一种基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针及其制备方法和应用

摘要

一种基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针及其制备方法和应用，该近红外荧光探针分子式为C35H32N3O6S2+，结构式如下：。该探针是以半花菁结构衍生物为母体进行相关的结构修饰，该探针能够与不同的响应物质作用后生成不同的荧光结构单元，荧光强度显著变化并伴随明显的颜色变化，可用于苯硫酚、硫氢根离子、亚硫酸根离子的裸眼检测，选取的干扰离子等对检测效果基本上无影响，实现了对苯硫酚、硫氢根、亚硫酸根的识别响应，该探针在三种不同的缓冲体系中分别对苯硫酚、硫化氢、亚硫酸根离子响应比较迅速，且检测限都比较低，具有良好的选择性和较高的灵敏度，在生物与环境样品中的苯硫酚、硫氢根、亚硫酸根的检测有良好的应用前景。

权利要求

1.一种基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针，其特征在于，该近红外荧光探针分子式为C35H32N3O6S2+，结构式如下：。

2.权利要求1所述基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针在化合物检测中应用，其特征在于，用于检测苯硫酚、硫氢根、亚硫酸根中一种或任意几种。

3.利用权利要求1所述基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针的化合物检测方法，其特征在于，所述化合物为苯硫酚、硫氢根、亚硫酸根中一种或任意几种；具体检测方法为：在近红外光谱区：

将待检样品溶于pH=7.4的DMSO/HEPES混合溶液中，对待检样品中苯硫酚进行检测；

将待检样品溶于pH=7.4的DMSO/Tris-HCl混合溶液中，对待检样品中硫氢根离子进行检测；

将待检样品溶于pH=7.4 DMSO/PB混合溶液中，对待检样品中亚硫酸根离子进行检测。

说明书

一种基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针及其制备方法

和应用

技术领域

[0001] 本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 随着社会的发展及环境保护的要求，对于不同离子和小分子物质的检测受到了越来越多科学家的关注，同时研究小分子在生物、化学和环境中的应用而备受关注。苯硫酚、硫氢根离子、亚硫酸根离子广泛用于农药，药品和各种工业产品的制备，硫氢根离子和亚硫酸根离子在人体生理水平上也扮演者重要的作用，故考虑到其高毒性、机体生理重要性及引起的环境问题，开发简单、快速、灵敏和能选择性区分苯硫酚、硫氢根离子、亚硫酸根离子的荧光探针，在环境保护、食品安全和生命科学中具有重要意义。在众多检测技术手段中,荧光探针具有操作简便、灵敏度高、选择性好、对生物样品损伤小以及可以直接在活细胞或组织中检测等优点,因而成为近年来研究的热点之一。在这些众多的检测方法中，荧光探针由于其特有的优点而成为研究人员关注的焦点。与可见光区域的荧光探针相比，已知近红外（NIR，650-900nm）荧光探针更适合生命系统，因为它们在近红外区域产生荧光，对活细胞的损害较小，效果更好组织穿透，以及生物系统中生物分子的背景自发荧光的最小干扰。发展能够有效检测特别是能够在生理水平条件下检测苯硫酚、硫氢根离子、亚硫酸根离子的分析方法是极其重要和有意义的。

[0003] 近年来，荧光分子探针技术由于具有灵敏度高、操作简单、成本低等特点，已经成为检测离子和小分子化合物的重要手段。荧光增强传感材料可减少检测错误，对复杂体系检测准确。半花菁结构衍生物作为开/关形式的荧光探针，具有合成简便，响应时间短等特点，在离子和小分子物质识别领域得到越来越广泛的重视。因此，我们提出一种基于半花菁结构衍生物的荧光探针及其制备方法。

发明内容

[0004] 本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针及其制备方法和应用，该探针具有良好的选择性和较高的灵敏度，可适用于待测样品中苯硫酚、硫氢根离子、亚硫酸根离子含量的荧光检测、目视定性。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0006] 一种基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针，该近红外荧光探针分子式为C35H32N3O6S2+，结构式如下所示：

[0007] 。

[0008] 上述基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针的制备方法，其包括以下步骤：

[0009] 1）七甲川花菁与化合物1反应得到化合物2；

[0010] 2）化合物2与2,4-二硝基氟苯反应得到目标产物基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针；

[0011] 其中，化合物1和化合物2的结构式分别如下所示：

[0012] 。

[0013] 进一步的，步骤1）具体为：在氮气保护下，将化合物1和K2CO3溶于乙腈中获得溶液a，将七甲川花菁溶于乙腈中获得溶液b，将溶液a和溶液b混合后于50℃加热反应10-15h，反应结束后，减压蒸除溶剂，并经硅胶柱色谱分离纯化，所得蓝绿色固体即为化合物2，其中，七甲川花菁、化合物1和K2CO3的摩尔比为1:（2.0~2.1）:（2.0~2.1）。

[0014] 步骤2）具体为：在氮气保护下，将化合物2和K2CO3溶于乙腈中获得溶液a，将2,4-二硝基氟苯溶于乙腈中获得溶液b，将溶液a和溶液b混合后于50℃加热反应5-15h，反应结束后，减压蒸除溶剂，并经硅胶柱色谱分离纯化，所得固体即为目标产物基于半花菁衍生物结构的近红外荧光探针，其中，所述2,4-二硝基氟苯、化合物2和的K2CO3的摩尔比为1:（2.5~2.6）:（3.0 3.1）。
~

[0015] 本发明还提供了上述基于半花菁结构衍生物在近红外区检测苯硫酚、硫氢根离子、亚硫酸根离子的应用，该探针用于近红外区环境体系中苯硫酚、硫氢根离子、亚硫酸根离子的含量而进行的荧光检测、目视定性检测。所述近红外荧光探针分别在DMSO/HEPES (v/v=5/5, pH=7.4)、DMSO/Tris-HCl (v/v=7/3, pH=7.4)、DMSO/PB (v/v=9/1, pH=7.4)混合溶液中分别对苯硫酚、硫氢跟离子、亚硫酸根离子进行检测。

[0016] 本发明中所使用的各种原料均为普通市售产品，或者通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法获得。

[0017] 该探针是以半花菁结构衍生物为母体进行相关的结构修饰，该探针能够与不同的响应物质作用后生成不同的荧光结构单元，荧光强度显著变化并伴随明显的颜色变化，将本发明测苯硫酚、硫化氢、亚硫酸根离子近红外荧光探针的分析性能与相关文献报道中报道的其它选择性荧光探针进行比较，结果表明：此近红外荧光探针效果很好。近红外激发和发射有效减少生物样品的光损伤并避免来自天然细胞物种的自身荧光。本发明通过1HNMR、13CNMR表征分析，该探针可以DMSO/HEPES (v/v=5/5, pH=7.4)、DMSO/Tris-HCl (v/v=7/3, pH=7.4)、DMSO/PB (v/v=9/1, pH=7.4)混合溶液中分别对苯硫酚、硫化氢、亚硫酸根离子快速响应。

[0018] 和现有技术相比，本发明的有益效果：

[0019] 该探针是以半花菁结构衍生物为母体进行相关的结构修饰，该探针能够与不同的响应物质作用后生成不同的荧光结构单元，荧光强度显著变化并伴随明显的颜色变化，可用于苯硫酚、硫氢根离子、亚硫酸根离子的裸眼检测，选取的干扰离子等对检测效果基本上无影响，实现了对苯硫酚、硫化氢、亚硫酸根离子的识别响应，该探针在三种不同的缓冲体系中分别对苯硫酚、硫化氢、亚硫酸根离子响应比较迅速，且检测限都比较低，具有良好的选择性和较高的灵敏度，在生物与环境样品中的苯硫酚、硫化氢、亚硫酸根离子的检测有良好的应用前景。

附图说明

[0020] 图1为本发明基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针的合成路线图；

[0021] 图2为本发明基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针的核磁氢谱；

[0022] 图3为本发明基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针的核磁碳谱；

[0023] 图4为加入苯硫酚到基于半花菁结构衍生物中测的近红外荧光探针（10 μM）后后紫外-可见吸收光谱随时间的变化趋势；插图是紫外灯下探针的颜色以及探针和苯硫酚反应完后的颜色变化；

[0024] 图5为加入苯硫酚到基于半花菁结构衍生物测的近红外荧光探针（10 μM）后后荧光光谱随时间的变化趋势；

[0025] 图6为本发明基于半花菁结构衍生物测的近红外荧光探针（10 μM）的溶液随苯硫酚浓度的增大而呈现的紫外-可见吸收光谱变化；

[0026] 图7为本发明基于半花菁结构衍生物测的近红外荧光探针（10 μM）的溶液随苯硫酚浓度的增大而呈现的荧光光谱变化；

[0027] 图8为本发明基于半花菁结构衍生物测的近红外荧光探针（10 μM）的溶液随不同离子的紫外-可见吸收光谱变化；

[0028] 图9为本发明基于半花菁结构衍生物测的近红外荧光探针（10 μM）的溶液随不同离子的荧光光谱变化；

[0029] 图10为加入硫氢化钠到基于半花菁结构衍生物测的近红外荧光探针（10 μM）后后紫外-可见吸收光谱随时间的变化趋势；插图是紫外灯下探针的颜色以及探针和硫氢化钠反应完后的颜色变化；

[0030] 图11为加入硫氢化钠到基于半花菁结构衍生物测的近红外荧光探针（10 μM）后后荧光光谱随时间的变化趋势；

[0031] 图12为本发明基于半花菁结构衍生物测的近红外荧光探针（10 μM）的溶液随硫氢化钠浓度的增大而呈现的紫外-可见吸收光谱变化；

[0032] 图13为本发明基于半花菁结构衍生物测的近红外荧光探针（10 μM）的溶液随硫氢化钠浓度的增大而呈现的荧光光谱变化；

[0033] 图14为本发明基于半花菁结构衍生物测的近红外荧光探针（10 μM）的溶液随不同离子的紫外-可见吸收光谱变化；

[0034] 图15为加入亚硫酸钠到基于半花菁结构衍生物测的近红外荧光探针（10 μM）后后紫外-可见吸收光谱随时间的变化趋势；插图是紫外灯下探针的颜色以及探针和亚硫酸钠反应完后的颜色变化；

[0035] 图16为本发明基于半花菁结构衍生物测的近红外荧光探针（10 μM）的溶液随亚硫酸钠浓度的增大而呈现的紫外-可见吸收光谱变化。

具体实施方式

[0036] 以下通过优选实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

[0037] 实施例1：

[0038] 一种基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针，该近红外荧光探针分子式为C35H32N3O6S2+，结构式如下：

[0039] 。

[0040] 上述基于基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针的制备方法，其合成路线见图1，具体包括以下步骤：

[0041] 1）化合物2的制备

[0042] 在氮气保护下，将化合物1（70 mg，0.33 mmol）和K2CO3（45 mg，0.33 mmol）加入到25 mL乙腈中，在室温下搅拌30 min获得溶液a。将七甲川花菁（100 mg，0.16 mmol）溶于10 mL乙腈获得溶液b。通过注射器将溶液b加入到上述溶液a中，然后在50℃条件下加热回流反应10小时。反应结束后，减压蒸除溶剂，通过硅胶柱色谱（洗脱剂，V二氯甲烷:V甲醇= 50:1）进一步分离纯化，得到蓝绿色固体57 mg，即为化合物2（收率，71%）。

[0043] 化合物2的合成路线如下：

[0044] 。

[0045] 2）目标化合物基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针的制备

[0046] 在氮气保护下，将化合物2（200 mg，0.41 mmol）和K2CO（3 68 mg，0.49 mmol）加入到25 mL乙腈中，在室温下搅拌30 min获得溶液a。将化合物2,4-二硝基氟苯（100 mg，0.16 mmol）溶于10 mL乙腈获得溶液b。通过注射器将溶液b加入到上述溶液a中，然后在室温条件下反应15小时。反应结束后，减压蒸除溶剂，通过硅胶柱色谱（洗脱剂，V二氯甲烷:V甲醇= 30:1）进一步分离纯化，得到固体185 mg，即为目标化合物基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针（收率，69%）。

[0047] 对制备所得目标化合物基于半花菁结构衍生物的近红外荧光探针进行核磁氢谱、核磁碳谱分析，结果如下（详见图2和3）：

[0048] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.92 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.56 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 8.45 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.50 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 7.43 (dd, J = 4.1, 1.9 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 
6.9 Hz, 2H), 6.96 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 5.84 (s, 1H), 4.27 (s, 3H), 3.51 – 
3.39 (m, 2H), 3.39 – 3.29 (m, 2H), 2.90 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.73 (t, J = 6.0 
13
Hz, 2H), 1.99 – 1.89 (m, 2H), 1.72 (s, 6H).  C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 179.37, 
152.85, 152.03, 146.32, 142.33, 142.06, 141.96, 139.46, 131.34, 131.22, 
129.44, 129.35, 128.49, 128.30, 122.35, 122.24, 120.68, 119.15, 116.32, 
113.59, 108.09, 107.95, 51.13, 48.28, 39.97, 34.76, 29.69, 27.72, 24.55, 
20.21.

[0049] 目标化合物的合成路线如下：

[0050] 。

[0051] 荧光检测应用试验

[0052] 下文中，为描述简便，将本发明制备所得目标化合物“测苯硫酚、硫化氢、亚硫酸根离子的近红外荧光探针”统一简称为“探针2SFB”。

[0053] 1）检测用储备液的配制：

[0054] a. 探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)的配制：

[0055] 取0.00654 g(M =654.78)探针2SFB溶于10 mL乙腈中，配成浓度为1.00 × 10-3 mol·L-1的溶液。

[0056] b. 各种离子均用去离子水配置成为浓度为1.00 × 10-3 mol·L-1或1.00 × 10-2 mol·L-1的溶液

[0057] c. HEPES缓冲溶液(0.01 mol·L-1，pH = 7.4)的配制：

[0058] 取119.15g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶解在400 mL去离子水中，加1 mol•L-1的氢氧化钠水溶液调节至所需pH(pH = 7.4)，然后用去离子水定容至500 mL于冰箱内保存。

[0059] d. Tris-HCl缓冲溶液(0.05 mol•L-1，pH = 7.4)的配制：

[0060] 取1.51425g三羟甲基氨基甲烷溶解在100 mL去离子水中，加0.1 mol•L-1的盐酸水溶液调节至所需pH(pH = 7.4)，然后用去离子水定容至250 mL于冰箱内保存。

[0061] e. PB缓冲溶液(0.2 mol•L-1，pH = 7.4)的配制：

[0062] 0.2 mol•L-1 PBS母液(pH=7.4):取19 mL的0.2 mol•L-1KH2PO4，81mL 0.2 mol•L-1 K2HPO4，即可。然后取50 mL0.2 mol•L-1 PBS溶液，加水稀释至1000 mL即可。

[0063] 本文实验中使用的实验用水均为去离子水。

[0064] 2)检测分析

[0065] a. 苯硫酚

[0066] 取3 mL DMSO/HEPES (0.10 mol∙L-1,v/v=5/5, pH=7.4)混合溶液，加入30μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)和30μL苯硫酚(1.00 ×10-3 mol·L-1)，于25℃反应，然后进行紫外检测，结果如图4所示。由图4可以看出：随着时间的增加，探针2SFB和苯硫酚反应，使吸光度逐渐增强。图中所示吸光度在波长为713nm处随着时间的增长而增加，在3分钟后吸光度达到最大，由此可知在以后的测试中，反应时间在3分钟内完成。图4插图为反应前后的照片，图中肉眼可见苯硫酚可以使近红外荧光探针溶液发生明显的颜色变化，颜色由紫色变为绿色。

[0067] 取3 mL DMSO/HEPES (0.10 mol∙L-1,v/v=5/5, pH=7.4)混合溶液，加入30μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，再加入苯硫酚(1.00 ×10-3 mol·L-1) 30μL，于25℃条件下反应，然后进行荧光检测，激发波长为713nm，狭缝：2.5/2.5nm，结果如图5所示。由图5可以看出：随着时间的增加，探针2SFB和苯硫酚反应后释放出来荧光，荧光强度逐渐增加。

[0068] 取3 mL DMSO/HEPES (0.10 mol∙L-1,v/v=5/5, pH=7.4)混合溶液，加入30μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，每隔3min加入5μL苯硫酚，于25℃反应，然后进行紫外检测，直至加入30μL苯硫酚时，吸光度达到最大。结果如图6所示，由图6可以看出：随着苯硫酚加入当量的增加，探针2SFB和苯硫酚在波长为713nm处释放出来荧光，使吸光度逐渐增加。

[0069] 取3 mL DMSO/HEPES (0.10 mol∙L-1,v/v=5/5, pH=7.4)混合溶液，加入30μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，每隔3min加入5μL苯硫酚(1.00 ×10-3 mol·L-1)，于25℃条件下反应，然后进行荧光检测，激发波长为713nm，狭缝：2.5/2.5nm，结果如图7所示。由图7可以看出：随着苯硫酚加入当量的增加，探针2SFB和苯硫酚释放出来荧光，使荧光强度逐渐增加。

[0070] 平行取3 mL DMSO/HEPES (0.10 mol∙L-1,v/v=5/5, pH=7.4)混合溶液20份，每份加入30μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，再分别加入(1)空白；(2)30μL F-；(3)30μL Br-；(4)30μL Cl-；(5)30μL SO42-；(6)30μL HCO3-；(7)30μL CO32-；(8)30μL NO2-；
(9)30μL CH3COO-；(10)30μL H2O2；(11)30μL H2PO4-；(12)30μL PhOH；(13)30μL ClO-；(14)30μL K+；(15)30μL Na+；(16)30μL Cys；(17)30μL GSH； (18)30μL HS-；(19)30μL SO32-；(20)
30μL PhSH，反应3分钟后进行紫外-可见光光谱和荧光扫描，结果分别如图8和图9所示。由图8和图9可以看出：探针2SFB和苯硫酚反应，使吸光度及荧光强度增加，硫氢根离子和亚硫酸根离子在此条件下是下降的，而其他离子与探针在此条件下没有明显的吸光度及荧光强度变化。

[0071] b. 硫氢化钠

[0072] 取3 mL DMSO/Tris-HCl (0.10 mol∙L-1,v/v=7/3, pH=7.4)混合溶液，加入30μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，加入30μL硫氢化钠(1.00 ×10-3 mol·L-1)，于25℃反应，每隔1min然后进行紫外检测，结果如图10所示。由图10可以看出：随着时间的增加，探针2SFB和硫氢化钠反应，使吸光度逐渐增强。图中所示吸光度随着时间的增长而增加，但在11分钟后吸光度达到最大，由此可知在以后的测试中，反应时间在11分钟内完成。
图10插图为反应前后的照片，图中肉眼可见硫氢化钠可以使近红外荧光探针溶液发生明显的颜色变化，颜色由紫色变为亮绿色。

[0073] 取3 mL DMSO/Tris-HCl (0.10 mol∙L-1,v/v=7/3, pH=7.4)混合溶液，加入30μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，再加入硫氢化钠(1.00 ×10-3 mol·L-1) 30μL，于25℃反应，每隔1min然后进行荧光检测，激发波长为718nm，狭缝：1.5/5nm，结果如图11所示。由图11可以看出：随着时间的增加，探针2SFB和硫氢化钠释放出来荧光，使荧光强度逐渐增加。

[0074] 取3 mL DMSO/Tris-HCl (0.10 mol∙L-1,v/v=7/3, pH=7.4)混合溶液，加入30μL探-3 -1针2SFB样品溶液(1.00 × 10  mol·L )，每隔11min加入5μL 硫氢化钠，于25℃反应，然后进行紫外检测，直至加入12μM硫氢化钠时，吸光度达到最大。结果如图12所示，由图12可以看出：随着硫氢化钠加入当量的增加，探针2SFB和硫氢化钠释放出来荧光，使吸光度逐渐增加。

[0075] 取3mL DMSO/Tris-HCl (0.10 mol∙L-1,v/v=7/3, pH=7.4)混合溶液，加入30μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，每隔11min加入5μL加入硫氢化钠(1.00 ×10-3 mol·L-1)，于25℃条件下反应，然后进行荧光检测，激发波长为718nm，狭缝：1.5/5nm，结果如图13所示。由图13可以看出：随着硫氢化钠加入当量的增加，探针2SFB和硫氢化钠释放出来荧光，使荧光强度逐渐增加。

[0076] 取3 mL DMSO/Tris-HCl (0.10 mol∙L-1,v/v=7/3, pH=7.4)混合溶液20份，每份加入30μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，再分别加入(1)空白；(2)30μL F-；(3)30μL Br-；(4)30μL Cl-；(5)30μL SO42-；(6)30μL HCO3-；(7)30μL CO32-；(8)30μL NO2-；(9)30μL CH3COO-；(10)30μL H2O2；(11)30μL H2PO4-；(12)30μL PhOH；(13)30μL ClO-；(14)30μL K+；(15)30μL Na+；(16)30μL Cys；(17)30μL GSH (18)30μL SO32-；(19)30μL PhSH；(20)30μL HS-，反应11分钟后进行紫外可见谱扫描，结果分别如图14所示。由图14可以看出：探针2SFB和HS-反应，使吸光度及荧光强度增加，苯硫酚和亚硫酸根离子有小部分干扰，而其他离子与探针在此条件下没有明显的吸光度及荧光强度变化。

[0077] c. 亚硫酸钠

[0078] 取3mL DMSO/PB (0.10 mol∙L-1,v/v=9/1, pH=7.4)混合溶液，加入30μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)和30μL亚硫酸钠的响应时间，于25℃反应，然后进行紫外检测，结果如图15所示。由图15可以看出：随着时间的增加，探针2SFB和亚硫酸钠反应，使吸光度逐渐增强。图中所示吸光度随着时间的增长而增加，但在30分钟后吸光度达到最大，由此可知在以后的测试中，反应时间在30分钟内完成。图15插图为反应前后的照片，图中肉眼可见亚硫酸钠可以使近红外荧光探针溶液发生明显的颜色变化，颜色由紫色变为浅绿色。

[0079] 取3 mL DMSO/PB (0.10 mol∙L-1,v/v=9/1, pH=7.4)混合溶液，加入30μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)每隔30min加入5μL亚硫酸钠，每次于25℃条件下反应，然后进行紫外检测，直至加入30μL亚硫酸钠时，吸光度达到最大。结果如图16所示，由图16可以看出：随着亚硫酸钠加入当量的增加，探针2SFB和亚硫酸钠释放出来荧光，使吸光度逐渐增加。

[0080] 3）检出限

[0081] a. 苯硫酚

[0082] 取3 mL DMSO/HEPES (0.10 mol∙L-1,v/v=5/5, pH=7.4)混合溶液，分别每次加入30 μL探针2SFB样品乙腈溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，每次反应3分钟后进行紫外可见光光谱扫描，直到吸光强度没有明显变化为止，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行做图，-1
得如图6中的附图所述的线性方程。另取3 mL DMSO/HEPES (0.10 mol∙L ,v/v=5/5, pH=
7.4)混合溶液，加入30 μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，连续测20次吸光强度，计算标准方差，根据检出限公式将所述标准方差的结果乘以3再除以图6中线性方程的斜率可得本发明荧光探针的检出限为0.26μM。

[0083] b. 硫氢化钠

[0084] 取3 mL DMSO/Tris-HCl (0.10 mol∙L-1,v/v=7/3, pH=7.4)混合溶液，分别每次加入30 μL探针2SFB样品乙腈溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，每次反应11分钟后进行紫外可见光光谱扫描，直到吸光强度没有明显变化为止，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行做-1图，得如图12中的附图所述的线性方程。另取3 mL DMSO/Tris-HCl (0.10 mol∙L ,v/v=7/
3, pH=7.4)混合溶液，加入30 μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，连续测20次吸光强度，计算标准方差，根据检出限公式将所述标准方差的结果乘以3再除以图12中线性方程的斜率可得本发明荧光探针的检出限为0.45μM。

[0085] c. 亚硫酸钠

[0086] 取3 mL DMSO/PB (0.10 mol∙L-1,v/v=9/1, pH=7.4)混合溶液，分别每次加入30 μL探针2SFB样品乙腈溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，每次反应30分钟后进行紫外可见光光谱扫描，直到吸光强度没有明显变化为止，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行做图，得如图16中的附图所述的线性方程。另取3 mL DMSO/PB (0.10 mol∙L-1,v/v=9/1, pH=7.4)混合溶液，加入30 μL探针2SFB样品溶液(1.00 × 10-3 mol·L-1)，连续测20次吸光强度，计算标准方差，根据检出限公式将所述标准方差的结果乘以3再除以图16中线性方程的斜率可得本发明荧光探针的检出限为0.32μM。

[0087] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。