一种羟基磷灰石涂层表面原位合成抗菌性磷酸银的水热灭菌方法

摘要

本发明公开了一种羟基磷灰石涂层表面原位合成抗菌性磷酸银的水热灭菌方法，包括如下步骤：将表面覆有羟基磷灰石涂层的基体置入容器内，向容器内加入乙酸银溶液，密封；对容器进行加热灭菌；加热灭菌后，从容器中取出覆有羟基磷灰石涂层的基体，在无菌环境下冲洗即可。本发明不仅实现了对覆有羟基磷灰石涂层的植入物进行灭菌目的，还同时在其表面合成了原位生长的磷酸银；使涂层具有持久的抗菌性能，阻止致病菌在其表面增殖和形成生物膜，降低感染几率，提高植入物的存活几率；操作步骤简单，使用常规灭菌设备，处理周期短，特别适合临床应用。

权利要求

1.一种羟基磷灰石涂层表面原位合成抗菌性磷酸银的水热灭菌方法，其特征在于：包括如下步骤，(1)将表面覆有羟基磷灰石涂层的基体置入容器内，向容器内加入乙酸银溶液，密封；

所述基体为钛基体，乙酸银溶液的浓度为0.0001～0.1mol/L，pH值为3.0～4.0；

(2)对容器进行加热灭菌；将容器置于压力蒸汽灭菌器内进行加热灭菌，灭菌时间为15～20分钟；

(3)加热灭菌后，从容器中取出覆有羟基磷灰石涂层的基体，在无菌环境下冲洗即可；

且上述灭菌环节为植入物的最终表面处理。

2.根据权利要求1所述的羟基磷灰石涂层表面原位合成抗菌性磷酸银的水热灭菌方法，其特征在于：所述步骤(1)的乙酸银的浓度为0.0001～0.01mol/L。

3.根据权利要求1所述的羟基磷灰石涂层表面原位合成抗菌性磷酸银的水热灭菌方法，其特征在于：所述步骤(1)中，加入的乙酸银溶液没过带有羟基磷灰石涂层的基体。

4.根据权利要求1所述的羟基磷灰石涂层表面原位合成抗菌性磷酸银的水热灭菌方法，其特征在于：所述步骤(1)中，羟基磷灰石涂层是采用等离子喷涂的方法制备的。

5.根据权利要求1所述的羟基磷灰石涂层表面原位合成抗菌性磷酸银的水热灭菌方法，其特征在于：步骤(3)为加热灭菌后，待需使用时再从乙酸银溶液中取出基体。

说明书

一种羟基磷灰石涂层表面原位合成抗菌性磷酸银的水热灭菌

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种羟基磷灰石的灭菌方法，特别是涉及一种等离子喷涂羟基磷灰石涂层表面原位合成抗菌性磷酸银的水热灭菌方法。

背景技术

[0002] 羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)具有优异的骨传导性，是牙种植体、人工关节等骨内植入表面生物涂层的最佳选择。制备羟基磷灰石涂层的方法很多，有仿生矿化、溶胶凝胶、水热合成等，其中，等离子喷涂法由于具有很高的生产效率，可以制备厚度较大、附着力较强的涂层而得以商业化，是目前在植入体表面制备羟基磷灰石涂层的主流方法。然而，HA在为骨生长提供良好支撑的同时，也为致病菌，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)，提供了良好的环境，特别是植入手术初期，创伤处存在局部免疫抑制，细菌更易在植入物HA涂层表面附着。一旦附着的细菌不能及时被去除，有可能发展成生物膜，这种生物膜有极强的耐药性，不仅会导致植入失败，还将引发复杂感染，对患者构成生命威胁。临床统计表明，65％的住院感染是由生物膜引起的，而其中具有普遍威胁性的便是由S.aureus引发的院内感染，(Potera C，Forging a link between biofilms and disease，Science，1999，283：1837-1839)。

[0003] 实践证明，通过净化环境在植入手术中实现细菌“零附着”的难度极大，而通过表面改性方法，使得植入物表面具有一定的抗菌性能才是避免生物膜形成的可行措施。银离子具有高效广谱抗菌性，且不会使致病菌和生物膜形成抗药性，已在临床抗菌治疗中得到广泛使用。鉴于此，在羟基磷灰石涂层中引入银元素，使之具有抗菌性颇受关注，目前的主要途径有：(1)利用HA晶体中的钙离子与硝酸银溶液中的银离子互换，实现载银(载银羟基磷灰石及制备方法，发明专利CN200810152897.4；邓城等，沉淀法与水热法合成载银羟基磷灰石及其抗菌性能[J].材料工程，2017(4)：113-120)(2)以HA为载体，掺杂纳米银颗粒，实现载银(一种纳米银、纳米氧化锌双相沉积掺锌纳米羟基磷灰石的制备方法及其所得材料，发明专利，CN201810376830.2；亚斯曼·胡西塔尔等，吡咯聚合调控脉冲电沉积制备球形羟基磷灰石和银纳米粒子复合涂层[J].高分子学报，2016(4)：528-537.)；(3)HA与银共喷涂(阮洪江，载银羟基磷灰石抗菌涂层体外抗菌性能及生物相容性研究[J].中国修复重建外科杂志，2009(2)：226-230.)；(4)HA与磷酸银化学共沉积(银-羟基磷灰石纳米复合材料的制备方法，发明专利CN200810028762.7)。上述途径虽然也能实现银的掺杂，但是都存在一定的缺点，如，离子交换法时间长，羟基磷灰石中银的负载量有限，且释放较快；纳米银颗粒的抗菌性不及同等量银离子更明显；共沉积法虽然生成具有持久抗菌性的磷酸银，但需要电场引导，且涂层与基体结合强度不足；掺银共喷涂降低HA结晶度等。

发明内容

[0004] 发明目的：本发明针对现有技术中的不足，提供一种羟基磷灰石涂层表面原位合成磷酸银的水热灭菌方法，制备方法简单，银负载量大，抗菌效果好，能够实现银离子的缓慢释放和持久的抗菌性，降低植入物表面细菌繁殖形成生物膜的风险。

[0005] 技术方案：本发明提供的羟基磷灰石涂层表面原位合成抗菌性磷酸银的水热灭菌方法，包括如下步骤：

[0006] (1)将表面覆有羟基磷灰石涂层的样品置入容器内，向容器内加入乙酸银溶液，密封；

[0007] (2)对容器进行加热灭菌；

[0008] (3)加热灭菌后，从容器中取出覆有羟基磷灰石涂层的样品，在无菌环境下冲洗即可。

[0009] 其中步骤(3)中，可以根据实际需要，将容器转送至手术室，植入前倒掉其中的溶液，用灭菌过的镊子夹出试样，用灭菌的去离子水反复冲洗后即可使用。

[0010] 进一步地，为了保证生物安全性，所述步骤(1)的乙酸银的浓度为0.0001～0.1mol/L。适宜的浓度值决定了羟基磷灰石涂层表面能否形成足够的磷酸银，进而是否能表现出优异的抗菌性能。

[0011] 优选地，所述步骤(1)的乙酸银的浓度为0.0001～0.01mol/L。当乙酸银浓度低于0.0001mol/L时，羟基磷灰石涂层表面不能形成足够的磷酸银而未能表现出优良的抗菌性；
而当乙酸银浓度高于0.01mol/L时，在形成磷酸银的同时会形成银单质，而抗菌性并没有明显改善，从生物安全性、抗菌效果、方便配制、降本增效等多方面考虑，浓度宜控制在0.0001～0.01mol/L之间。

[0012] 进一步地，所述步骤(1)的乙酸银溶液的pH值为3.0～4.0。可以采用乙酸调节乙酸银溶液的pH值，以促进后续涂层表面原位合成抗菌性磷酸银。当溶液pH值高于4.0时，银离子会从溶液中还原出来，形成单质沉积在HA表面；而pH低于3.0时，则会导致HA涂层发生大量溶解，起到破坏作用。因此控制适宜的pH值，决定了羟基磷灰石涂层表面能够形成足够的磷酸银，进而表现出优良的抗菌性。

[0013] 进一步地，步骤(2)中的容器置于压力蒸汽灭菌器内进行加热灭菌；由于临床高压蒸汽灭菌操作有一定的规范，下排气式压力蒸气灭菌器是普遍应用的灭菌设备，压力升至103.4kPa(1.05kg/cm2)，温度达121.3℃，维持15～20分钟，可达到灭菌目的。

[0014] 优选地，所述步骤(1)中，加入的溶液没过带有羟基磷灰石涂层的样品，且不超过玻璃容器总容量的1/3为宜。溶液没过样品可以使得涂层表面均原位合成抗菌性磷酸银，提高样品的整体抗菌性能。

[0015] 优选地，所述步骤(1)中，羟基磷灰石涂层是通过等离子喷涂的方法制备的。该方法是商业化的在金属植入物表面制备羟基磷灰石涂层的方法，应用较为广泛，等离子喷涂得到的羟基磷灰石涂层具有较好的附着力。

[0016] 优选地，步骤(3)为加热灭菌后，待需使用时再从乙酸银溶液中取出基体。取出基体前使其保存在乙酸银溶液中，可以使基体继续保存在无菌环境中，且能防止污染，直至植入手术或者实验需要。

[0017] 发明原理：由于所有植入物在植入人体前均需灭菌处理，本发明将灭菌环节看作对植入物的最终表面处理，利用临床常规灭菌设备实现了在羟基磷灰石涂层表面负载原位生长的磷酸银，表现出了良好的抗菌性能。由于等离子喷涂HA涂层具有良好的附着力，本发明对等离子喷涂羟基磷灰石涂层表面进行改性，使之负载原位生长的磷酸银，可实现银离子的缓慢释放和持久抗菌性。在对带羟基磷灰石涂层植入物进行灭菌的同时，在其表面合成原位生长的磷酸银，实现银离子的缓慢释放和持久的抗菌性，降低植入物表面细菌繁殖形成生物膜的风险。

[0018] 有益效果：本发明与现有技术相比，

[0019] (1)本发明将灭菌环节看作对植入物的最终表面处理，利用临床常规灭菌设备就实现了在羟基磷灰石涂层上负载原位生长的磷酸银，并表现出了良好的抗菌性能；

[0020] (2)本发明提供的方法不仅实现了对带羟基磷灰石涂层的植入物进行灭菌目的，同时还在其表面合成了原位生长的磷酸银；

[0021] (3)原位生长的磷酸银难溶于水，可以实现银离子的缓慢释放，使羟基磷灰石涂层具有持久的抗菌性能，阻止致病菌在其表面增殖和形成生物膜，降低感染几率，提高植入物的存活几率；

[0022] (4)本发明所提供的方法操作步骤十分简单，使用诊所、医院常规灭菌设备，处理周期短，因而特别适合临床应用。

附图说明

[0023] 图1是采用等离子喷涂羟基磷灰石涂层的XRD图；

[0024] 图2是采用等离子喷涂羟基磷灰石涂层的FESEM图；

[0025] 图3是采用水热灭菌处理后的等离子喷涂羟基磷灰石涂层的XRD图；

[0026] 图4是采用水热灭菌处理后的等离子喷涂羟基磷灰石涂层的FESEM图；

[0027] 图5是采用高压蒸汽灭菌和本发明方法灭菌HA涂层试样在金黄色葡萄球菌培养皿中的抑菌圈照片。

具体实施方式

[0028] 下面结合实施例和对比例对本发明进一步的描述。

[0029] 实施例1：

[0030] 首先对钛基体的表面进行等离子喷涂，使得钛基体表面覆有羟基磷灰石涂层，涂层厚度约为80μm。

[0031] 将表面覆有等离子喷涂HA涂层的钛基体试样，试样大小为20mm×10mm×2.5mm，放入200ml的橙色盖子螺口试剂瓶中，向试剂瓶中注入50ml浓度为0.001mol/L，pH值为3.5的乙酸银溶液，用盖子将试剂瓶密封。乙酸银溶液采用分析纯冰乙酸调整到pH值3.5。

[0032] 然后，将装有试样和溶液的试剂瓶放入普通压力蒸汽灭菌器内，加盖顶盖，拧紧螺栓，灭菌温度设置为121.3℃，灭菌时间设定为20分钟。灭菌结束，待灭菌器内温度下降到50℃以下后，打开灭菌器，取出试剂瓶。将装有试样的容器转送至手术室或实验室，使用前，倒掉溶液，用灭菌过的镊子夹出试样，用无菌的去离子水反复冲洗数遍即可使用。

[0033] 用X射线衍射对灭菌前后涂层的化学成分进行分析，结果如图1和图3所示。如图可以看出，等离子喷涂HA涂层主要由HA和少部分氧化钙(CaO)组成；经过本实施例的方法灭菌后，HA涂层中出现了磷酸银的衍射峰。

[0034] 如图2、4所示分别为采用水热灭菌处理前、后的等离子喷涂羟基磷灰石涂层的FESEM图，用场发射扫描电子显微镜在高倍下观察可以看出，原HA涂层晶粒表面光滑，而经过本方法水热处理后，晶粒表面生成了橘皮一样的粗糙形貌，是由约30nm大小的颗粒密集排布而成。由于磷元素由HA提供，结合XRD和FESEM结果，可以判定磷酸银在HA表面原位生长。

[0035] 金黄色葡萄球菌抑菌试验：在含有琼脂板的培养皿中滴加100μL浓度为1x106CFUml-1的金黄色葡萄球菌悬浮液，用无菌涂布器涂布均匀；将试样正面朝下置于接种过细菌的琼脂板上，使试样和琼脂板有效接触，且整个操作在标准无菌实验台中完成。将放置试样的培养基置于37℃的培养箱中培养，在48h后用数码相机拍照，记录抑菌圈面积，结果如图5所示。其中，图5中标记1#和2#为蒸汽灭菌的试样，蒸汽灭菌的具体温度为121.3℃，时间20min；3#和4#为本实施例提供的方法进行灭菌的试样。可以看出，蒸汽灭菌HA试样周围形成了大量细菌群落，而由于磷酸银的原位生成，HA涂层对金黄色葡萄球菌表现出了强烈的抗菌性，在培养48小时后仍然维持了两倍于试样面积的抑菌圈。

[0036] 安瓿法灭菌效果检验试验：准备两支装有4ml RAVEN PROSPORE自含式生物指示剂(麦森公司)的安瓿，其中一支安瓿与试样一起放入蓝盖瓶，然后进行水热灭菌。灭菌后将该安瓿垂直放置于55～60℃的培养箱内，同时另一支未经灭菌的安瓿做对照以确认芽孢的活性。培养48小时后对照安瓿颜色由紫色向黄色变化，并出现浑浊，而灭菌安瓿的颜色没有发生变化，也没有出现浑浊，这表明本发明所述方法的灭菌效果很彻底。

[0037] 实施例2：

[0038] 本实施例的基本步骤与实施例1基体相同，不同之处在于，乙酸银溶液pH值为4.0。HA外观无明显变化，X射线衍射结果表明，HA表面有少量磷酸银生成，抑菌圈实验表明，在培养24小时形成了两倍于试样面积的抑菌圈，在培养48小时后仍然维持了两倍于试样面积的抑菌圈。安瓿法检验结果表明，灭菌效果很彻底。

[0039] 实施例3

[0040] 步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，乙酸银溶液pH值为3.0。HA外观无明显变化，X射线衍射结果表明，HA表面有少量磷酸银生成，抑菌圈实验表明，在培养24小时形成了两倍于试样面积的抑菌圈，在培养48小时后仍然维持了两倍于试样面积的抑菌圈。安瓿法检验结果表明，灭菌效果很彻底。

[0041] 实施例4

[0042] 步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，乙酸银浓度为0.01mol/L，pH值为3.5。HA表面变成浅黄色，X射线衍射结果表明有磷酸银生成，且衍射峰较强，抑菌圈实验表明，在培养24小时形成了两倍于试样面积的抑菌圈，在培养48小时后仍然维持了两倍于试样面积的抑菌圈，但与实施例1相比，其抑菌圈面积并未明显扩大。安瓿法检验结果表明，灭菌效果很彻底。

[0043] 实施例5

[0044] 步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，乙酸银浓度为0.0001mol/L，pH值为3.5。HA表面无明显颜色变化，X射线衍射结果表明有很少量磷酸银生成，衍射峰很弱，抑菌圈实验表明，在培养24小时形成了两倍于试样面积的抑菌圈，但与实施例1相比，培养48小时后抑菌圈面积有所减小。安瓿法检验结果表明，灭菌效果很彻底。

[0045] 对比例1

[0046] 步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，乙酸银溶液浓度为0.1mol/L。HA涂层表面呈现金黄色，X射线衍射结果发现大量磷酸银生成，同时还出现了明显的单质银的衍射峰；抑菌圈实验表明，在培养24小时形成两倍于试样面积的抑菌圈，与实施例1相比，培养48小时后抑菌圈面积没有明显变化。安瓿法检验结果表明，灭菌效果很彻底。

[0047] 对比例2

[0048] 步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，乙酸银溶液浓度为0.00001mol/L。X射线衍射结果并未发现磷酸银生成；抑菌圈实验表明，在培养24小时后没有形成抑菌圈，但48小时后也没有形成抑菌圈。安瓿法检验结果表明，灭菌效果很彻底。

[0049] 对比例3

[0050] 步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，乙酸银溶液pH为4.5。X射线衍射结果发现涂层中产生了单质银，而没有磷酸银生成。安瓿法检验结果表明，灭菌效果很好。抑菌圈实验表明，在培养24小时形成了两倍于试样面积的抑菌圈，但培养48小时后抑菌圈面积有所减小。安瓿法检验结果表明，灭菌效果很彻底。

[0051] 对比例4

[0052] 步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，乙酸银溶液pH为2.5。X射线衍射结果发现涂层中虽然有磷酸银生成，但HA衍射信号明显减弱，结晶度下降，表明HA发生了明显的溶解。抑菌圈实验表明，在培养24小时形成了两倍于试样面积的抑菌圈，在培养48小时后仍然维持了两倍于试样面积的抑菌圈。但安瓿法检验结果表明，灭菌效果很彻底。

[0053] 将上述实施例及对比例的具体参数汇总见下表，可以看出本发明提供的方法能够实现等离子喷涂HA涂层的有效灭菌；且灭菌介质乙酸银溶液的浓度和pH值则决定了HA表面能否形成足够磷酸银，进而能否表现出优良的抗菌性能。

[0054] 表1实施例1～5及对比例1～4的结果汇总

[0055]

[0056]

[0057] 实施例6

[0058] 本实施例的步骤与对比例1基本相同，不同之处在于乙酸银溶液的浓度为0.02mol/L。试验结果与对比例1相符。

[0059] 实施例7

[0060] 本实施例的步骤与对比例1基本相同，不同之处在于乙酸银溶液的浓度为0.08mol/L。试验结果与对比例1相符。

[0061] 实施例8

[0062] 本实施例的步骤与对比例1基本相同，不同之处在于乙酸银溶液的浓度为0.05mol/L。试验结果与对比例1相符。

[0063] 实施例9

[0064] 本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处在于乙酸银溶液的浓度为0.005mol/L。试验结果与实施例1相符。

[0065] 实施例10

[0066] 本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处在于乙酸银溶液的浓度为0.0008mol/L。试验结果与实施例1相符。

[0067] 实施例11

[0068] 本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处在于乙酸银溶液的pH值为3.1。试验结果与实施例1相符。

[0069] 实施例12

[0070] 本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处在于乙酸银溶液的pH值为3.9。试验结果与实施例1相符。

[0071] 实施例13

[0072] 本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处在于乙酸银溶液的pH值为3.3。试验结果与实施例1相符。