棘孢木霉菌-紫花苜蓿联合修复重金属污染土壤的方法

摘要

本发明公开了一种棘孢木霉菌‑紫花苜蓿联合修复重金属污染土壤的方法；通过棘孢木霉菌与紫花苜蓿协同吸附土壤中的重金属来修复被污染的土壤。将能在紫花苜蓿根际定殖的棘孢木霉菌GDSF1009，制备成颗粒剂，施用于紫花苜蓿根际。由于木霉菌颗粒剂能刺激苜宿根系，提高其吸附重金属能力，因此两者形成了高效吸附重金属的修复生物复合体。重金属在植株体内吸附效率达51％‑59％，土壤中重金属含量降低58％‑60％。同时通过对修复植物材料的清洁化，可将其循环再利用。该技术不仅可以有效降低土壤重金属含量，还能恢复土壤微生态，增加土壤有益微生物并提高土壤肥力，是一项经济有效且应用前景广阔微生物‑植物联合修复土壤新技术。

权利要求

1.一种修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，采用棘孢木霉菌与苜蓿联合修复重金属污染土壤；所述棘孢木霉菌为棘孢木霉菌GDSF1009；所述苜蓿为紫花苜蓿；所述重金属污染土壤含汞、铅、锌、铜中的一种或几种；

施用的棘孢木霉菌颗粒剂是通过如下方法制备而得的：将棘孢木霉菌液体发酵液48-

52wt％、玉米粉13.625-17.625wt％、硅藻土14.75-20.75wt％、麦麸13.625-17.625wt％、腐殖酸0.4-0.6wt％、柠檬酸0.4-0.6wt％搅拌均匀，挤压造粒，干燥即得。

2.根据权利要求1所述的修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，每亩重金属污染土壤苜蓿的播种量为1.0-3.0kg，棘孢木霉菌颗粒剂的施用量为5-20kg。

3.根据权利要求2所述的修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述棘孢木霉菌颗粒剂与有机肥混合后施用。

4.根据权利要求3所述的修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述有机肥的施用量为每亩50-150kg。

5.根据权利要求1所述的修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述棘孢木霉菌液体发酵液是通过包含如下方法制备而得的：发酵培养基在121℃下灭菌30-60min，接入重量比例0.5-2.0％棘孢木霉菌种子菌种，控制发酵温度为25-35℃，发酵时间5-10d，直到发酵液变成绿色即可。

6.根据权利要求5所述的修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述发酵培养基每

221.5709kg含：玉米粉5-15kg、水200-220kg、磷酸二氢钾760-772g、硫酸镁80-120g、硫酸锰

0.4-0.6g、硫酸锌0.3-0.5g、硝酸钠280-288g、硫酸铵210-230g、氯化钠180-220g。

7.根据权利要求5所述的修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述棘孢木霉菌种子菌种是通过如下方法制备而得的：棘孢木霉菌接种于PDA培养基培养得到活化的棘孢木霉菌种；在液体发酵菌种培养基接入活化的棘孢木霉菌种发酵获得所述木霉菌菌种。

8.根据权利要求1所述的修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，还包括将修复重金属污染土壤后的苜蓿秸秆经过依次洗脱重金属处理、中性化处理后与木霉菌颗粒剂混合，堆制，覆膜，发酵制成秸秆菌肥的步骤；所述洗脱重金属处理为采用0.1mol/L-0.5mol/L浓度的柠檬酸液处理所述苜蓿秸秆30-50小时；所述中性化处理为将洗脱重金属后的苜蓿秸秆用清水浸泡2-3次，每次1-2小时。

说明书

棘孢木霉菌-紫花苜蓿联合修复重金属污染土壤的方法

技术领域

[0001] 本发明属于土壤修复领域，具体涉及一种棘孢木霉菌与紫花苜蓿联合修复重金属污染土壤的方法。

背景技术

[0002] 工业污染、化肥和农药的过量使用导致土壤污染日益严重，已成为严重制约农业生产问题。为了实现农业可持续发展，治理被污染的土攘是修复及改善生态环境的重大课题。

[0003] 目前，常见的重金属污染土壤修复技术主要有三个方面：物理修复、化学修复和微生物修复、植物修复、微生物-植物联合修复。物理修复法就是采用一定的技术和手段，将污染物从土壤中分离出来使土壤恢复可利用价值的方法。一般的土壤修复物理修复法主要有以下几种：直接换土法、热化法修复、玻璃化修复方法、电极驱动修复法。物理修复成本高，可操作性差，难以对大面积的土壤实现修复。化学修复是指向污染土壤中添加钝化剂，使重金属由活性向稳定化形态转化，以降低重金属的迁移和生物可利用性。然而化学淋洗容易导致土壤酸化，破化土壤物理结构，导致土壤肥力的流失，而且化学修复还容易造成地下水等环境的二次污染。生物修复包括富集植物吸附重金属和微生物吸附重金属，主要是通过产生有机酸等螯合剂固化重金属。目前国际上多数是单一利用超富集植物，如香根草，蜈蚣草，鳞苔草，还有印度芥菜(Brassica juncea)等。苜蓿是多年生、具有固氮功能的绿肥豆科植物，因此利用苜蓿作为修复性植物，除了具有吸附重金属作用，还具有涵养土壤的功能。植物富集的方法经济实用，并可改善生态环境，但单纯的植物富集对重金属污染土壤的修复难以达到很高效率。修复土壤的微生物主要是通过自身的代谢系统和亚细胞富集重金属，例如木霉菌可以通过嘌呤系统吸附重金属Cu，木霉菌液胞也能富集重金属(Fu Kehe等，
2014)，同时木霉菌产生的有机酸也能固化或螯合重金属。不仅如此，木霉菌还有降解一系列的有机磷农药和减少土壤盐渍化等修复功能。研究表明：深绿木霉菌F6孢子悬浮液处理过的芥菜幼苗对Cd和Ni的吸附效率显著提高(LixiangCao等，2008)。因此微生物与富集植物联合使用可产生多种修复土壤综合效应。

[0004] 专利CN109174937A提出了以复合菌剂配合有机肥和菊花的联合修复系统，修复重金属污染的土壤。但该专利并没有提出处理富集了重金属的植物的可行方法，也无法将种植的植物作为绿肥还田以涵养土壤。本发明提供了后续处理富集重金属植物并将其作为绿肥还田的有效方法，不仅可以有效降低土壤重金属含量，还能恢复土壤微生态，增加土壤有益微生物并提高土壤肥力，是一项经济有效且应用前景广阔微生物-植物联合修复土壤新技术。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种棘孢木霉菌与紫花苜蓿联合修复重金属污染土壤的方法。该方法是通过一种棘孢木霉菌GDSF1009(《植物保护学报》,2015,42(6):1030-1035)保藏编号：CGMCC 9512)的颗粒剂与苜蓿根系特异互作，提高苜蓿吸附重金属的效率，同时将吸附重金属的苜蓿秸秆经有机酸清洁化洗脱或固化，再经木霉菌产生的纤维素酶进行降解；制备成秸秆菌肥。

[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

[0007] 本发明涉及一种修复重金属污染土壤的方法，采用棘孢木霉菌与苜蓿联合修复重金属污染土壤。

[0008] 本发明中，所述棘孢木霉菌为棘孢木霉菌GDSF1009；所述苜蓿为紫花苜蓿。

[0009] 作为本发明的一个实施方案，每亩重金属污染土壤苜蓿的播种量1.0-3.0kg，棘孢木霉菌颗粒剂的施用量为5-20kg。在该配合剂量下，棘孢木霉菌颗粒剂适应用于促进(紫花)苜蓿生长，提高(紫花)苜蓿吸附土壤重金属的能力。

[0010] 作为本发明的一个实施方案，所述棘孢木霉菌颗粒剂与有机肥混合后施用。

[0011] 所述有机肥的施用量为每亩50-150kg。

[0012] 本发明中，所述棘孢木霉菌颗粒剂是通过如下方法制备而得的：将棘孢木霉菌液体发酵液48-52wt％、玉米粉13.625-17.625wt％、硅藻土14.75-20.75wt％、麦麸13.625-17.625wt％、腐殖酸0.4-0.6wt％、柠檬酸0.4-0.6wt％搅拌均匀，挤压造粒，干燥即得。

[0013] 优选的，所述干燥是在47℃干燥1.5h。

[0014] 所述棘孢木霉菌液体发酵液是通过包含如下方法制备而得的：发酵培养基在121℃下灭菌30-60min，接入重量比例(与发酵培养基的重量比)0.5-2.0％棘孢木霉菌种子菌种，控制发酵温度为25-35℃，发酵时间5-10d，直到发酵液变成绿色即可。

[0015] 所述发酵培养基每221.5709kg含：玉米粉5-15kg、水200-220kg、磷酸二氢钾760-772g、硫酸镁80-120g、硫酸锰0.4-0.6g、硫酸锌0.3-0.5g、硝酸钠280-288g、硫酸铵210-
230g、氯化钠180-220g。

[0016] 优选的，该发酵培养基制备时，先将无机盐磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硝酸钠、硫酸铵、氯化钠成分溶入水中，再将玉米粉与水充分混合后制成发酵培养基。

[0017] 所述棘孢木霉菌种子菌种是通过如下方法制备而得的：棘孢木霉菌接种于PDA培养基培养得到活化的棘孢木霉菌种；在液体发酵菌种培养基接入活化的棘孢木霉菌种发酵获得所述木霉菌菌种。

[0018] 优选的，所述液体发酵菌种培养基成分：

[0019] 马铃薯200克

[0020] 葡萄糖20g

[0021] 水1L

[0022] 调pH值为6-8。

[0023] 优选的，所述培养具体为：将棘孢木霉菌GDFS1009接种于PDA培养基平板中，28℃培养箱中，倒置培养2-3d。

[0024] 优选的，所述发酵具体为：在250毫升三角瓶中，每瓶装100ml液体发酵菌种培养基，在121℃下灭菌30min，接入活化的棘孢木霉菌种，每瓶菌饼5个，摇床转速为180rpm，发酵温度28℃，发酵时间为3d，得到液体发酵种子菌，即所述棘孢木霉菌种子菌种。

[0025] 作为本发明的一个实施方案，本发明的方法还包括将修复重金属污染土壤后的苜蓿秸秆经过依次洗脱重金属处理、中性化处理后与木霉菌颗粒剂混合，堆制，覆膜，发酵制成秸秆菌肥的步骤。

[0026] 优选的，所述苜蓿秸秆为收割吸附重金属的苜蓿茎叶和和根部，切成的小段(优选长度为0.5-2cm)。

[0027] 优选的，所述洗脱重金属处理为采用0.1mol/L-0.5mol/L浓度的柠檬酸液处理所述苜蓿秸秆30-50小时。

[0028] 优选的，所述中性化处理为将洗脱重金属后的苜蓿秸秆用清水浸泡2-3次，每次1-2小时。

[0029] 优选的，中性化处理后的苜蓿秸秆与棘孢木霉菌颗粒剂的混合比为80-120：1w/w。

[0030] 优选的，所述棘孢木霉菌颗粒剂具有纤维素酶活性(CMC)酶活性为4.0U.g-1以上。

[0031] 优选的，所述堆制，覆膜，发酵具体为：在地表堆制8-12cm秸秆层，覆膜(具通气孔)，25℃-27℃下发酵20-30d。

[0032] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0033] 1)与单一植物的修复系统相比，不仅显著提高了植物吸附重金属的能力，增加土壤有益微生物，恢复土壤微生态系统；

[0034] 2)与已有的微生物-植物复合修复系统相比，提供了后续处理富集重金属植物并将其作为绿肥还田的有效方法，不仅能有效处理富集了重金属的植物，还能将其还田提高土壤肥力。

附图说明

[0035] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

[0036] 图1为在浦东试验地种植5个月后，紫花苜蓿及油菜体内重金属平均含量示意图。

具体实施方式

[0037] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

[0038] 实施例1

[0039] 地点：金山东张堰镇桑园村电镀厂试验地

[0040] 本实施例涉及一种棘孢木霉菌与苜蓿联合修复重金属污染土壤的方法。

[0041] 首先提供一种木霉菌颗粒剂的制备方法，具体包括如下步骤：

[0042] 1、平板菌种：将棘孢木霉菌GDFS1009接种于PDA培养基平皿中，28℃培养箱中；倒置培养2-3天。

[0043] PDA培养基：200克土豆切成1cm2的小块，小火煮30分钟，4层纱布过滤，保留汁液；加入20克葡萄糖，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。

[0044] 2、液体菌种的制备：取马铃薯200克、葡萄糖20克、水1升，配制成二级发酵培养液(即液体发酵菌种培养基)，调pH值为6-8，分装在250毫升三角瓶中100毫升，在121℃下灭菌30分钟，接入平板菌种(PDA上培养，菌落边沿用7mm打孔器取菌饼，每瓶菌饼5个，摇床转速为180转/分，发酵温度28℃，发酵时间为3天，得到大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子液体菌种。

[0045] 3、木霉菌液体发酵液制备：发酵培养基成分为：玉米粉10千克，水210千克、磷酸二氢钾766克、硫酸镁100克、硫酸锰0.5克、硫酸锌0.4克、硝酸钠284克、硫酸铵220克、氯化钠200克，先将无机盐(磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硝酸钠、硫酸铵、氯化钠)溶入水中，再将培养料(玉米粉)与水充分混合后制成固体发酵培养基，固体发酵培养基装入300升发酵罐中，在121℃下灭菌30～60分钟，接入重量比例0.5％的二级菌种，控制发酵温度为28℃，发酵时间7天，至培养料变成绿色即木霉菌液体发酵液；

[0046] 4、木霉菌颗粒剂制备：将质量比为：木霉菌液体发酵液50wt％、玉米粉15.625wt％、硅藻土17.75wt％、麦麸15.625wt％、、腐殖酸0.5wt％，柠檬酸0.5wt％，使用搅拌机搅拌均匀，造粒机挤压造粒后，干燥机47℃干燥1.5小时，成品即为木霉菌颗粒剂。

[0047] 5、土壤重金属污染背底检测：每三方机构，按国家标准方法检测；

[0048] 6、修复土壤实验组处理方法：

[0049] 紫花苜蓿WL525HQ(北京正道生态科技有限公司)。每亩土地播种1.5kg紫花苜蓿种子，同时施用有机肥(上海光明荷斯坦牧业有限公司提供)90kg和木霉菌颗粒剂10kg。待紫花苜蓿成熟后采收。

[0050] 7、修复土壤对照组处理方法：

[0051] 空白对照组：每亩只播种1.5kg紫花苜蓿种子

[0052] 木霉粉剂对照组：每亩播种1.5kg紫花苜蓿种子，同时施用木霉粉剂(山东泰诺药业有限公司提供)5kg；

[0053] 有机肥对照组：每亩播种1.5kg紫花苜蓿种子，同时施用有机肥(上海光明荷斯坦牧业有限公司提供)90kg；

[0054] 8、土壤修复效果检测；

[0055] 土样的处理：以五点取样法在各处理地块采集深度为15-20cm深度的土壤样品，85℃下烘干至恒重，磨碎过100目筛装袋备用。称取一定量(0.025g左右)的土壤样品，采用盐酸-硝酸-高氯酸湿法消解样品，电感耦合等离子体发射光谱仪(美国珀金埃尔默PE Optima 7000)分析检测土壤中的重金属含量。所获得的数据用SPSS20.0软件进行数理统计分析。

[0056] 计算方法：

[0057] 土壤重金属下降率(％)＝处理前土壤中重金属含量—处理后土壤中重金属含量)/处理前重金属在土壤中的含量

[0058] 土壤重金属下降提高率(％)＝(对照组重金属含量—处理组重金属含量)/对照组重金属含量

[0059] 处理土壤12月后土壤重金属平均下降40％以上(表1)。

[0060] 表1、木霉菌剂和有机肥处理土壤重金属下降率

[0061]

[0062] 注：根据土壤中的实测值计算。

[0063] 实施例2

[0064] 地点：浦东区合庆镇工厂电镀厂试验地

[0065] 本实施例涉及一种棘孢木霉菌与苜蓿联合修复重金属污染土壤的方法。

[0066] 首先提供一种木霉菌生物颗粒剂的制备方法，具体包括如下步骤：

[0067] 1、平板菌种：将棘孢木霉菌GDFS1009接种于PDA培养基平皿中，28℃培养箱中，倒置培养2-3天；

[0068] PDA培养基：200克土豆切成1cm2的小块，小火煮30分钟，4层纱布过滤，保留汁液；加入20克葡萄糖，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟；

[0069] 2、液体菌种的制备：取马铃薯200克、葡萄糖20克、水1升，配制成二级发酵培养液，调pH值为6-8，分装在250毫升三角瓶中100毫升，在121℃下灭菌30分钟，接入平板菌种，摇床转速为180转/分，发酵温度28℃，发酵时间为3天，得到大量发散的絮状菌丝及分散的分生孢子液体菌种；

[0070] 3、木霉菌液体发酵液制备：发酵培养基成分为：玉米面10千克，水210千克、磷酸二氢钾766克、硫酸镁100克、硫酸锰0.5克、硫酸锌0.4克、硝酸钠284克、硫酸铵220克、氯化钠200克，先将无机盐溶入水中，再将培养料与水充分混合后制成固体发酵培养基，固体发酵培养基装入300升发酵罐中，在121℃下灭菌30～60分钟，接入重量比例0.5％的二级菌种，控制发酵温度为28℃，发酵时间7天，至培养料变成绿色即木霉菌液体发酵液；

[0071] 4、木霉菌颗粒剂制备：将质量比为：木霉菌液体发酵液50wt％、玉米粉15.625wt％、硅藻土68.75wt％、麦麸15.625wt％、腐殖酸0.5wt％，柠檬酸0.5wt％，使用搅拌机搅拌均匀，造粒机挤压造粒后，干燥机47℃干燥1.5小时，成品即为木霉菌颗粒剂。

[0072] 5、修复土壤实验组处理方法：

[0073] 紫花苜蓿WL525HQ(北京正道生态科技有限公司)。每亩土地播种1.5kg紫花苜蓿种子，木霉菌颗粒剂10kg。待紫花苜蓿成熟后采收。

[0074] 6、修复土壤对照组处理方法：

[0075] 油菜CK组：油菜(沪油6号)。每亩土地播种0.6kg油菜种子，待油菜成熟后采收；

[0076] 油菜+木霉颗粒剂组：油菜(沪油6号)。每亩土地播种0.6kg油菜种子，木霉菌颗粒剂10kg。待油菜成熟后采收

[0077] 苜蓿CK组：紫花苜蓿WL525HQ(北京正道生态科技有限公司)。每亩土地播种1.5kg紫花苜蓿种子。待紫花苜蓿成熟后采收。(实验步骤5-6所有处理中均施用一样量的有机肥)[0078] 7、种植5个月后采收紫花苜蓿和油菜检测其体内重金属含量，处理方法如下：

[0079] 采集的不同处理的植物样品，用蒸馏水冲洗干净，以吸水纸吸干其表面水分，小心分成根、茎叶两部分，放入120℃烘箱中杀青后，在85℃恒温烘箱内烘干24h。烘干后的植物样品经粉碎机粉碎，过100目筛，称重0.03g左右，装袋备用。采用盐酸-硝酸-高氯酸湿法消解样品，电感耦合等离子体发射光谱仪(美国珀金埃尔默PE Optima 7000)分析检测植物样品中的重金属含量。所获得的数据用SPSS20.0软件进行数理统计分析。

[0080] 见图1。苜蓿体内重Cu、Zn这两种重金属积累量高于对照组120.15％、256.82％。油菜体内Cu、Zn这两种重金属积累量高于对照组71.51％、190.43％。

[0081] 实施例3

[0082] 本实施例涉及一种棘孢木霉菌与苜蓿联合修复重金属污染土壤后制备秸秆菌肥的方法。包括如下步骤：

[0083] 1、收割苜蓿秸秆：吸附重金属的苜蓿茎叶和和根部(将苜蓿秸秆用粉碎机切成长度为1cm小段)；

[0084] 2、洗脱重金属：采用0.1mol/L-0.5mol/L等不同浓度柠檬酸液处理苜蓿根、茎段组织40h，重金属洗脱率达到40％以上(表2)。并且，秸秆清洁处理池池(边长×深度：2m×1m)，盛入0.5mol工业用柠檬酸100kg,可反复应用。

[0085] 表2、柠檬酸浸泡后苜蓿根和茎部重金属锌洗脱效果

[0086]

[0087] 3、苜蓿秸秆中性化处理：经过有机酸液洗脱重金属的苜蓿秸秆，用清水浸泡2-3次，每次1-2小时，苜蓿组织内的重金属富集水平明显低于未处理前80％以上，pH6-7。

[0088] 4、准备具有纤维素酶活性(CMC)且酶活性为4.0U.g-1以上木霉菌颗粒剂；

[0089] 5、苜蓿秸秆降解：清洁后的苜蓿秸秆段与木霉菌颗粒剂混合(100：1w/w)，在地表堆制10cm秸秆层，覆膜(具通气孔)，25℃-27℃下发酵20-30d,制备成秸秆菌肥。

[0090] 综上所述，本发明通过棘孢木霉菌与紫花苜蓿协同吸附土壤中的重金属来修复被污染的土壤。将能在紫花苜蓿根际定殖的棘孢木霉菌GDSF1009，制备成颗粒剂，施用于紫花苜蓿根际。由于棘孢木霉菌颗粒剂能刺激苜宿根系，提高其吸附重金属能力，因此两者形成了高效吸附重金属的修复生物复合体。重金属在植株体内吸附效率达51％-59％，土壤中重金属含量降低58％-60％。同时通过对修复植物材料的清洁化，可将其循环再利用。该技术不仅可以有效降低土壤重金属含量，还能恢复土壤微生态，增加土壤有益微生物并提高土壤肥力，是一项经济有效且应用前景广阔微生物-植物联合修复土壤新技术。

[0091] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。