负载光敏药物的人多能干细胞外泌体及制备与用途

摘要

本发明涉及负载光敏药物的人多能干细胞外泌体及制备与用途，所述光敏药物为8‑甲氧补骨脂素、5‑甲氧补骨脂素、甲氧苄胺嘧啶或中药光敏剂。与现有技术相比，本发明利用胚胎干细胞或诱导人多能干细胞来源的外泌体作为包括8‑甲氧补骨脂素在内的光敏药物载体，构建功能强大的促进皮肤色素分泌并改善皮肤功能的纳米药物递送系统，用于白癜风、银屑病、牛皮癣等难治性皮肤疾病的治疗。

权利要求

1.负载光敏药物的人多能干细胞外泌体在制备药物中的应用，其特征在于，所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体包括人多能干细胞外泌体及包裹在人多能干细胞外泌体内的光敏药物，所述光敏药物的包裹浓度为5.5 μg/mL，所述光敏药物为8-甲氧补骨脂素；

所述制备成的药物为：

（1）促进皮肤黑色素细胞增殖、迁移及黑色素分泌的药物；

（2）治疗白癜风的药物。

2.根据权利要求1所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体在制备药物中的应用，其特征在于，所述人多能干细胞外泌体为人胚胎干细胞来源的外泌体或人诱导多能干细胞来源的外泌体。

3.如权利要求1所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体在制备药物中的应用，其特征在于，通过孵育、电转、挤压、超声、冻融或皂素处理的方法将光敏药物包裹入人多能干细胞外泌体。

4.根据权利要求3所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体在制备药物中的应用，其特征在于，所述人多能干细胞外泌体是通过以下方法获得的：采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养人ESCs 或人源iPSCs，收集培养基，收集纯化培养基中的外泌体，即为人多能干细胞外泌体。

5.根据权利要求1所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体在制备药物中的应用，其特征在于，所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体以制剂形式存在，所述制剂选择以下形式中的任一种：A、悬浮剂：将所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；

B、缓释外泌体的复合物：由所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；

C、以负载光敏药物的人多能干细胞外泌体作为添加剂：以所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。

说明书

负载光敏药物的人多能干细胞外泌体及制备与用途

技术领域

[0001] 本发明属于细胞生物学、分子生物学及药物研发技术领域，尤其是涉及负载光敏药物的人多能干细胞外泌体及其制备方法与用途。

背景技术

[0002] 外泌体是一类由细胞分泌的直径约30-150nm的细胞外囊泡，其携带供体细胞来源的多种生物活性物质包括DNA、RNA、蛋白等进入效应细胞，有效调控机体细胞信号转导。研究表明，干细胞分泌的外泌体通过向效应细胞传递干细胞来源的生物活性物质，生理性修复或者清除机体损伤、病变和衰老的细胞，发挥抗炎、调节免疫、促进效应细胞增殖、迁移和分化、促进血管新生等功能。

[0003] 胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs)与诱导人多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。ESCs和iPSCs具有多能性(Pluripotency)，即ESCs和iPSCs可分化成三胚层的任意细胞，具有发育成多种组织的能力，参与部分组织的形成。而成体干细胞仅具备多种分化潜能(multipotency)，即只能分化成为有限的几种细胞。因而ESCs和iPSCs与组织成体干细胞相比在促进组织器官再生更新方面功能更强大。ESCs或iPSCs分泌的外泌体可能包裹了与多能性相关的因子、转录因子、mRNA、microRNA等，表现出比成体组织干细胞外泌体更强大的功能。人多能干细胞产生的外泌体，可以抑制细胞衰老过程，改变靶细胞表观遗传特征，使效应细胞逆转至低分化状态，从而促进修复组织损伤。同时人多能干细胞来源的外泌体，也可以起到与组织干细胞类似的作用，如修复血管、抑制炎症、促进组织干细胞增殖分化等功能。

[0004] 外泌体是细胞分泌的天然纳米载体，外泌体作为药物的纳米载体得到了广泛的关注与研究。与人工合成的纳米载体相比，外泌体在药物释放领域的应用具有独特的优势。外泌体的组成成分均来源于细胞，避免了人工合成的脂质体、高分子、纳米硅等材料的使用带来的细胞毒性、生物相容性等问题。由于外泌体继承了细胞的磷脂、表面蛋白等物质，具有丰富的生理功能，可以提高药物的传递效率，实现药物的特异性递送、跨生物屏障传递以及免疫豁免等功能。外泌体自身携带的蛋白、基因等物质具有细胞调控能力，可以对特定的疾病起到治疗作用。

[0005] 目前，多种细胞外泌体构建的纳米药物递送系统已经用于疾病治疗的探索。Wood课题组最先利用未成熟的树突状细胞(immature dendritic cells,iDC)来源的外泌体负载siRNA治疗阿尔兹海默症。iDC分泌的外泌体表面缺乏T细胞激活蛋白(例如MHC-I，MHC-II，CD86)，具有免疫惰性。他们通过基因转染的方法，在外泌体表面蛋白Lamp2b上修饰乙酰胆碱受体识别多肽片段RVG，进而赋予iDC外泌体定位脑部神经细胞的能力；随后，利用电转的方法，将BACE-1的siRNA导入到iDC外泌体中，通过小鼠动物模型，验证了这些载药外泌体治疗阿尔兹海默症的潜力。然而，iDC细胞提取过程繁琐，细胞数量有限，成本高昂，难以产业化生产。同样，肿瘤细胞来源的外泌体也被用于药物递送系统的构建。虽然肿瘤细胞可以无限扩增，制备大量的外泌体，但是它们潜在的安全性风险限制其在临床的使用。最近，研究人员报道了利用牛奶来源外泌体构建的纳米药物递送系统。与细胞来源的外泌体相比，牛奶来源的外泌体提取简便、成本低，实现可以大规模制备满足临床需求。但是，由于牛奶外泌体中含有大量的非人源的基因与蛋白质等物质，其通过静脉全身注射的安全性仍有待进一步确认，而且该研究的重点主要集中于外泌体的药物载体功能，并没有充分发挥外泌体自身所携带的物质对疾病与损伤的治疗潜力。

发明内容

[0006] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种负载光敏药物的人多能干细胞外泌体及其制备方法与用途。

[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

[0008] 本发明第一方面：

[0009] 提供负载光敏药物的人多能干细胞外泌体，包括人多能干细胞外泌体及包裹在人多能干细胞外泌体内的光敏药物。

[0010] 在本发明的一个实施方式中，所述人多能干细胞外泌体为人胚胎干细胞来源的外泌体或人诱导多能干细胞来源的外泌体。

[0011] 在本发明的一个实施方式中，所述光敏药物为8-甲氧补骨脂素(8-MOP)、5-甲氧补骨脂素(5-MOP)、甲氧苄胺嘧啶(TMP)或中药光敏剂。

[0012] 在本发明的一个实施方式中，所述光敏药物的包裹浓度为1-20μg/mL。

[0013] 本发明第二方面：

[0014] 提供所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体的制备方法，通过孵育、电转、挤压、超声、冻融或皂素处理的方法将一定剂量的光敏药物包裹入人多能干细胞外泌体。

[0015] 在本发明的一个实施方式中，孵育的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液和药物溶液混合，置于一定温度下孵育一定时间。随后将上述溶液置于一定截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×106/mL–1×1012/mL，优选为1×1010/mL；孵育温度的范围为4℃–50℃，优选为37℃；孵育时间范围为1h–48h，优选为4h；超滤管的截留分子量范围为
10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。

[0016] 在本发明的一个实施方式中，冻融的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液和药物溶液混合，置于一定温度的冰箱中进行冷冻。随后解冻，再冷冻，如此循环一定次数。最后，将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×106/mL–1×12 10
10 /mL，优选为1×10 /mL；冷冻温度范围为-10℃--200℃,，优选为-80℃；循环次数为1–
20次，优选为3次；超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。

[0017] 在本发明的一个实施方式中，电转的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液与药物溶液和电转液混合，置于电转仪中，在一定条件下电转一定时间。随后，将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×106/mL–1×1012/mL，优选为1×1010/mL；电转液为KCl、K3PO4和OptiPrepTM细胞梯度离心液的混合溶液，其中KCl的浓度范围为1mM–1M，优选为25mM，K3PO4的浓度范围为0.01mM-1M，优选为1.15mM，OptiPrepTM细胞梯度离心液的体积分数范围为80％-0.1％，优选为21％；电转参数中电压的范围为10KV–
0.1V，优选为400V，电容的范围为0.1–1000F，优选为150F；电转时间范围为0.1s–1min，优选为10s；超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。

[0018] 在本发明的一个实施方式中，超声的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液与药物溶液混合，利用针式超声仪在一定条件下对上述混合溶液超声一定时间。随后，将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×106/mL–1×1012/mL，优选为1×1010/mL；超声条件中，电压的范围为1KV–1V，优选为500V，频率的范围为1Hz–20KHz，优选为2KHz，循环次数的范围为1–100次，优选为6次，循环中超声输出时间为1s–60s，优选为5s，间隔时间的范围为1s–300s，优选为5s；超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。

[0019] 在本发明的一个实施方式中，通过常规的超滤、超速离心或者脱盐柱等手段将包裹药物光敏药物的外泌体与游离的药物光敏药物分离。

[0020] 在本发明的一个实施方式中，通过高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)对人多能干细胞外泌体负载光敏药物的效率进行检测分析，最终获得人多能干细胞外泌体负载光敏药物的纳米药物递送体系。

[0021] 在本发明的一个实施方式中，所述人多能干细胞外泌体是通过以下方法获得的：

[0022] 采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养人ESCs或iPSCs，收集培养基，收集纯化培养基中的外泌体，即为人多能干细胞外泌体。

[0023] 在本发明的一个实施方式中，采用旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体。

[0024] 旋转超滤结合低温超速离心方法主要步骤是：将一定容积的培养基于4℃400g离心10min，去除游离细胞，得到的上清移入另一管中，4℃15000g 20min，去除细胞碎片，获得的上清液倒入millipore超滤装置中，用PBS洗脱收集滤膜(100KD)上的浓缩液体，即再次加入PBS，经millipore超滤装置再次超滤，得到的浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm3)，4℃100800g离心210分钟，收集底部蔗糖/重水密度垫，加入两倍体积PBS，转移至可截留100KD分子的超滤细心管中，4℃3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终按后续实验要求定容至一定体积，得到Exosomes悬液，分装保存至-80℃。

[0025] 在本发明的一个实施方式中，无血清培养体系选择市售的型号为TeSRTM-E8TM或mTeSR1或mTeSR2的培养基。

[0026] 在本发明的一个实施方式中，收集外泌体后，通过电镜、粒径分析、免疫印迹等方法对外泌体的特性进行鉴定，结果符合外泌体特征：直径范围50-150nm，透射电子显微镜下呈双层膜囊状结构，其膜结构表面含有CD9，CD63等标志物。

[0027] 本发明第三方面：

[0028] 提供人多能干细胞外泌体以及所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体作为制备皮肤病用药物的应用。

[0029] 所述皮肤病包括白癜风、银屑病、蕈样肉芽肿、皮肤假性淋巴瘤、硬皮病、皮肤肥大细胞增生症、牛皮癣、特应性皮炎、扁平苔藓等皮肤疾病。

[0030] 在本发明的一个实施方式中，应用负载了8-甲氧补骨脂素的人多能干细胞外泌体治疗白癜风：8-甲氧补骨脂素(8-methoxypsoralen,8-MOP)是临床治疗白癜风和银屑病的药物，其作用机理可能与影响角质细胞酪氨酸酶活性，激活酪氨酸酶促进黑素合成作用及促进黑素细胞的增殖、移行有关，8-甲氧补骨脂素还可抑制表皮细胞DNA合成、细胞分裂和表皮更替。补骨脂素为光敏性化合物，需要与长波紫外线合用。用药后作用于受损细胞邻近尚未完全破坏或正常的黑素细胞，使酪氨酸酶活性增加，促进黑素合成。人多能干细胞外泌体具有抗炎、免疫调节、促进细胞增殖与迁移等功能，且外泌体可通过皮肤屏障直接进入皮肤组织细胞内，因而可以将8-甲氧补骨脂素运载到皮肤组织细胞中。人多能干细胞外泌体与8-甲氧补骨脂素双重功能的发挥，可以大大提高对白癜风、银屑病、蕈样肉芽肿、皮肤假性淋巴瘤、硬皮病、皮肤肥大细胞增生症、牛皮癣、特应性皮炎、扁平苔藓等皮肤疾病的治疗效果，具有很好的转化应用前景。

[0031] 人多能干细胞外泌体除了负载8-MOP外，也可负载5-MOP、TMP或中药光敏剂等用于皮肤相关疾病的治疗，同样具有很好的增强效果。

[0032] 在本发明的一个实施方式中，以一定剂量的负载了8-甲氧补骨脂素的人多能干细胞外泌体(ESC-exo-MOP)悬液涂抹于患处，4-8小时后，以紫外线(波长为200-400nm)照射10-30分钟，每周治疗1-2次，持续给药治疗1-2个月。

[0033] 本发明第四方法：

[0034] 提供基于所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体的制剂，所述制剂选择以下形式中的任一种：

[0035] A、悬浮剂：将所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；

[0036] B、缓释外泌体的复合物：由所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；

[0037] C、以负载光敏药物的人多能干细胞外泌体作为添加剂：以所述负载光敏药物的人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。

[0038] 在本发明的一个实施方式中，悬浮剂的溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液或基础细胞培养基。所述悬浮剂可通过口服、静脉注射，或直接在组织损伤部位注射(如皮下注射等)或喷雾等形式进行使用。

[0039] 在本发明的一个实施方式中，所述缓释外泌体的复合物采用植入组织损伤部位的形式使用。

[0040] 在本发明的一个实施方式中，含有负载光敏药物的人多能干细胞外泌体的添加剂，可以制备多种制剂，如滴剂、软膏剂、乳剂、膜剂、涂抹剂、凝胶剂、糊剂、喷雾剂、气雾剂及贴剂等等。

[0041] 外泌体是细胞分泌的天然纳米载体，与人工合成的纳米载体相比，外泌体在药物释放领域的应用具有独特的优势。外泌体的组成成分均来源于细胞，避免了人工合成的脂质体、高分子、纳米硅等材料的使用带来的细胞毒性、生物相容性等问题。人多能干细胞外泌体具有抗炎、免疫调节、促进细胞增殖与迁移，清除衰老细胞等功能，且外泌体可通过粘膜屏障或皮肤屏障或血脑屏障直接进入组织细胞内。

[0042] 利用干细胞外泌体作为纳米载体既可以实现药物的有效递送，同时又可以充分发挥干细胞外泌体的功能，起到更好的疾病治疗效果。在众多种类的干细胞中，多能干细胞(胚胎干细胞、诱导多能干细胞)具有强大的增殖扩增能力，可以实现产业化生产以满足治疗需求。

[0043] 本发明利用胚胎干细胞或诱导人多能干细胞来源的外泌体作为包括8-甲氧补骨脂素在内的光敏药物载体，构建功能强大的促进皮肤色素分泌并改善皮肤功能的纳米药物递送系统，用于白癜风、银屑病、牛皮癣等难治性皮肤疾病的治疗。

附图说明

[0044] 图1：人多能干细胞分泌的外泌体(ES-exo)粒径分布图。

[0045] 图2：外泌体标志物鉴定。

[0046] 图3：8-MOP的HPLC标准定量曲线。

[0047] 图4：ESC-Exos包裹8-MOP的HPLC检测结果。

[0048] 图5：ESC-Exos显著促进皮肤黑色素细胞增殖(CCK8检测结果)。

[0049] *示ESC-Exos与对照组相比差异有显著意义(P<0.05)

[0050] 图6：ESC-Exos促进皮肤黑色素细胞迁移(划痕实验结果)。

[0051] 经ESC-Exos作用24小时的黑色素细胞迁移明显强于对照组。

[0052] 图7：ESC-exo-MOP对白癜风表皮结构及黑色素分布的影响。

[0053] a.正常豚鼠皮肤；b.模型组；c.ESC-exo-MOP治疗组；d.ESC-exo治疗组；e.单纯紫外线照射组。

具体实施方式

[0054] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

[0055] 实施例1：

[0056] 人胚胎干细胞(ESCs)的培养和外泌体的提取与鉴定

[0057] 在培养皿中铺一层胚胎干细胞基质胶(ESC-Qualified BD Matrigel,BDSparks,MD,USA)，将ESCs移入该培养皿，加入mTeSR1无血清培养基(StemCell Vancouver,BC,Canada)，在温箱内(37℃，5％CO2，饱和湿度)培
养，收集每天更换的培养基。将培养基通过0.22微米孔径滤膜过滤及4℃10000g离心30分钟，去除细胞碎片；采用100KD分子量的超滤管，离心(3500g，15min)截留浓缩上清中的外泌体，得到外泌体浓缩液；将浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm3)，4℃100000g离心210分钟，收集底部5ml蔗糖/重水密度垫，加入PBS稀释，转移至可截留100KD分子量的超滤离心管中，4℃3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终按后续实验要求定容至一定体积，得到外泌体悬液ES-exo，分装保存至-80℃。

[0058] ES-exo的形态通过透射电镜(TEM)观察。将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上，将20μL样本滴加到铜网上，室温静置3分钟后，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加3％磷钨酸溶液30μL对样本进行负染(室温，5分钟)。用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态。

[0059] ES-exo的粒径和浓度通过纳米粒子分析系统(iZon qNano,New Zealand)进行检测，按照操作说明书调节仪器各项参数：将Nanopore(NP100)安装到加样孔下方，调节Stretch至43cm，向加样孔内加入40μL PBS，使电流稳定在100-120nA范围内。吸去PBS，加入40μL 1：100稀释的CPC100标准品(粒径70nm)，测量粒子数和浓度，通过软件得到标准曲线。
吸去标准品，PBS洗3次，加入40μL 1:1000稀释的待测样品，测定粒子数和浓度，重复测量3次。通过软件进行数据分析，得出分析报告。结果显示粒径范围为50-150nm，见图1。

[0060] 通过western blot检测ES-exo特异性表面标志物CD9和CD63的表达。具体步骤：外泌体总蛋白提取，通过BCA蛋白分析试剂盒检测样本蛋白浓度，制胶配制10％的分离胶，电泳，转膜，封闭及抗体孵育，化学发光成像分析仪观察条带显影情况。结果所提取的外泌体均表达特异性表面标志物CD9和CD63。见图2。

[0061] 实施例2

[0062] 人诱导人多能干细胞(iPSCs)的培养和外泌体的提取与鉴定

[0063] 在培养皿中铺一层胚胎干细胞基质胶(ESC-Qualified BD Matrigel,BDSparks,MD,USA)，将iPSC移入该培养皿，加入mTeSR1无血清培养基(StemCell Vancouver,BC,Canada)，在温箱内(37℃，5％CO2，饱和湿度)培
养，收集每天更换的培养基。将培养基通过0.22微米孔径滤膜过滤及4℃10000g离心30分钟，去除细胞碎片；采用100KD分子量的超滤管，离心(3500g，15min)截留浓缩上清中的外泌体，得到外泌体浓缩液；将浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm3)，4℃100000g离心210分钟，收集底部5ml蔗糖/重水密度垫，加入PBS稀释，转移至可截留100KD分子量的超滤离心管中，4℃3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终按后续实验要求以PBS定容至一定体积，得到外泌体悬液iPS-exo，分装保存至-80℃。

[0064] iPS-exo的形态通过透射电镜(TEM)观察。将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上，将20μL样本滴加到铜网上，室温静置3分钟后，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加3％磷钨酸溶液30μL对样本进行负染(室温，5分钟)。用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态。

[0065] iPS-exo的粒径和浓度通过纳米粒子分析系统(iZon qNano,New Zealand)进行检测，按照操作说明书调节仪器各项参数：将Nanopore(NP100)安装到加样孔下方，调节Stretch至43cm，向加样孔内加入40μL PBS，使电流稳定在100-120nA范围内。吸去PBS，加入40μL 1：100稀释的CPC100标准品(粒径70nm)，测量粒子数和浓度，通过软件得到标准曲线。
吸去标准品，PBS洗3次，加入40μL 1:1000稀释的待测样品，测定粒子数和浓度，重复测量3次。通过软件进行数据分析，得出分析报告。

[0066] 通过western blot检测iPS-exo特异性表面标志物CD9和CD63的表达。具体步骤：外泌体总蛋白提取，通过BCA蛋白分析试剂盒检测样本蛋白浓度，制胶配制10％的分离胶，电泳，转膜，封闭及抗体孵育，化学发光成像分析仪观察条带显影情况。结果所提取的外泌体均表达特异性表面标志物CD9和CD63。

[0067] 实施例3

[0068] 人ESC来源外泌体(ESC-Exos)通过冻融法负载8-甲氧补骨脂素(8-MOP)[0069] ESC-Exos溶液来自实施例1。

[0070] 8-MOP的定量标准曲线的测定：准确称取1mg/mL的8-MOP粉末，溶解于1mL乙腈中。利用乙腈对上述溶液进行稀释，配置成100、70、50、20、10、5μg/mL的8-MOP标准溶液，随后进行HPLC定量标准曲线测定，色谱条件如下：

[0071] 色谱柱：Zorbax Extend C-18，150*4.6μm，5–micro

[0072] 流动相：乙腈：水＝55：45

[0073] 流速：1mL/min

[0074] 柱温：室温

[0075] 检测波长：215nm

[0076] 获得相应的实验结果后，将色谱峰的峰面积(PA)作为8-MOP浓度(C，μg/mL)的函数作图(如附图3)，得到如下该色谱分离条件下8-MOP的定量标准曲线：

[0077] PA＝62.89C+6.92，R2＝0.9996

[0078] 8-MOP的包裹：配制50μg/mL的8-MOP(TET)的生理盐水溶液。取ESC-Exos溶液100μL10
(浓度1.0*10 /mL)，向其中加入1mL的8-MOP溶液。随后，将该溶液放入-80℃的冰箱中冷冻，
30min后取出融化，如此循环3次。然后，利用5mL的PBS对该溶液进行两次超滤洗涤。最后，浓缩到200μL，并取50μL该溶液，利用200μL的乙腈进行稀释，12000rad/min下离心，除去蛋白沉淀，上清液在标准曲线的测定条件下，进行HPLC检测。检测结果如附图4所示，8-MOP的包裹浓度为5.5μg/mL。

[0079] 实施例4

[0080] 人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)促进皮肤黑色素细胞增殖、迁移及黑色素分泌的研究

[0081] 采用DispaseⅡ和胰酶两步消化分离培养人皮肤黑色素细胞，取传代培养第三代的细胞进行实验。通过CCK8方法观察ESC-exo及ESC-exo-MOP对黑色素细胞增殖的影响，通过划痕实验观察ESC-exo及ESC-exo-MOP对黑色素细胞迁移的影响，通过检测多巴胺分析ESC-exo及ESC-exo-MOP对黑色素细胞分泌黑色素的影响。实验结果显示，ESC-exo及ESC-exo-MOP均能显著促进黑色素细胞增殖，见图5，ESC-exo及ESC-exo-MOP均能显著促进黑色素细胞迁移，见图6，进一步检测培养基中的多巴胺含量也ESC-exo及ESC-exo-MOP均能显著促进体外培养的黑色素细胞产生黑色素。

[0082] 实施例5

[0083] 应用负载了8-甲氧补骨脂素的人多能干细胞外泌体(ESC-exo-MOP)治疗白癜风[0084] 采用黑色豚鼠40只，以硫化钠对背部进行脱毛处理，在脱毛区涂5％氢醌，每天2次，连续涂50天，建立白癜风动物模型，在涂抹氢醌2周后分组进行干预：模型组(仅涂抹氢醌)、ESC-exo-MOP治疗组(涂抹氢醌后1小时再涂抹ESC-exo-MOP 6小时后行300nm紫外线照射20分钟)、ESC-exo治疗组(涂抹氢醌后1小时再涂抹ESC-exo 6小时后行300nm紫外线照射20分钟)、单纯紫外线照射组(涂抹氢醌后1小时再涂抹生理盐水6小时后行300nm紫外线照射20分钟)。通过皮肤肉眼观察、皮肤病理组织学和黑色素分布等评估ESC-exo及ESC-exo-MOP的治疗效果。

[0085] 实验结果显示，模型组皮肤出现范围大小不等的白斑和脱屑，模型成功率约80％；各干预组也有白斑和脱屑，但程度明显减轻，ESC-exo-MOP治疗组皮肤色素沉着明显，有效率达86％；ESC-exo治疗组皮肤色素沉着也较明显，有效率达70％；单纯紫外线照射组有少量色素沉着，有效率为25％。病理检察结果显示，正常组皮肤表皮棘层及基底层细胞均含黑色素颗粒；模型组皮肤表皮棘层明显增厚，角质层明显增生，基底层细胞及棘层细胞偶见黑色素，毛囊内黑色素明显减少；ESC-exo和ESC-exo-MOP治疗组基底层细胞及棘层细胞中黑色素增加明显毛囊内黑色素明显增多；单纯紫外线照射组皮肤细胞中黑色素有一定程度增加，毛囊内黑色素略增多，见图7。

[0086] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。