image analysis of defocused single-molecule images for three dimensional molecule orientation studies)”中一样。

[0037] 即使在没有对隔离的强度分布的统计背景进行高度准确校正的情况下，根据本发明的第三维度的定位可以基于光度特征变量来实现。对于这样的一种评估包含用至少一个荧光染料标记的样品的荧光事件的强度分布的二维显微镜图像的方法，其中强度分布具有与显微镜的点扩散函数的范围对应的相应的衍射相关的范围，并且荧光事件中的单独一个的至少一个强度分布被隔离，提供以下步骤：

[0038] -确定在无重叠的强度分布的第一部分区域中，特别是在整个隔离的强度分布中的积分的第一强度值，

[0039] -确定在无重叠的强度分布的第二部分区域中的积分的第二强度值，其中第二部分区域不同于第一部分区域，特别是小于第一部分区域并包含在其中，以及

[0040] -基于第一强度值和第二强度值，特别是基于两个强度值的商，确定隔离的强度分布的光度特征变量。

[0041] 可以调整第一和第二强度值，例如用于使用常规孔径测光的统计背景。为此，在第一和第二部分区域之和的外部的无荧光发射的环境中(例如在第一部分区域周围的圆形环中)的背景强度值可以被确定并且缩放至相应的部分区域的面积，从积分的第一和第二强度值各减去背景强度，然后确定光度特征变量。

[0042] 为了定位，然后隔离的强度分布可以基于光度特征变量而被分配第三空间维度中的位置，特别是与所分配的位置一起储存显微镜图像。为了简化起见，位置甚至可以是特征变量的确定值。替代地，基于储存(分别确定)的校准值，可以将特征变量的值变换成绝对位置。

[0043] 为了记录显微镜图像，样品优选地通过至少一个光源来辐照并通过光接收器以衍射受限方式来记录，使得至少一个荧光事件发生，其在所记录的图像中引起具有与显微镜的点扩散函数的范围对应的衍射相关范围的至少一个隔离的强度分布。

[0044] 可以用至少一种类型的可转换荧光团便利地将样品标记为发射体，并且最初可转换的荧光团的子集可被转换成可激发状态，然后记录单独图像中的每一个，使得所转换的可激发的荧光团至少局部具有与由体积的倒数所指定的密度相比更低的密度，该体积出于衍射相关原因是不可分辨的，其中样品通过至少部分具有激发光的光源来辐照，以及为了记录单独图像，通过显微镜物镜将由样品发射的荧光辐射以衍射展宽方式成像到至少一个光接收器上。

[0045] 通过化学和光学构件可以实现变换。光学切换方法例如用在PAL显微术和STOR显微术中。在记录显微镜图像(或其他显微镜图像，即单独图像)之后，可以例如通过漂白法将激活的荧光团去激活(就是说，转换成未激活状态)。在其他记录周期中，具有足够低密度的可转换荧光团(随机)子集可以再次被激活并激发。在有利的实施例中，激光扫描显微镜用于转换成可激活的状态。由此可以局部地(例如选择性地ROI)进行激活或转换成可激活的状态。

[0046] 在具体的实施例中，荧光事件可以来源于不同光谱发射的荧光染料类型。特别地，单独图像的像元件可以在光谱上解混或分离，然后确定强度。以这种方法，可以在一种测量中定位多个荧光类型。

[0047] 为了横向定位，通过具有亚衍射受限的准确度的曲线拟合可以有利地确定荧光事件的隔离的强度分布的形心的二维位置。以这种方法，可以获得全部三维空间维度中的超分辨率。

[0048] 本发明还包括控制单元和计算机程序，特别是储存在数据载体上的计算机程序，其设定为执行根据本发明的方法。

[0049] 特别地，本发明包括一种显微镜，该显微镜具有照明束路径和检测束路径，该照明束路径具有在样品中激发至少一种类型的荧光染料的光源，特别是还激发光激活或光切换荧光染料，该检测束路径具有显微镜物镜和布置在其下游的光接收器，并且该显微镜具有控制单元，其设定为执行根据本发明的方法并连接到光源和光接收器。

[0050] 可以特别是用薄层中荧光的激发来排他地记录单独图像，例如在全内反射界面处(TIRF显微术)。

[0051] 下面基于示例性实施例更详细地解释本发明。

[0052] 附图中：

[0053] 图1示意性示出了用于记录显微镜图像、用于高度准确地确定绝对荧光强度以及用于在三个空间维度中超分辨率定位的显微镜，

[0054] 图2示出了高度准确确定绝对荧光强度的方法的流程图，

[0055] 图3以透视图示出了不同单独图像中的相同样品区域的示例，

[0056] 图4示意性示出了在轴向方向上的定位的强度分布的划分，

[0057] 图5示出了在两个替代的实施例中确定轴向坐标值P的方法的流程图，[0058] 图6举例示出了根据三种不同计算方法在不同轴向位置中的发射体的轴向坐标值P的结果，

[0059] 图7示出了通过将荧光事件的强度分布积分的第一部分区域的不同尺寸的效果，以及

[0060] 图8示出了分配绝对轴向位置的校准值。

[0061] 在所有附图中，相同的部件具有相同的附图标记。

[0062] 图1示意性示出了显微镜1，其控制单元34设立为执行根据本发明的方法。显微镜1不仅装备有光源11和相机12，在对于宽场照明和对二维图像的记录的各种情况下，在该照相机12之前布置分束器13，而且装备为激光扫描显微镜(LSM)。LSM以模块化方式由具有激光器23的照明模块L、扫描模块S、检测模块D和具有显微镜物镜31的显微镜单元M组合在一起。来自激光器23的光可以通过光门24和衰减器25受控制单元34影响，然后通过光纤和耦合光学单元20将光馈送进和组合进扫描单元S中。它经由主分束器33和具有两个检流计镜(未示出)的XY扫描仪30，穿过显微镜物镜21通行到样品22，在样品处，它照明了聚焦体积(未示出)。由样品反射的光或发射的荧光光穿过显微镜物镜21通行到相机12，或者经由扫描仪30穿过主分束器30到检测模块D中。例如，主分束器30可以实施为二向色分束器。检测模块D包括由分色器29分离的多个检测通道，其各具有针孔光阑31、滤光器28和光电倍增管32。例如在线形照明的情况下，还可以使用狭槽光圈(在此未示出)来代替针孔光阑31。共焦针孔光阑31用于辨别不是源自于聚焦体积的样品光。光电倍增管32因此仅检测来自聚焦体积的光。照明并共焦地记录的样品22的聚焦体积能够通过扫描仪30在样品22上移动，以便借助于以有目标的方式旋转的扫描仪30的检流计镜来逐个像素地记录图像。检流计镜的移动以及通过光门24或衰减器25的照明的切换直接由控制单元34来控制。从光电倍增管32记录数据同样经由外围接口4来实现。

[0063] 在相机12前面的成像束路径通过分束器13分裂成具有不同光学路径长度的两个区段A、B，它们两者在相机12的不同区域上彼此相邻地终止。由于不同的光学路径长度，这两个区域因此记录来自样品22的不同平面的图像。这两个(平行)焦平面在它们在轴向方向上的定位方面不同。这个方向下文将称为维度z和z方向。

[0064] 通过光源11和相机12的图像记录与扫描仪30的设定无关。光源11可以由用控制单元34可以切换的两个部分光源构成，用激活波长激活(转换成可激发状态)的荧光团的第一部分光源和将这些荧光团激发成荧光的第二部分光源。然而，当相应地配置所使用的隔离方法时，光源11发射只有一个单一波长同样是可能的。

[0065] 虽然LSM部件L、S和D不是必要的，但是可以有利于例如在单独样品区域中激活和激发。因此，控制单元43可以具有简单的设计，例如没有这样的部件的接口。例如，评估单元/控制单元43可以是具有用于光源11和相机12的接口的商用计算机。

[0066] 图2示出了由控制单元34执行的根据本发明确定荧光强度的方法的示例的流程图，其中激活、激发、标识和发射体的2D定位的步骤没有被示出。为了更好的理解，将只考虑第一个单独图像，其以仅一个(恒定的)焦平面来记录。

[0067] 为了记录具有足够低密度的荧光事件的单独图像，通过光源11或者根据定位通过使用具有激活波长的光的弱闪烁的激光23器之一，最初只有少量的荧光团被转换到它们的可激发态中。在此完全随机地实现从在相应的照明场中定位的所有荧光团的总集合中选择实际上激活的荧光团的子集。激活荧光团的密度如果比出于衍射相关原因由物镜21不可分辨的体积的倒数更小，则在此是“足够低”的。因此，激活的荧光团以基本上比显微镜物镜21的PSF的范围更大的距离彼此间隔开。使用与激活波长不同的激发波长，然后这样转换的荧光团被激发。这可以继而使用光源11或根据定位使用激光器23之一来完成。

[0068] 通过相机12将随后由激发的荧光团发射的荧光辐射记录在二维单独图像(“显微镜图像”)中，优选地保存该单独图像，然后进行量化评估。归因于显微镜物镜21中入射光的衍射，每个荧光事件以强度分布成像到相关的显微镜图像中，其范围对应于显微镜物镜21的点扩散函数的范围，也就是说在二维投射中近似为艾里斑的直径。由于在激活的荧光团之间的距离(基本上大于显微镜物镜的PSF的范围)，显微镜图像的荧光事件的强度分布基本上无重叠。

[0069] 激活的荧光团随后再次通过光切换或通过漂白来去激活，并且新记录周期用发射体的激活和激发来开始，使得在相机12中记录的荧光发射的强度分布被隔离并记录到其他单独图像中。通过重复记录周期，记录其他单独图像。

[0070] 接下来，标识显微镜图像中的单独荧光事件。出于该目的，例如首先通过高斯滤波器并然后通过拉普拉斯滤波器以已知方式来处理显微镜图像。这些滤波器可以实现为例如块算符(算符矩阵)，其在显微镜图像上被逐个像素地引导。为了确定过滤的像素的强度、块算符还考虑周围像素的强度，也就是说例如高斯滤波器的5×5像素的块和拉普拉斯滤波器的总共3×3像素的块。高斯滤波器移除散粒噪声，拉普拉斯滤波器移除较大的邻接区域。为了标识，通常只要区域中荧光事件的存在被确定，而另外在那个区域内的定位不是必须的。这例如通过逐个区段搜索具有大于指定的标识阈值的强度值的像素或像素组合来完成。例如，在相关像素的记录的强度值大于50个光子的等同物时，在像素中检测到荧光事件的存在。

[0071] 图3出于解释图2中所示的方法的目的图示时间序列的四个单独图像的四个细节。每个细节显示不同时间的相同样品区域。在所有细节中，用实线来标记具有半径r1(然而为了简化未示出)的中央圆形区域A1作为单独图像的第一部分区域。由圆形环AEZ来封住这个圆形区域，由断线示出了该圆形环的外圆(为了简化未示出半径rEZ)。在图3A中的第一单独图像中，在第一部分区域内定位了基于如上图示的定位方法已经标识的发射体的荧光发射的强度分布#1。从用超分辨率定位的强度分布的中心点开始，第一部分区域是在所述中心点周围的圆形区域，其中它的半径r1是强度分布#1的半高全宽(FWHM)的1.86倍。通过在面积A1之上积分像元件的强度，可以确定强度分布的原始强度值Iraw。为了调整原始强度值Iraw，现在必须确定荧光发射的统计的背景。为此使用其他单独图像。

[0072] 半径rEZ是半径r1的两倍。半径rEZ限定的圆形环表示禁区，其在其他单独图像中必须没有荧光发射，使得它们能够用于确定统计的背景。因为在图3B中的第二单独图像中荧光事件#2相交于禁区并且附加地其他荧光事件#3位于在中心第一部分区域中，这个单独图像不能用于确定并校正背景。

[0073] 然而，在图3C的第三单独图像中的荧光事件#4位于禁区的外部。中心第一部分区域还是自由的(由阴影线示出)。第三单独图像因此可以有助于确定背景。因此将面积A1内的像元件的强度积分为第一部分值IA1，1。因为在图3D的第四单独图像中，禁区AEZ和中央第一部分区域A1的两者同样是自由的，保存为统计背景，在此面积A1内的像元件的强度同样被积分，以给出第二部分值IA1，。从部分值IA1，1和IA1，2形成平均值，以作为背景强度值IBG。

[0074] 最终，从原始强度值Iraw和背景强度值IBG计算出调整的荧光强度值I1。

[0075] 图4示出了划分强度分布的示意图，其例如已经在二个维度上标识并定位到两个部分区域中，以及出于说明性目的，来自不同z平面的荧光发射的假设强度分布的不同范围中。在该示例中，部分区域由具有半径r1和r2以及面积A1和A2的同心圆区域形成。

[0076] 图5示出了确定光度特征变量P作为相关发射体的轴向坐标的序列。在图4的强度分布的两个部分区域中，将面积A1和A2中的像元件的强度积分为相应原始强度值Iraw，1和Iraw，2。

[0077] 如相对于图3所解释的，第一部分区域的统计背景从第一部分区域A1没有荧光发射的多个其他单独图像来确定为形式为背景强度值IBG。然后背景强度值IBG用于调整原始强度值Iraw，1和Iraw，2。为此，使用面积比A2/A1，将为第一部分区域A1所确定的背景强度值IBG缩放到第二部分区域A2的尺寸。

[0078] 根据两个部分区域的如此调整的第一和第二荧光强度I1和I2，使用商形成，光度特征变量P被确定为相关发射体的轴向坐标并被储存。

[0079] 替代地或额外地，从将通过曲线拟合所确定的第二荧光强度IFit，2考虑为分子的商，可以确定光度特征变量P。在该曲线拟合计算中，高斯模型函数可以适配于第二部分区域A2中所测得的强度分布。在出口计算中使用的起始参数可以是由积分确定的第二荧光强度I2。

[0080] 图6示出了根据三种不同计算方法在不同轴向位置中发射体的轴向坐标值P的结果。根据图5，通过对两个同心部分区域中所测量的强度的积分并减去从其他单独图像所确定的背景，来获得由菱形标记的数据点。通过在整个第一部分区域A1中将高斯函数适配于强度分布，在两个通常的曲线拟合计算中来确定两个其他曲线。在一个曲线拟合计算中(数据点示出为正方形)，固定地指定高斯函数的半高全宽。在另一个曲线拟合计算中(数据点示出为圆形)，半高全宽是自由参数。可以看到常规方法的系统性偏差。

[0081] 图7示出了根据本发明确定绝对荧光强度的方法的准确度，该绝对荧光强度首先作为第一部分区域的尺寸的函数，其次作为用于背景确定的其他单独图像的数量的函数。显而易见的，在1.86倍的半高全宽的半径r1(用箭头标记)处实现最佳结果。从用于背景确定的很多的七个单独图像开始，统计误差不会明显地进一步降低。

[0082] 为了能够从光度特征变量P(强度分布的不同部分区域中调整的荧光强度的商)中导出绝对空间位置，必须进行校准。图8示出了由实验确定的校准值，其用于图6所描述的各种评估方法。图8A示出了通过压电z扫描仪确定的，作为单独发射体的轴向位置的函数的特征变量P的z相关性(中位数)。图8B示出了用于133nm的相机12的像元件的尺寸、r1＝6.5像元件的第一部分区域的尺寸(与1.86倍半高全宽对应)以及在七个其他单独图像之上的背景的平均化的相关联的相对误差。

[0083] 图8C示出了在两个不同焦平面(下文称为通道)中同时记录单独图像的校准点。它们由f(ch1，ch2)＝(P1-P2)/(P1+P2)来计算出，其中光度特征变量P1从第一通道ch1的单独图像(对应于束路径区段A)来确定并且光度特征变量P2从第二通道ch2的单独图像(对应于束路径区段B)来确定。使用在校准点之间的插值，绝对位置z可以从光度特征变量P来导出。

[0084] 图8D示出了由多项式的适配所确定的已插值的校准曲线。根据f((ch1，ch2)＝-(w1-w2)/(w1+w2)计算出称为BP的曲线，其中w1和w2表示通道一和通道二中的强度分布的半高全宽。

[0085] 最终，图8E在顶部处示出了基于使用调整的强度比率由实验确定的光度特征变量的光度特征变量P的原始校准曲线，以及在底部处示出了相关联半高全宽的原始校准曲线。

[0086] 附图标记列表

[0087] 1 显微镜

[0088] 2 显微镜图像

[0089] 11 光源

[0090] 12 相机

[0091] 13 分束器

[0092] 20 准直光学单元

[0093] 21 显微镜物镜

[0094] 22 样品

[0095] 23 激光器

[0096] 24 光门

[0097] 25 衰减器

[0098] 26 光纤耦合器

[0099] 27 镜筒透镜

[0100] 28 滤光器

[0101] 29 二向色性分束器

[0102] 30 扫描仪反射镜

[0103] 31 针孔光阑

[0104] 32 光电倍增管

[0105] 33 主分束器

[0106] 34 控制单元

[0107] D 检测模块

[0108] M 显微镜

[0109] L 照明模块

[0110] S 扫描模块

[0111] A、B 束路径区段