一株供体菌、其构建方法与应用以及质粒抑制剂筛选方法

摘要

本发明提供了一株供体菌、其构建方法与应用以及质粒抑制剂筛选方法。所述的供体菌包含自杀型荧光质粒和pCRISPR‑LUX质粒，该供体菌本身不表达荧光；而所述的自杀型荧光质粒可通过接合转移进入受体菌，由于接合子脱离了失去核酸内切酶活性的Cas9蛋白的抑制而可以表达荧光。本发明还提供了所述的供体菌的构建方法及应用，所述的应用为通过分析接合子的荧光表达情况对接合转移效率进行定量分析或质粒抑制剂的筛选。同时，本发明还提供了一种基于CRISPR/dCas9筛选质粒抑制剂的方法，可实现高通量筛选抑制耐药质粒接合转移的物质，筛选过程高效、方便、快捷，适用范围较为广泛，为克服细菌耐药性提供新的思路和方法。

权利要求

1.一种用于接合转移的供体菌，其特征在于：

包含自杀型荧光质粒和pCRISPR-LUX质粒，所述的自杀型荧光质粒含有转座单元，所述的转座单元为两个IS26转座单元夹着以trc为启动子的生物荧光素lux基因片段，且为可接合型质粒；所述的pCRISPR-LUX质粒为不可接合型质粒，含有失去核酸内切酶活性的Cas9基因片段及靶向trc启动子的gRNA基因片段，pCRISPR-LUX质粒具体结构见说明书附图的图4所示。

2.根据权利要求1所述的用于接合转移的供体菌，其特征在于：所述的gRNA基因片段的靶标序列核苷酸序列为CATCCGGCTCGTATAATGTG；

所述的gRNA基因片段还包含gRNA scaffold序列；

所述的pCRISPR-LUX质粒为将启动子TetR、dCas9基因、靶向trc启动子的gRNA基因片段、耐药基因片段以及复制单元p15A元件进行组装得到；

所述的自杀型荧光质粒的转座单元还包括用于接合子筛选的筛选基因片段。

3.根据权利要求2所述的用于接合转移的供体菌，其特征在于：所述的筛选基因片段为亚碲酸钠耐药基因片段；

所述的生物荧光素lux基因片段为LuxC-LuxD-LuxA-LuxB-LuxE基因片段；

所述的gRNA scaffold序列为如SEQ ID NO:5的自5’末端第71至152位核苷酸所示；

所述的启动子TetR的核苷酸序列为如NCBI参考序列NC_005014.1自5’末端第12797至

13420位核苷酸所示；

所述的dCas9基因的核苷酸序列为如NCBI参考序列NC_018610.1自5’末端第1944958至

1949073位核苷酸所示；

所述的耐药基因片段为氨苄青霉素耐药基因片段。

4.权利要求1～3任一项所述的接合转移的供体菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）自杀型荧光质粒的构建：将所述的自杀型荧光质粒转化含有可接合型质粒的宿主菌Ⅰ，得到重组菌株Ⅰ；

（2）pCRISPR-LUX质粒的构建：合成或扩增得到失去核酸内切酶活性的Cas9基因片段和靶向trc启动子的gRNA基因片段，将所述两个基因片段进行同源重组，得到所述的pCRISPR-LUX质粒，将所述的pCRISPR-LUX质粒转化宿主菌Ⅱ，得到重组菌株Ⅱ；

（3）将所述的重组菌株Ⅰ与所述的重组菌株Ⅱ进行混合培养后，通过筛选得到所述的接合转移的供体菌。

5.根据权利要求4所述的接合转移的供体菌的构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述的可接合型质粒为IncX型质粒；

步骤（3）中所述的重组菌株Ⅰ与所述的重组菌株Ⅱ按体积比1：(1～10)进行混合培养；

步骤（3）中所述的筛选为通过亚碲酸钠、链霉素、氨苄西林筛选得到所述的接合转移的供体菌。

6.根据权利要求5所述的接合转移的供体菌的构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述的自杀型荧光质粒转化含有IncX型质粒的宿主菌Ⅰ的操作为：①将自杀型荧光质粒直接转化含有IncX型质粒的宿主菌Ⅰ；

或 ②将自杀型荧光质粒转化E. coli WM3064感受态细胞，得到产荧光的E. coli WM3064/p26-RP4-lux；再将E. coli WM3064/p26-RP4-lux和含有IncX型质粒的宿主菌Ⅰ混合培养；

所述的E. coli WM3064/p26-RP4-lux和含有IncX型质粒的宿主菌Ⅰ按体积比1：(1～

10)进行混合培养；

步骤（2）中所述的宿主菌Ⅱ为E. coli MG1655S感受态细胞；

步骤（3）中所述的亚碲酸钠、链霉素、氨苄西林的浓度依次为25 µg/mL、2000 µg/mL、

100 µg/mL。

7.根据权利要求4所述的接合转移的供体菌的构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述的宿主菌Ⅰ为E. coli CSZ4；

所述的步骤（1）的具体操作为：

①将pUC26-tpm质粒通过Afl II和Xho I双酶切，回收产物得到酶切产物I；将pUC26-RP4质粒通过Afl II和Xho I双酶切，回收产物得到酶切产物II；然后连接酶切产物I和酶切产物II，得到p26-RP4质粒；

②将步骤①中得到的p26-RP4质粒通过EcoR I和Spe I双酶切，回收产物得到酶切产物III；将pBBR1MCS4-LuxCDABE质粒通过EcoR I和Spe I 双酶切，回收产物得到酶切产物IV；

然后连接酶切产物III和酶切产物IV，得到p26-RP4-lux质粒，即基于IS26插入序列构建的能表达荧光的自杀型质粒；

步骤（2）的具体操作步骤为：

①以pG1AK为模板，如SEQ ID NO:3所示的引物LHluxEc-F2、如SEQ ID NO:4所示的引物LH-Ec-R为引物，扩增得到以trc启动子为靶标的gRNA-1片段，所述的gRNA-1片段首尾连接后得到质粒pgRNA-1；

②以质粒pgRNA-1为模板，如SEQ ID NO:5所示的引物gRNA-H1P1、如SEQ ID NO:6所示的引物gRNA-H2P2为引物扩增gRNA-2；以pwtcas9为PCR模板、如SEQ ID NO:7所示的引物dCas9-F1、如SEQ ID NO:8所示的引物dCas9-R1为引物扩增dCas9-1片段；将所述的gRNA-2和dCas9-1片段进行同源重组，构建得到pCRISPR-LUX质粒；

③将pCRISPR-LUX质粒加入到大肠杆菌E. coli MG1655S感受态细胞中，混匀后冰浴30 min、42℃水浴45 s、冰浴3 min，再加入LB肉汤培养基进行培养，得到菌液，将所述的菌液涂布在含氨苄青霉素的LB琼脂培养基中进行培养，得到转化成功的重组菌株Ⅱ。

8.权利要求1～3任一项所述的用于接合转移的供体菌的应用，包括对接合转移效率的定量分析或质粒抑制剂的筛选。

9.一种基于CRISPR/dCas9筛选质粒抑制剂的方法，其特征在于，包括如步骤：将权利要求1～3任一项所述的接合转移的供体菌与受体菌在含脱水四环素和待筛选物质的培养基中进行混合培养，测定并比较其与含有用于接合转移的供体菌和相同浓度的脱水四环素的混合溶液的荧光值。

10.根据权利要求9所述的基于CRISPR/dCas9筛选质粒抑制剂的方法，其特征在于：所述的受体菌为E.coli C600；

所述的混合培养的条件为37℃培养4～6 h；

所述的脱水四环素的终浓度为200 ng/mL。

说明书

一株供体菌、其构建方法与应用以及质粒抑制剂筛选方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物构建筛选技术领域，一株供体菌、其构建方法与应用以及质粒抑制剂筛选方法，特别涉及一株可用于筛选质粒抑制剂的供体菌及一种基于CRISPR/dCas9筛选质粒抑制剂的方法。

背景技术

[0002] 质粒是介导耐药基因水平转移的主要元件之一，通过抑制质粒接合转移达到减少耐药基因扩散的目的是目前克服细菌耐药性的一个重要方向，其中建立高通量的质粒抑制剂的筛选方法至关重要。

[0003] 目前，相关的质粒抑制剂筛选方法并不多。如Fernandez-Lopez建立的高通量的筛选方法可以筛选那些由于干扰细胞生长或细菌生理学的接合抑制剂，这说明其筛选具有局限性。

[0004] 目前关于质粒抑制剂研究不足，其中不饱和脂肪酸被认为是有效质粒抑制剂(油酸、亚麻油酸、2-hexadecynoic and tanzawaic acids)。例如棕榈酸(不饱和脂肪酸)通过绑定TrwD基因，通过绑定接合相关ATP合成酶进而降低质粒接合水平。同一化合物对不同接合类型的质粒接合能力也不一样，如tanzawaic acids A and B对IncW和IncFII接合系统有显著的抑制作用，对IncFI,IncI,IncL/M,IncX and IncH抑制程度较小，对IncN和IncP无任何作用。

发明内容

[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供用于筛选质粒抑制剂的供体菌，所述的供体菌可通过接合转移将质粒转移至受体菌株中而得到接合子。

[0006] 本发明的另一目的在于提供所述的供体菌的构建方法。

[0007] 本发明的再一目的在于提供所述的供体菌的应用。

[0008] 本发明的又一目的在于提供一种基于CRISPR/dCas9筛选质粒抑制剂的方法，该方法可定量评估质粒接合转移效率的运用该系统，我们可以高通量筛选质粒的抑制剂(例如小分子化合物、中药单体或者植物取物)，为克服耐药菌的提供可行方法。

[0009] 本发明的另一目的在于提供所述的基于CRISPR/dCas9筛选质粒抑制剂的方法的应用。

[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0011] 一种用于接合转移的供体菌，包含自杀型荧光质粒和pCRISPR-LUX质粒，所述的自杀型荧光质粒含有转座单元，所述的转座单元为两个IS26转座单元夹着以trc为启动子的生物荧光素lux基因片段，且为可接合型质粒；所述的pCRISPR-LUX质粒含有失去核酸内切酶活性的Cas9基因片段及靶向trc启动子的gRNA基因片段，且为不可接合型质粒。由于gRNA的引导，失去核酸内切酶活性的Cas9蛋白特异性结合于自杀型荧光质粒的trc启动子的DNA序列，抑制生物荧光素lux基因的表达，因此，所述的供体菌本身不表达荧光；而所述的供体菌的自杀型荧光质粒可通过接合转移进入受体菌，由于接合子脱离了失去核酸内切酶活性的Cas9蛋白的抑制而可以表达荧光。

[0012] 所述的gRNA基因片段的核苷酸序列优选为CATCCGGCTCGTATAATGTG(SEQ ID NO:2)。

[0013] 所述的gRNA基因片段还包含gRNA scaffold序列，其可为dCas9蛋白提供结合位点；所述的gRNA scaffold序列优选为如SEQ ID NO:5的自5’末端第71至152位核苷酸所示。

[0014] 所述的生物荧光素lux基因片段优选为LuxC-LuxD-LuxA-LuxB-LuxE基因片段。

[0015] 所述的自杀型荧光质粒的转座单元还可以包括用于接合子筛选的筛选基因片段；所述的筛选基因片段优选为亚碲酸钠耐药基因(tpmR)片段。

[0016] 所述的pCRISPR-LUX质粒优选为将启动子TetR、dCas9基因、靶向trc启动子的gRNA基因片段、耐药基因片段以及复制单元p15A元件进行组装，得到所述的pCRISPR-LUX质粒。

[0017] 所述的启动子TetR的核苷酸序列优选为如NCBI参考序列NC_005014.1自5’末端第12797至13420位核苷酸所示。

[0018] 所述的dCas9基因的核苷酸序列优选为如NCBI参考序列NC_018610.1自5’末端第1944958至1949073位核苷酸所示。

[0019] 所述的耐药基因片段优选为氨苄青霉素耐药基因(AmpR)片段；其核苷酸序列优选为如NCBI参考序列NC_002516.2自5’末端第4592990至4593880位核苷酸所示。

[0020] 所述的组装优选为通过Biobrick的组装策略组装。

[0021] 所述的接合转移的供体菌的构建方法，包括如下步骤：

[0022] (1)自杀型荧光质粒的构建：将所述的自杀型荧光质粒转化含有可接合型质粒的宿主菌Ⅰ，得到重组菌株Ⅰ；

[0023] (2)pCRISPR-LUX质粒的构建：合成或扩增得到失去核酸内切酶活性的Cas9基因片段和靶向trc启动子的gRNA基因片段，将所述两个基因片段进行同源重组，得到所述的pCRISPR-LUX质粒，将所述的pCRISPR-LUX质粒转化宿主菌Ⅱ，得到重组菌株Ⅱ；

[0024] (3)将所述的重组菌株Ⅰ与所述的重组菌株Ⅱ进行混合培养，筛选得到所述的接合转移的供体菌。

[0025] 步骤(1)中所述的可接合型质粒优选为IncX型质粒。

[0026] 步骤(1)中所述的宿主菌Ⅰ优选为E.coli CSZ4。

[0027] 步骤(1)中所述的自杀型荧光质粒转化含有IncX型质粒的宿主菌Ⅰ的操作可以为：

[0028] ①将自杀型荧光质粒直接转化含有IncX型质粒的宿主菌Ⅰ；

[0029] ②将自杀型荧光质粒转化E.coli WM3064感受态细胞，得到产荧光的E.coli WM3064/p26-RP4-lux；再将E.coli WM3064/p26-RP4-lux和含有IncX型质粒的宿主菌Ⅰ混合培养。

[0030] 所述的E.coli WM3064/p26-RP4-lux和含有IncX型质粒的宿主菌Ⅰ优选按体积比1：(1～10)进行混合培养。

[0031] 所述的步骤(1)的具体操作为：

[0032] ①将pUC26-tpm质粒通过Afl II和Xho I双酶切，电泳、回收产物，得到酶切产物I；将pUC26-RP4质粒通过Afl II和Xho I双酶切，电泳、回收产物，得到酶切产物II；然后连接酶切产物I和酶切产物II，得到p26-RP4质粒；所述的连接优选为用连接酶连接；

[0033] ②将步骤①中得到的p26-RP4质粒通过EcoR I和Spe I双酶切，电泳、回收产物，得到酶切产物III；将pBBR1MCS4-LuxCDABE质粒通过EcoR I和Spe I双酶切，电泳、回收产物，得到酶切产物IV；然后连接酶切产物III和酶切产物IV，得到p26-RP4-lux质粒，即基于IS26插入序列构建的能表达荧光的自杀型质粒；所述的连接优选为用连接酶连接。

[0034] 步骤①和②中所述的连接酶优选为T4 DNA连接酶。

[0035] 步骤①和②中所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳。

[0036] 步骤①和②中所述的回收为采用TAKARA公司的胶回收试剂盒进行回收。

[0037] 构建p26-RP4-lux质粒的方法，还包括将步骤①中得到p26-RP4质粒以及步骤②中得到p26-RP4-lux质粒进行增殖的步骤；具体为：步骤①中得到p26-RP4质粒或p26-RP4-lux质粒转入大肠杆菌感受态细胞中进行增殖培养，再抽提质粒，得到增殖后的p26-RP4质粒或p26-RP4-lux质粒。

[0038] 步骤(2)中所述的宿主菌Ⅱ优选为E.coli MG1655S感受态细胞。

[0039] 步骤(2)的具体操作步骤为：

[0040] ①以pG1AK为模板，LHluxEc-F2(SEQ ID NO:3)、LH-Ec-R(SEQ ID NO:4)为引物，扩增得到以trc启动子为靶标的gRNA-1片段，所述的gRNA-1片段首尾连接后得到质粒pgRNA-1；

[0041] ②以质粒pgRNA-1为模板，gRNA-H1P1(SEQ ID NO:5)、gRNA-H2P2(SEQ ID NO:6)为引物扩增得到序列gRNA-2；以pwtcas9为PCR模板、dCas9-F1(SEQ ID NO:7)、dCas9-R1(SEQ ID NO:8)为引物扩增得到dCas9-1片段；将所述的gRNA-2和dCas9-1片段进行同源重组，构建得到pCRISPR-LUX质粒；

[0042] ③将pCRISPR-LUX质粒加入到大肠杆菌E.coli MG1655S感受态细胞中，混匀后冰浴30min、42℃水浴45s、冰浴3min，再加入LB肉汤培养基进行培养，得到菌液，将所述的菌液涂布在含氨苄青霉素的LB琼脂培养基中进行培养，得到转化成功的重组菌株Ⅱ。

[0043] 所述的氨苄青霉素的终浓度优选为100μg/mL。

[0044] 步骤(3)中所述的重组菌株Ⅰ与所述的重组菌株Ⅱ优选按体积比1：(1～10)进行混合培养。

[0045] 步骤(3)中所述的筛选为通过亚碲酸钠、链霉素、氨苄西林筛选得到所述的接合转移的供体菌；所述的亚碲酸钠、链霉素、氨苄西林的浓度依次优选为25μg/mL、2000μg/mL、100μg/mL。

[0046] 所述的用于接合转移的供体菌的应用，包括对接合转移效率的定量分析或质粒抑制剂的筛选；所述的应用通过分析接合子的荧光表达情况实现。

[0047] 一种基于CRISPR/dCas9筛选质粒抑制剂的方法，包括如步骤：

[0048] 将所述的用于接合转移的供体菌与受体菌在含脱水四环素和待筛选物质的培养基中进行混合培养，测定并比较其与含有用于接合转移的供体菌和相同浓度的脱水四环素的混合溶液的荧光值。

[0049] 所述的受体菌优选为E.coli C600。

[0050] 所述的混合培养的条件优选为37℃培养4～6h。

[0051] 所述的脱水四环素的终浓度优选为200ng/mL。

[0052] 本发明以肠杆菌科中常见的IncX型质粒为研究对象，该质粒通过IS26转座单元插入以trc为启动子的生物荧光素(lux)基因，同时构建pCRISPR-lux质粒，该质粒携带需要脱水四环素诱导表达的dCas9基因和以trc启动子为靶标的gRNA。这两个质粒转到大肠杆菌E.coli MG1655S菌株中，形成供体菌，同时选择实验室常用的E.coli C600作为受体菌。供体菌与受体菌分别培养至生长对数期以后，混匀(如按体积比1:1)后加至96孔板，静止培养4h后，培养前加入脱水四环素诱导剂和待筛选物，在荧光检测仪上检测荧光值。

[0053] 供体菌中的dCas9基因受到诱导后表达，与自杀型荧光质粒plux(如p26-RP4-lux)上特定的DNA序列结合而抑制其发光基因的表达，故供体菌不发光；而接合子由于脱离了CRISPR-dCas9蛋白的阻抑而表达荧光，通过比较加入了待筛选物的实验组与对照组的荧光值(如利用PerkinElmer全自动酶标仪)，即可实现耐药质粒的接合转移效率的定量分析。

[0054] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0055] 1.本发明构建得到了一种用于接合转移的供体菌，该供体菌包含自杀型荧光质粒和pCRISPR-LUX质粒，该供体菌本身不表达荧光，可与受体菌进行接合转移实验后使接合子表达荧光。

[0056] 2.本发明提供了一种基于CRISPR/dCas9基因调控技术筛选新型质粒抑制剂的方法，可运用该系统高通量筛选抑制耐药质粒接合转移的物质，筛选过程高效、方便、快捷，且筛选范围较为广泛，如小分子化合物、中药单体、植物提取物等等，为克服细菌耐药性提供新的思路和方法。

附图说明

[0057] 图1是实施例1中p26-RP4-lux质粒的构建方法示意图。

[0058] 图2是实施例1构建得到的p26-RP4-lux质粒图谱图。

[0059] 图3是实施例1中构建得到的pgRNA-1质粒图谱图。

[0060] 图4是实施例1构建得到的pCRISPR-lux质粒图谱图。

[0061] 图5是pCRISPR-lux质粒对pCSZ4-LUX质粒上荧光基因表达的抑制效果结果分析图。

[0062] 图6是本发明的实验原理图。

具体实施方式

[0063] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0064] 实施例1供体菌CSZ4LC2的构建

[0065] IncX型质粒pCSZ4(GeneBank登录号：KX711706)通过IS26转座单元插入以trc为启动子的生物荧光素(Lux)基因。构建过程如下：

[0066] 1.构建自杀型荧光质粒p26-RP4-lux

[0067] 构建过程如图1所示，用NEB公司的Afl II酶和Xho I酶分别酶切pUC26-tpm质粒(购自上海吉凯基因科技有限公司)和pUC26-RP4质粒(购自上海吉凯基因科技有限公司)，琼脂糖凝胶电泳酶切产物，采用TAKARA公司胶回收试剂盒分别回收纯化长度为2880bp的酶切片段(含tpmR耐药基因)和4702bp的酶切片段(含CmR-R6K-TraJ片段)，纯化后的酶切产物经TAKARA公司T4DNA连接酶的催化，过夜连接为p26-RP4质粒。将p26-RP4质粒化转进入TAKARA公司的大肠杆菌DH5α化转感受态细胞大量增殖p26-RP4质粒，并按照天根生化科技有限公司的质粒小提试剂盒使用说明书，从转化子中提取p26-RP4质粒。用NEB公司的EcoR I酶和Spe I酶分别双酶切p26-RP4质粒和pBBR1MCS4-LuxCDABE质粒(购自上海吉凯基因科技有限公司)，琼脂糖凝胶电泳，并采用上述TAKARA公司胶回收试剂盒分别回收纯化长度为5715bp、7332bp(即LuxCDABE基因片段)的酶切产物，回收的酶切产物经T4DNA连接酶的催化作用下形成如图2所示的p26-RP4-lux质粒。将p26-RP4-lux质粒化转进入TAKARA公司的大肠杆菌DH5α感受态细胞，即可获得大量p26-RP4-lux质粒，其中，p26-RP4-lux质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0068] 2.构建能表达荧光的IncX型质粒

[0069] (1)将步骤1构建得到的能表达荧光的自杀型质粒(即p26-RP4-lux质粒)转化E.coli WM3064(购自广州成康生物科技有限公司)感受态细胞，得到产荧光的E.coli WM3064/p26-RP4-lux；

[0070] (2)将步骤(1)中得到的荧光标记的E.coli WM3064/p26-RP4-lux和E.coli CSZ4(该菌株含质粒pCSZ4，菌株E.coli CSZ4已在文献Sun J,Fang L X,Wu Z,et al.Genetic Analysis of the IncX4 Plasmids:Implications for a Unique Pattern in the mcr-1 Acquisition[J].Scientific Reports,2017,7(1):424.中公开)分别培养至对数生长期；

[0071] (3)将步骤(2)中获得的对数生长期的E.coli WM3064/p26-RP4-lux和E.coli CSZ4按体积比1：1～10混合均匀后加入到LB肉汤培养基(购自广州环凯生物科技有限公司)中进行培养(37℃静置培养4h)，将培养液涂布于亚碲酸钠选择培养基(含25μg/mL亚碲酸钠的LB琼脂培养基)中，静置培养16～24h，通过小动物活体成像仪筛选荧光菌株，得到改造后的荧光菌株E.coli CSZ4/pCSZ4-LUX，即基于IS26插入序列转座突变技术构建的荧光菌株。

[0072] 由于宿主E.coli WM3064含有pir基因，能够提供质粒复制的必须π蛋白。p26-RP4-lux质粒可以在不同革兰氏阴性菌之间进行接合转移，该质粒含有一个转座单元，该转座单元由两个IS26转座单元夹着一个亚碲酸钠耐药基因(tpm)和一个lux基因簇(LuxA、B、C、D、E)，形成一个转座子。由于E.coli CSZ4不能编码π蛋白，故在步骤(3)的混合培养时，p26-RP4-lux质粒通过自然接合转移的方式进入E.coli CSZ4细胞内后不能复制会随之凋亡，而发生转座，两个IS26形成的转座单位会高效率的随机插入E.coli CSZ4的质粒和染色体中，由于IS26转座单元有IS26偏好性，即该转座单位会优先插入E.coli CSZ4固有的IS26序列附近，从而获得含有lux基因簇的荧光突变株，即菌株由不发光突变为能发光。

[0073] 3.构建pCRISPR-lux质粒

[0074] 将启动子TetR(NCBI参考序列：NC_005014.1(12797..13420))、dCas9基因(NCBI参考序列：NC_018610.1(1944958..1949073))、靶向trc启动子的gRNA基因片段、gRNA Rscaffold序列(如SEQ ID NO:5所示的自5’末端第71至152位核苷酸)、耐药基因Amp(NCBI参考序列：NC_002516.2(4592990..4593880,complement))，以及复制单元p15A等元件通过Biobrick的组装策略组装在一起，构建以lux基因启动子为靶标的不可接合型pCRISPR-lux质粒。其中gRNA scaffold序列的主要功能为dCas9蛋白提供结合位点。

[0075] 以下为其中一种可实现的构建方法，但不限于此：

[0076] (1)以pG1AK(GenBank登录号：KU169257.1(1…2608))为模板，LHluxEc-F2、LH-Ec-R为引物片段，扩增以trc启动子为靶标的基因片段gRNA-1，PCR产物长度为2628bp，其中包含靶向trc启动子的gRNA基因片段CATCCGGCTCGTATAATGTG(5’-3’)，采用TAKARA公司DNA片段回收试剂盒回收DNA片段，回收片段gRNA-1，将所得到的线性基因片段gRNA-1用TAKARA公司连接酶连接成环，化转进入大肠杆菌DH5α，涂板含100μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基，37℃培养20小时。将板上的单菌落用LB肉汤培养基增殖后，用天根质粒小提试剂盒提取质粒pgRNA-1(SEQ ID NO:5)；如图3所示，gRNA scaffold上游的红色区块表示前文所述的靶向trc启动子的gRNA基因片段。

[0077] (2)以pgRNA-1为模板，gRNA-H1P1、gRNA-H2P2为引物扩增片段gRNA-2(该片段不含RpG1AK的复制子，包含所述的gRNA-1片段和耐药基因Amp 片段)；以pwtcas9(GenBank登录号：MH015247.1)为PCR模板、DCas9-F1、DCas9-R1为引物，扩增得到dCas9-1片段(包含dCas9基因片段、启动子TetR片段)。采用TAKARA公司胶回收试剂盒分别纯化gRNA-2和dCas9-1。

[0078] (3)使用诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(货号：C115)，将gRNA-2和dCas9-1同源重组，构建成pCRISPR-LUX质粒，所有基因连接顺序见图4，将pCRISPR-LUX转化进入TAKARA公司的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂板含100μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基，37℃培养20小时。将板上的单菌落用LB肉汤培养基增殖后，用天根质粒小提试剂盒提取质粒pCRISPR-LUX，该质粒携带需要脱水四环素诱导表达的dCas9基因和以trc启动子为靶标的gRNA。

[0079] 表1引物序列

[0080]

[0081] 4.构建含双质粒(即pCRISPR-LUX和pCSZ4-LUX)的E.coli MG1655S菌株[0082] 菌株E.coli MG1655S购自广州成康生物科技有限公司。

[0083] (1)E.coli MG1655S感受态细胞的制备

[0084] E.coli MG1655S转化感受态细胞通过CaCl2法制得；优选为通过如下方法制备得到：

[0085] (I)将E.coli MG1655S接种到LB肉汤培养基进行活化培养，然后转接到含有100mL LB肉汤的锥形瓶中进行扩大培养，再在冰上预冷后于4℃条件下进行离心，弃上清，得到E.coli MG1655S菌苔；

[0086] (II)将预冷的0.1mol/LCaCl2溶液加入到步骤(I)中得到的大肠杆菌菌液中，混匀后于4℃条件下进行离心，弃上清，再加入预冷的含15％(v/v)甘油的CaCl2溶液，重悬细菌，冰上放置，得到大肠杆菌E.coli MG1655S感受态细胞。

[0087] 步骤(I)中所述的LB肉汤培养基中的二氨荃庚二酸的浓度为50μg/mL。

[0088] 步骤(I)中所述的活化培养的条件优选为：37℃过夜培养。

[0089] 步骤(I)中所述的扩大培养的条件优选为：37℃培养2～3h。

[0090] 步骤(I)中所述的冰上预冷的时间优选为10min。

[0091] 步骤(I)中所述的离心的条件优选为：4000g离心15min。

[0092] 步骤(II)中所述的CaCl2溶液与大肠杆菌菌液的体积比为0.2:1。

[0093] 步骤(II)中所述的离心的条件优选为：4000g离心10min。

[0094] 步骤(II)中所述的冰上放置的时间优选为10min。

[0095] 步骤(II)中所述的E.coli MG1655S感受态细胞的保存温度优选为-80℃。

[0096] (2)E.coli MG1655S/pCRISPR-LUX的构建

[0097] (i)将上述构建的pCRISPR-LUX质粒(约100ng)加入到大肠杆菌E.coli MG1655S感受态细胞中，混匀后冰浴30min、42℃水浴45s、冰浴3min，再加入900μL LB肉汤培养基进行培养，得到菌液；

[0098] (ii)将步骤(i)中得到的菌液涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基中进行培养，得到转化成功的E.coli MG1655S/pCRISPR-LUX。

[0099] 对数生长期的大肠杆菌E.coli CSZ4/pCSZ4-LUX和E.coli MG1655/pCRISPR-LUX按体积比1：1～10混合均匀后加入到LB肉汤培养基中进行培养4h，取100μL混合液涂布至含有25μg/mL亚碲酸钠、2000μg/mL链霉素、100μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基。培养基放置培养箱37℃培养20h。即可筛选得到含pCRISPR-LUX和pCSZ4-LUX的E.coli MG1655S，作为本发明的供体菌，并命名为CSZ4LC2。

[0100] 实施例2供体菌CSZ4LC1的构建

[0101] 将实施例1中步骤“3.构建pCRISPR-lux质粒”过程中，除了步骤(1)中的靶向trc启动子的gRNA基因片段为ATTCTTGACAATTAATCATC(5’-3’)外，其他步骤按实施例1进行，构建得到含双质粒(即pCRISPR-LUX1和pCSZ4-LUX)的E.coli MG1655S菌株，命名为CSZ4LC1。

[0102] 实施例3高通量方法的评价

[0103] 将高压灭菌的LB琼脂灌注进康宁黑色96孔板第1列前5个孔中(每孔加入300μL琼脂)，并放置于4℃，使琼脂凝固；将脱水四环素(atc)的高压灭菌的LB琼脂灌注进康宁黑色96孔板第2、3、4、5列前5个孔中(每孔加入300μL含终浓度为200ng/mL脱水四环素的LB琼脂)并放置于4℃，使琼脂凝固。将供体菌CSZ4LC2、供体菌CSZ4LC1、受体菌E.coli C600分别培养至生长对数期。供体菌CSZ4LC2、供体菌CSZ4LC1分别进行如下实验：分别取100μL供体菌和受体菌(E.coli C600)按体积比1：1混合。第1、2列前5孔，每孔取10μL供体菌滴至琼脂表面。同样，第4列前5孔每孔滴加10μL受体菌，第3列每孔加入10μL供体菌和受体菌的混合溶液，第5列前5孔每孔滴加10μL LB肉汤，作为空白对照。将该96孔板37℃培养4h，用PerkinElmer全自动酶标仪测定每孔的荧光值，并用Graphpad prime5软件进行作图和统计分析。

[0104] 实验结果如图5所示，加了脱水四环素诱导以后，CSZ4LC2的荧光显著降低了3log值，当供体和受体菌混合以后，荧光增加了1个log，这增加的1个log值即接合子(获得pCSZ4-LUX的受体菌)所释放的荧光值。而未获得质粒的受体菌和空白对照则不表达荧光，说明本发明切实可行。

[0105] 经过脱水四环素诱导以后，CSZ4LC1的荧光显著降低了1log值，表明pCRISPR-LUX1抑制LUX基因簇表达效果不如pCRISPR-LUX。

[0106] 实施例4精油的筛选实验

[0107] 1.菌悬液制备

[0108] 将供体菌CSZ4LC2和受体菌E.coli C600，培养至生长对数期(OD600约为0.5)。

[0109] 2.精油的稀释

[0110] 将司盘和吐温(均购自天津大茂化学试剂厂)按照体积比1:1混合后用双蒸水稀释100倍后用作溶剂，溶解、稀释精油，每种精油均稀释10倍。所有精油购自广东顺德芳香世家天然产品制造有限公司。

[0111] 3.培养板的制备

[0112] 配制80mL半固体琼脂于锥形瓶中，高压灭菌后取出。

[0113] 将32个2mL EP管置于40℃金属浴中，严格控制温度，每个EP管加入1mL 50℃的半固体琼脂。

[0114] 实验组分别加入脱水四环素(终浓度200ng/mL)和10μL待检测精油；空白组和供体组分别加入1μL脱水四环素，使其终浓度为200ng/mL，不加精油。每个样品3个重复；贴好封板膜，置于4℃冰箱，待琼脂凝固且精油在琼脂中扩散。

[0115] 4.菌液洗脱

[0116] 吸取1.5mL供体菌CSZ4LC2于2mL EP管中，5500rpm离心4min，弃上清；再加入1mL PBS(Gibco公司)，涡旋混匀，5500rpm离心4min，弃上清，此步骤重复2次；加入1.5mL PBS重悬，涡旋混匀。

[0117] 5.混合培养

[0118] 分别吸取0.5mL受体菌和0.5mL PBS与0.5mL供体菌CSZ4LC2混合得到接合混合液，取10μL接合混合液分别加至实验组和空白组每孔中。0.5mL PBS与0.5mL供体菌CSZ4LC2按照体积比1:1的比例混合得到稀释混合溶液，供体组每孔加入10μL PBS和所述的稀释混合溶液，将96孔培养板置于37℃培养4h后，用酶标仪测定荧光值。

[0119] 通过比较实验组和空白组与供体菌组的荧光差值，按以下公式计算相对接合率，比较不同精油对质粒接合的抑制效果：

[0120] 相对接合率＝(ALU精油组-ALU供体)/(ALU空白组-ALU供体)×100％。

[0121] 6.结果分析

[0122] 表2不同精油对质粒接合影响效果统计图表

[0123]

[0124]

[0125] 本实施例表明虽然以上30种精油均能一定程度抑制质粒水平传播，但大多数虽有统计学意义但可能无实际临床意义。其中牛至、肉桂、月桂对质粒接合有明显的抑制效果。

[0126] 将以上有明显抑制效果的待选质粒抑制剂通过菌落计数的方法计算接合效率，并计算相对接合率。

[0127] 7.方法进一步验证

[0128] 将分别培养至生长对数期(OD600约为0.5)的供体菌CSZ4LC2和受体菌E.coli C600按体积比1：1混合得到供体菌、受体菌混合物。

[0129] 空白组每根反应管(1.5mL离心管)含0.5mL LB肉汤；实验组含0.49mL LB肉汤以及0.01mL步骤2中稀释10倍的精油。取0.5mL供体菌、受体菌混合物加至不同的反应管，配成
1mL反应体系，并使用涡旋混匀。每组设置3个生物学重复。

[0130] 将该接合孵育物涡旋混匀并放置于37℃培养箱静置培养4h，将孵育物分别涂布于：1)麦康凯琼脂培养基(含25μg/mL亚碲酸钠、250μg/mL利福平)筛选并计数接合子；2)涂布于麦康凯琼脂培养基(含25μg/mL亚碲酸钠)筛选并计数接合子。接合转移效率＝接合子菌落数/供体菌菌落数；相对接合率＝实验组接合率/对照组接合率×100％，相对接合率显著小于或等于10％该物质能够有效抑制质粒接合反应的发生。将菌落计数得到的结果同荧光法的接合加以对比，发现两者一致，说明本发明可行。

[0131] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。