融合蛋白、其编码基因及在生物合成上的应用

摘要

本发明涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包含查尔酮合成酶和查尔酮还原酶，查尔酮合成酶和查尔酮还原酶通过一连接子GGGS相连，以及编码本发明所述融合蛋白的基因和包含所述基因的重组工程菌，本发明所述融合蛋白可用于查尔酮和异甘草素的生物合成。

权利要求

1.一种生产异甘草素的重组酵母工程菌WM2-2，其特征在于，将重组表达载体pYM1、pYM2和pYM3转入到酵母工程菌WAT11中，所述重组表达载体pYM1包含苯丙氨酸解氨酶编码基因PAL及肉桂酸4-羟化酶编码基因C4H，所述PAL插入双元酵母表达载体pESC-His的启动子GAL1下游，所述C4H插入双元酵母表达载体pESC-His的启动子GAL10下游；

所述重组表达载体pYM2包香豆酰-CoA连接酶编码基因4CL、查尔酮合成酶-查尔酮还原酶融合蛋白编码基因CHS::CHR，所述4CL插入酵母表达载体pESC-Leu的启动子GAL1下游，所述CHS::CHR插入到表达载体pESC-Leu的启动子GAL10下游；

所述重组表达载体pYM3包含查尔酮合成酶-查尔酮还原酶融合蛋白编码基因CHS::CHR，所述CHS::CHR插入到表达载体pESC-Trp的启动子GAL10下游，所述CHS::CHR是经由CHS在3’端通过连接子GGGS编码基因连接到CHR的5’端形成融合基因CHS::CHR；其中，所述PAL编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的苯丙氨酸解氨酶，所述C4H编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的肉桂酸4-羟化酶；

所述4CL编码SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的香豆酰-CoA连接酶；

所述CHS::CHR编码由SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的查尔酮合成酶和SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的查尔酮还原酶组成的融合蛋白，所述查尔酮合成酶和查尔酮还原酶通过连接子GGGS连接。

说明书

融合蛋白、其编码基因及在生物合成上的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种融合蛋白及所述融合蛋白编码基因、包含所述融合蛋白编码基因的表达载体和重组菌，以及所述融合蛋白或重组均在异甘草素合成中的的应用，属于药用成分合成生物学领域。

背景技术

[0002] 作为一味有几千年历史的古老植物药，甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)是最常用的大宗珍稀濒危药材之一，对多种疾病表现了良好又安全的预防和治疗作用，几乎出现在所有中医处方、成药，和越来越多的保健品甚至食品中。异甘草素是甘草中含量较高的一种查尔酮,也是一种常用天然色素，结构简单，研究发现具有抗炎、抗癌、抗组织胺、抗氧化、抗血小板凝集、抗癌、抗过敏、抗病毒和雌激素样等多种显著活性,其中,抗癌活性较为突出，能够抑制多种癌细胞增殖和诱导它们凋亡。它的糖苷化合物异甘草苷能够抑制肿瘤血管的新生、抗抑郁作用和抗氧化。这些都预示着异甘草素在癌症治疗等方面有更好的开发和应用前景。但甘草中植物中异甘草素含量有限，且由于市场的巨大需求量，早在2009年中国野生甘草蕴藏量已经不足50万t。对野生甘草等掠夺性采挖,不仅造成了甘草大幅减产,也导致甘草种植区环境的破坏和沙漠化，甘草种群被破坏后难以得到恢复。为缓解药源不足，有大量通过化学方法来合成异甘草素的方式，但化学合成方法需要用到大量的有机溶剂，对环保不利，且存在一定的爆炸风险。因此也发展出了组织细胞培养等方法来获得异甘草素，但产量太低，耗时太长。异源生物合成异甘草素成为甘草资源可持续发展的有效策略。异甘草素属于5-氧化查尔酮，其生物合成途径起始于苯丙烷途径，在苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammo-nialyase，PAL)、肉桂酸4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase，C4H)和香豆酰-CoA连接酶(4-coumarate:CoA ligase，4CL)的逐步催化下，将苯丙氨酸转化为香豆酰CoA，随后3分子丙二酰辅酶A和1分子香豆酰辅酶A在查耳酮合成酶(chalcone synthase，CHS)和查尔酮还原酶(chalcone reductase，CHR)的作用下生成异甘草素。甘草中异甘草素生物合成途径基因(PAL,C4H,4CL,CHS和CHR)的克隆，为利用发酵工程大量生产活性成分异甘草素提供重要基础。

发明内容

[0003] 具体地，本发明第一方面涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：

[0004] (1)查尔酮合成酶(CHS)；和

[0005] (2)查尔酮还原酶(CHR)；

[0006] 所述查尔酮合成酶和查尔酮还原酶之间通过一连接子连接，所述连接子为GGGS、GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK或GSGMGSSSN中的任意一种。

[0007] 本发明的一个具体实施方案中，涉及到一种融合蛋白，该融合蛋白包含SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的CHS和SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的CHR，所述CHS和CHR之间通过一连接子连接，所述连接子为GGGS、GSG、GSGGGGS、GSGEAAAK、GSGEAAAKEAAAK或GSGMGSSSN中的任意一种，如可以是GGGS。

[0008] 在本发明的第二方面，本发明还涉及编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含：SEQ ID NO：7所述查尔酮合成酶编码基因(CHS)和SEQ ID NO：9所述查尔酮还原酶编码基因(CHR)，优选地，所述CHS和CHR之间通过一linker序列连接，如linker序列可以是GGTGGTGGTTCT，更具体地，比如可以是在CHS在3’端(去除SEQ ID NO：7所示终止密码子TGA后)通过linker序列GGTGGTGGTTCT连接到CHR的5’端形成CHS::CHR。

[0009] 本发明第三方面还涉及重组表达载体，其包含启动子、编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸和转录终止子，所述表达载体优选为将启动子、编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸、终止子与附加型载体采用酵母同源重组的方法拼接起来，其中附加型载体为酵母表达载体，如选自pESC、pYX212、pYES2.0、pRS425、pRS426和p424；优选地为pESC表达载体，所述pESC表达载体选自pESC-Leu、pESC-His或pESC-Trp。。

[0010] 一个优选的实施方案中，本发明所述表在载体可以是选自以下中的任意一种：

[0011] 重组表达载体pYM3，其包含CHS和CHR，所述CHS在3’端(SEQ ID NO：7所示核苷酸序列去除终止密码子TGA后)通过linker序列GGTGGTGGTTCT连接到CHR的5’端形成CHS::CHR，所述CHS::CHR插入到表达载体pESC-Leu的启动子GAL10下游；

[0012] 重组表达载体pYM2，其包括编码SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的香豆酰-CoA连接酶编码基因(4CL)、CHS和CHR，所述CHS在3’端(SEQ ID NO：7所示核苷酸序列去除终止密码子TGA后)通过linker序列GGTGGTGGTTCT连接到CHR的5’端形成CHS::CHR，所述4CL插入酵母表达载体pESC-Leu的启动子GAL1下游，所述CHS::CHR插入到表达载体pESC-Leu的启动子GAL10下游；所述的编码SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的香豆酰-CoA连接酶编码基因可以是如SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。

[0013] 本发明的第四方面，还涉及到一种重组酵母工程菌，所述重组酵母工程菌，包含编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸序列、或本发明第四方面所述的重组表达载体。

[0014] 在本发明的第五方面，涉及到一种优选的重组酵母工程菌，所述的优选的重组酵母工程菌，为在本发明第四方面酵母工程菌中，进一步包含表达载体pYM1，所述表达载体pYM1包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的苯丙氨酸解氨酶编码基因(PAL)和编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的肉桂酸4-羟化酶编码基因(C4H)，所述PAL插入到表达载体pESC-His的启动子GAL1的下游，所述C4H插入到表达载体pESC-His的启动子GAL10的下游。

[0015] 具体地，编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的苯丙氨酸解氨酶编码基因(PAL)可以是如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的肉桂酸4-羟化酶编码基因(C4H)可以是如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。

[0016] 本发明的第六方面，涉及到一种构建本发明所述重组酵母工程菌的方法，所述酵母工程菌的构建方法为：

[0017] 将重组表达载体pYM3转入到酵母工程菌WAT11中，得到菌株WM4；或

[0018] 将重组表达载体pYM2转入到酵母工程菌WAT11中，得到菌株WM3；或

[0019] 将重组表达载体pYM1和pYM2转入到酵母工程菌WAT11中，得菌株WM2-1；或[0020] 将重组表达载体pYM1、pYM2和pYM3转入到酵母工程菌WAT11中，得菌株WM2-2。

[0021] 本发明的第七方面，涉及本发明所述融合蛋白、或编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸、包含本发明所述多核苷酸的重组表达载体、或本发明所述的重组酵母工程菌在生产查尔酮或异甘草素中的应用，半乳糖诱导发酵所得菌株后，用乙酸乙酯提取发酵液，经LC-MS检测，可检测到异甘草素。

[0022] 本发明还涉及上文所述PAL，C4H，4CL，CHS或CHR基因在酿酒酵母发酵中的应用，具体可以应用于发酵工程合成异甘草素及其他黄酮类生物合成中间体的制备。进一步，所述的其他黄酮类生物合成中间体为肉桂酸，对香豆酸，对香豆酰辅酶A和柚皮素查尔酮。

[0023] 利用本发明可以通过生物合成技术来生成异甘草素及黄酮类生物合成中间体肉桂酸，对香豆酸，对香豆酰辅酶A和柚皮素查尔酮，具有很好的应用前景。

[0024] 本发明还提供了本发明所述苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羟化酶、香豆酰-CoA连接酶、查耳酮合成酶和查尔酮还原酶或编码本发明所述苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羟化酶、香豆酰-CoA连接酶、查耳酮合成酶和查尔酮还原酶基因，在含有黄酮类化学成分的植物育种中的运用。运用本发明所述苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羟化酶、香豆酰-CoA连接酶、查耳酮合成酶和查尔酮还原酶、或其编码基因，通过将其运用到植物细胞中，可改善植物体内黄酮的含量。

附图说明

[0025] 图1为不同基因编码蛋白催化产物分析图。EIC(extracted ion chromatogram)即提取离子流图，图中m/z 164、147、163、271和255分别为苯丙氨酸、肉桂酸、对香豆酸、柚皮素查尔酮和异甘草素[M-H]-的核质比。

[0026] 图2为重组酵母菌WM1、WM2-1及WM2-2发酵产物分析图。图2A中m/z 163和255分别为对香豆酸和异甘草素[M-H]-的核质比。

[0027] 图3为重组酵母菌WM3、WM4及WM5发酵产物分析图。图中m/z 163和255分别为对香豆酸和异甘草素[M-H]-的核质比。

具体实施方式

[0028] 以下通过优选实施例并结合附图具体说明本发明的各个方面和特征，本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明，而不是限制本发明的范围。在不背离权利要求书范围的条件下，本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。例如，将实施例中所实用表达载体和宿主菌替换为本领域中常用的其它表达载体和宿主菌，是本领域的普通技术人员所能够理解并实现的。

[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0030] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0031] 实施例1乌拉尔甘草中异甘草素生物合成途径酶基因的克隆

[0032] 1.引物设计

[0033] 根据乌拉尔甘草转录组数据注释筛选得到基因全长序列片段，设计上游和下游克隆引物，引物序列如下：

[0034]

[0035] 2.PCR扩增

[0036] 利用QuantScript RT Kit(天根生化科技有限公司，北京，中国)将乌拉尔甘草RNA反转录成cDNA。

[0037] 以cDNA为模板，进行PCR扩增。

[0038] 扩增体系为：2×KAPA HiFi Hotstart ReadyMix(Kapa Biosystems，Wilmington，USA)25μL，引物P1和P2各1.5μL，模板2μL，双蒸水补足50μL。反应条件：98℃预变性3min，98℃20s，62℃退火15s，72℃延伸1.5min，35个循环后72℃延伸5min，4℃保存。

[0039] 测序结果表明，PCR扩增产物的序列分别如SEQ ID No.1、3、5、7和9所示，将序列1、3、5、7和9所示的基因分别命名为PAL,C4H,4CL,CHS和CHR，其编码的蛋白分别命名为PAL,C4H,4CL,CHS和CHR，对应蛋白的氨基酸序列分别为SEQ ID No.2、4、6、8和10所示。

[0040] 在以下的实施例中，基因PAL,C4H,4CL,CHS和CHR和蛋白PAL,C4H,4CL,CHS和CHR，都是与上对应的核酸或氨基酸序列相同。

[0041] 实施例2 PAL,CHS和CHR基因的原核表达及体外酶促反应

[0042] 1、原核表达

[0043] PAL,CHS和CHR分别利用EasyGeno Assembly Cloning kit(天根生化科技有限公司，北京，中国)插入pET-32a(+)的KpnI和XhoI之间，并转入E.coli BL21(DE3)中。转化子用含100mg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选并挑取单克隆测序验证。重组表达细胞在200mL含100mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.6-1.0，用0.2mM的IPTG在16℃诱导10h。5000rpm，4℃离心收集菌体。3mL PBS buffer(pH 8.0)重悬菌体，冰浴超声破碎细菌，离心收集上清。重组蛋白用(康为世纪生物科技有限公司，北京，中国)纯化，用Bradford方法检测浓度。

[0044] 1.体外酶促反应

[0045] 1mL体外酶促反应体系各自包括：

[0046] 重组蛋白PAL约50ng/μL(10mM PBS，pH＝8.0)，二硫苏糖醇(DTT)1mM，底物苯丙氨酸1mM；

[0047] 重组蛋白CHS约50ng/μL(10mM PBS，pH＝8.0)，DTT 1mM，底物1mM(为摩尔质量比为1:3的香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A)；

[0048] 重组蛋白CHS和CHR约50ng/μL(10mM PBS，pH＝8.0)，DTT 1mM，底物1mM(为摩尔质量比为1:3的香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A)；

[0049] 重组蛋白CHS和CHR约50ng/μL(10mM PBS，pH＝8.0)，DTT 1mM，底物1mM(为摩尔质量比为1:3的香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A)，以及，1mM的NADPH；

[0050] 各自体系均在30℃孵育12h，加入200μL甲醇终止反应。催化产物12000g离心，上清过0.22μm PTFE滤膜，用HPLC-MS检测。结果如图1A和图1D。与空载对照相比，以苯丙氨酸为底物的PAL1重组蛋白体外酶促体系中产生肉桂酸(图1A)，因此认定PAL1具有催化苯丙氨酸生成肉桂酸的活性。

[0051] 在以摩尔质量比为1:3的香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物的体外酶促体系中，只加入CHS进行孵育时会产生柚皮素查尔酮；同时加入等量CHS、CHR重组蛋白以及NADPH时，除了柚皮素查尔酮外还能检测到异甘草素的产生(图1D)；确定CHS、CHR的查耳酮合成酶和查尔酮还原酶活性。

[0052] 然而，同时加入等量CHS、CHR重组蛋白，但底物中不加入NADPH时，未能检测到异甘草素的产生。

[0053] 实施例3 C4H和4CL基因的酵母表达及表征

[0054] 酵母表达载体构建，利用EasyGeno Assembly Cloning kit(天根生化科技有限公司，北京，中国)，将C4H或CHS分别插入酵母表达载体pESC-His(安捷伦科技有限公司，圣克拉拉市，美国)(或者也可以分别插入pESC-Leu(安捷伦科技有限公司，圣克拉拉市，美国))的SpeI和NotI位点之间，4CL插入已连接了CHS的重组载体的NheI和BamHI位点之间。重组质粒利用酵母转化试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，USA)转入宿主菌WAT11，转化子在相应的缺陷培养基(SC-His或-Leu，2％葡萄糖和2％琼脂)上30℃筛选培养4天。阳性克隆于对应的液体缺陷培养基(2％葡萄糖)中，30℃震荡至OD600约0.8。用2％的半乳糖替换葡萄糖的诱导培养基，30℃，220rpm诱导表达6h后，加入20μM肉桂酸或对香豆酸继续培养12h。培养液用等体积乙酸乙酯提取三次，提取物挥干溶剂后，用甲醇复溶，过0.22μm PTFE滤膜，HPLC-MS负离子模式下检测产物。结果如图1B和图1C。以肉桂酸饲喂包含C4H的重组酵母并用半乳糖诱导表达后，能在培养液中检测到对香豆酸(图1B)，说明C4H能催化肉桂酸生成对香豆酸。因为4CL催化产物不稳定，将4CL与CHS利用双元表达载体pESC-Leu在WAT11中共表达，用对香豆酸进行饲喂，在培养液提取物中也能检测到柚皮素查尔酮(图1C)，说明
4CL能利用酵母内源的辅酶A结合对香豆酸生成香豆酰辅酶A，为CHS合成查尔酮提供底物。

[0055] 实施例4产异甘草素的酵母工程菌的构建

[0056] 利用EasyGeno Assembly Cloning kit(天根生化科技有限公司，北京，中国)分别：

[0057] (1)将基因PAL插入双元酵母表达载体pESC-His的启动子GAL1下游，基因C4H插入双元酵母表达载体pESC-His的启动子GAL10下游，得到质粒YM1(pHIS-GAL1PAL-GAL10C4H)；

[0058] (2)将基因4CL插入双元酵母表达载体pESC-Leu的启动子GAL1下游，融合基因CHS::CHR插入双元酵母表达载体pESC-Leu的启动子GAL10下游(基因CHS::CHR为将CHS去除终止密码子TGA后3’端通过linker序列GGTGGTGGTTCT连接CHR 5’端形成的融合基因(SEQ ID NO：21))，得到质粒pYM2(pLEU-GAL14CL-GAL10CHS::CHR)；

[0059] (3)将融合基因CHS::CHR插入双元酵母表达载体pESC-TrpGAL10启动子的下游，得到质粒pYM3(pTRP-GAL10CHS::CHR)。

[0060] (4)将基因CHS插入双元酵母表达载体pESC-His的启动子GAL1下游，基因CHR插入双元酵母表达载体pESC-His的启动子GAL10下游，得到质粒pYM4(pHIS-GAL1CHS-GAL10CHR)[0061] 利用酵母转化试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，USA)分别将：

[0062] (1)重组表达载体pYM1转入到酵母工程菌WAT11中，得到转化子1；

[0063] (2)重组表达载体pYM1和pYM2转入到酵母工程菌WAT11中，得到转化子2；

[0064] (3)重组表达载体pYM1、pYM2和pYM3转入到酵母工程菌WAT11中，得到转化子3；

[0065] (4)重组表达载体pYM2转入到酵母工程菌WAT11中，得到转化子4；

[0066] (5)重组表达载体pYM3转入到酵母工程菌WAT11中，得到转化子5；

[0067] (6)重组表达载体pYM4转入到酵母工程菌WAT11中，得到转化子6；

[0068] 各转化子根据载体标签在相应的缺陷培养基(SC-His(转化子1、转化子6)、SC-His-Lue(转化子2)、SC-His-Lue-Trp(转化子3)、SC-Leu(转化子4)或SC-Trp(转化子5)，2％葡萄糖和2％琼脂)上30℃筛选培养4天。获得的阳性克隆重组酵母菌株分别命名为WM1(包含pYM1)、WM2-1(包含pYM1和pYM2)、WM2-2(包含pYM1、pYM2和pYM3)、WM3(包含pYM2)、WM4(包含pYM3)和WM5(包含pYM4)。

[0069] 重组酵母分别于对应液体缺陷培养基(SC-His(WM1)，SC-His-Lue(WM2-1)或SC-His-Lue-Trp(WM2-2)，2％葡萄糖)中，30℃震荡至OD600约0.8。用2％的半乳糖替换葡萄糖的诱导培养基，30℃，220rpm诱导表达12-48h。培养液用等体积乙酸乙酯提取三次，提取物挥干溶剂后，用甲醇复溶，过0.22μm PTFE滤膜，HPLC-MS负离子模式下检测产物。结果如图2。重组酵母WM1在半乳糖诱导发酵下能产生对香豆酸(图2A)，培养36h左右检测对香豆酸产量在7.59umol/L(图2B)。向WM1中转入pYM2时，在发酵液里能检测到少量的异甘草素(图2,WM2-1)。而过表达CHS::CHR能使WM2-2的异甘草素产量与WM2-1相比上升18.2倍(图2B)。

[0070] 重组酵母菌WM3、WM4和WM5依次对应液体缺陷培养基(SC-Leu、SC-Trp或SC-His，2％葡萄糖)中，30℃震荡至OD600约0.8。用2％的半乳糖替换葡萄糖的诱导培养基，30℃，
220rpm诱导表达6h后，加入20μM对香豆酸继续培养WM3,加入20μM香豆酰辅酶A继续培养WM4和WM5。12h后将培养液用等体积乙酸乙酯提取三次，提取物挥干溶剂后，用甲醇复溶，过
0.22μm PTFE滤膜，HPLC-MS负离子模式下检测产物。结果表明，用对香豆酸(WM3)或香豆酰辅酶A(WM4)进行饲喂，在培养液提取物中也能检测到异甘草素，而用香豆酰辅酶A饲喂WM5不能获得异甘草素(图3)。

[0071] 上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。