一种植物microRNA表达载体、构建方法及应用

摘要

本发明涉及一种载体的构建方法，特别涉及一种植物microRNA表达载体、构建方法及应用，用F/R1引物和F/R2引物分别克隆靶基因启动子序列和下游含一段microRNA结合的靶基因启动子序列，通过Nco Ⅰ/Nco Ⅰ双酶切、T4DNA连接酶连接的方法，分别替换pGFPGUSplus载体上GFP上游的35S序列，构建成两种载体，1#载体miRNA靶基因启动子驱动GFP，2#载体microRNA结合靶基因启动子序列驱动GFP，选取两个载体转化的转基因株系，观察主根根尖分生组织区域的GFP信号，对比分析GFP信号，可清晰展示植物microRNA对其靶基因调控前后的表达模式，本发明简化了常规的载体构建方法的操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。

权利要求

1.一种植物microRNA表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

针对靶基因启动子序列设计引物组合F/R1；用F/R1引物组合克隆靶基因启动子序列，如SEQ ID NO：4第36-2098位所示，测序验证，将测序正确的扩增片段通过Nco Ⅰ/Nco Ⅰ双酶切、T4 DNA连接酶连接的方法连接到pGFPGUSplus载体上，即用克隆的靶基因启动子序列替换pGFPGUSplus载体上的GFP上游的35S序列，验证片段连接至pGFPGUSplus载体的方向，正向连接至pGFPGUSplus载体的即为构建成功的1#载体，靶基因启动子驱动GFP；

针对下游含目的microRNA的靶基因启动子序列设计引物组合F/R2；用F/R2引物组合克隆下游含microRNA识别结合的靶基因序列的靶基因启动子序列，如SEQ ID NO：5第36位-

2119位所示，测序验证，对测序正确的扩增片段通过Nco Ⅰ/Nco Ⅰ双酶切、T4 DNA连接酶连接的方法连接到pGFPGUSplus载体上，即用下游含microRNA识别结合的靶基因序列的靶基因启动子序列替换pGFPGUSplus载体上的GFP上游的35S序列，进一步验证片段连接至pGFPGUSplus载体的方向，正向连接至pGFPGUSplus载体的即为构建成功的2#载体，下游含microRNA识别结合的靶基因序列的靶基因启动子驱动GFP。

2.根据权利要求1所述构建方法构建得到的1#和2#载体。

3.根据权利要求2所述的载体在分析植物microRNA对其靶基因调控模式的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物F序列如SEQ ID NO：1所示；引物R1序列如SEQ ID NO：2所示；引物R2序列如SEQ ID NO：3所示。

说明书

一种植物microRNA表达载体、构建方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种载体的构建方法，特别涉及一种植物microRNA表达载体、构建方法及应用。

背景技术

[0002] microRNAs(miRNAs)是表观遗传学研究的热点问题之一，广泛参与调控植物的生长、发育及逆境耐受性等生命活动。而miRNAs功能的行使主要依赖于其对相关靶基因的转录后调控，因此，解析miRNAs调控相关生命活动的机理，首要任务即为明确miRNAs对其靶基因在相关生命活动中的调控模式。

[0003] 目前，针对miRNAs对其靶基因调控模式的研究方法主要包括：qRT-PCR、RNA原位杂交及靶基因启动子驱动靶基因/抗剪切靶基因连GFP报告基因的载体构建。比较上述三种方法，qRT-PCR法难以对靶基因转录前后细胞水平的表达模式进行定位分析；RNA原位杂交可以实现对miRNAs及其靶基因的原位表达分析，但操作繁琐，工作量大；常规的载体构建方法，可通过比较报告基因的信号展示靶基因转录前后的表达水平，但就载体构建而言，需要同时克隆基因的启动子、基因编码序列和突变后的编码序列，工作量较大，另外不可避免基因本身编码的蛋白对报告基因蛋白空间构象的影响，容易出现构建好的载体，却看不到报告基因的信号。

[0004] 综上，现有技术存在的问题是常规的载体构建方法步骤繁琐，工作量大，且基因本身的蛋白对报告基因蛋白空间构象的影响，导致构建好的载体，看不见报告基因的信号。

发明内容

[0005] 本发明简化了常规的载体构建方法，通过载体报告基因信号的观察可以展示靶基因转录前后的表达模式。

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种植物microRNA表达载体的构建方法，包括如下步骤：

[0007] 针对靶基因启动子序列设计引物组合F/R1，用F/R1引物克隆靶基因启动子序列，如SEQ ID NO：4第36-2098位所示，测序验证，将测序正确的扩增片段通过NcoⅠ/NcoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接的方法连接到pGFPGUSplus载体上，即靶用克隆的基因启动子序列替换pGFPGUSplus载体上的GFP上游的35S序列，验证片段连接至pGFPGUSplus载体的方向，正向连接至pGFPGUSplus载体的质粒即为构建成功的1#载体，靶基因启动子驱动GFP；

[0008] 针对下游含目的microRNA的靶基因启动子序列设计引物组合F/R2，用F/R1引物克隆下游含目的microRNA的靶基因启动子序列，如SEQ ID NO：5第36位-2119位所示，测序验证，对测序正确的扩增片段通过NcoⅠ/NcoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接的方法连接到pGFPGUSplus载体上，即用下游含一段microRNA结合的靶基因启动子序列替换pGFPGUSplus载体上的GFP上游的35S序列，进一步验证片段连接至pGFPGUSplus载体的方向，正向连接至pGFPGUSplus载体的质粒即为构建成功的2#载体，下游含microRNA识别结合的靶基因序列的靶基因启动子驱动GFP。

[0009] 本发明的第二个目的是提供一种上述构建方法构建得到的1#和2#载体。

[0010] 本发明的第三个目的是提供一种上述载体在分析植物microRNA对其靶基因调控模式的应用。

[0011] 优选地，所述植物为拟南芥。

[0012] 优选地，所述引物F序列如SEQ ID NO：1所示；引物R1序列如SEQ ID NO：2所示；引物R2序列如SEQ ID NO：3所示。

[0013] 本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：

[0014] 本发明简化了常规的载体构建方法，通过载体报告基因信号的观察可以展示靶基因转录前后的表达模式，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率；本专利构建的载体，可直观展示靶基因受microRNAs调控前后的组织细胞表达水平，为植物microRNAs对靶基因的调控模式研究提供了一种新方法。

附图说明

[0015] 图1为本发明实施例1的构建方法示意图(A：pGFPGUSplus载体；B：靶基因启动子替代35S启动子后，获得的用于分析靶基因转录水平表达模式的载体；C：靶基因启动子后连接一段miRNA剪切结合的靶基因的序列)。

[0016] 图2为本发明实施例1构建载体的启动子克隆电泳检测结果(图中，M为Mark条带，1-2为片段1，3-4为片段2)。

[0017] 图3为本发明实施例1构建载体连接方向的电泳检测结果(图中，M为Mark条带，1-5为片段1的克隆验证结果，6-11为片段2的克隆验证结果)。

[0018] 图4为本发明实施例2构建成功的两个载体分别转化拟南芥获得的转基因苗的筛选(A为1#载体转化，B为2#载体转化)。

[0019] 图5为本发明实施例2两种载体GFP信号观察图(A：1#载体转化，B：2#载体转化)。

具体实施方式

[0020] 下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照常规条件操作，未注明的材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

[0021] 实施例1

[0022] 一种植物microRNA表达载体的构建方法

[0023] 本实施例选取拟南芥miR159的靶基因MYB33进行载体的构建(构建方法如图1所示)，表达载体为pGFPGUSplus载体(购买至普如汀生物技术(北京)有限公司)，选取MYB33基因ATG上游2051bp序列进行引物设计；

[0024] 引物F序列如SEQ ID NO：1所示：

[0025] 引物R1序列如SEQ ID NO：2所示；

[0026] 引物R2序列如SEQ ID NO：3所示；

[0027] (1)克隆MYB33启动子序列

[0028] 以拟南芥的基因组DNA为模板，利用F/R1引物组合进行扩增，PCR体系为：1μL模板DNA、两条引物各1μL且浓度均为10μmol/L、10μL的5×Buffer、2.5mmol/L的dNTPs取4μL、1μL TransTaq HiFi DNA Polymerase、ddH2O补足50μL；

[0029] PCR反应条件：94℃5min，94℃30s、53℃30s、72℃2min，35次循环，72℃8min、4℃保存。

[0030] (2)克隆下游含目的microRNA的靶基因启动子序列

[0031] 以拟南芥的基因组DNA为模板，利用F/R2引物组合进行扩增，PCR体系为：1μL模板DNA、两条引物各1μL且浓度均为10μmol/L、10μL的5×Buffer、2.5mmol/L的dNTPs取4μL、1μL TransTaq HiFi DNA Polymerase、ddH2O补足50μL；

[0032] PCR反应条件：94℃5min，94℃30s、53℃30s、72℃2min，35次循环，72℃8min、4℃保存。

[0033] 将上述扩增产物进行电泳检测并测序验证，电泳结果为图2所示，MYB33启动子克隆测序验证为SEQ ID NO.4第36-2098位所示，记做片段1；MYB33启动子连接一段miR159剪切结合MYB33的21bp序列克隆测序验证为SEQ ID NO.5第36位-2119位所示，记做片段2。

[0034] 将测序验证正确的扩增片段通过NcoⅠ酶切、T4 DNA连接酶连接的方法连接到pGFPGUSplus载体上。

[0035] 为了验证片段1和片段2连接入pGFPGUSplus载体的方向，筛选出正向插入的目标载体，我们设计了一对引物(靠近MYB33启动子3’端设计引物F2，序列如SEQ ID NO：6所示；靠近GFP5’端设计引物R3，序列如SEQ ID NO：7所示)，以连接片段1和片段2的pGFPGUSplus载体DNA为模板，通过PCR进行筛选验证，能够成功扩增出目标大小片段的克隆即为构建成功的载体。

[0036] PCR体系为：模板DNA1μL、两条引物各1μL且浓度均为10μmol/L、10μL的2×Taqmix、ddH2O补足20μL；

[0037] PCR反应条件：94℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃40s，35次循环，72℃5min、4℃保存，电泳检测验证。

[0038] 验证结果如图3所示，泳道1-5为1#载体的克隆验证结果，其中克隆1，3，5均为启动子正向插入，构建成功的1#载体；泳道6-11为2#载体的克隆验证结果，其中克隆10，11均为启动子正向插入，即构建成功的2#载体。

[0039] 实施例2

[0040] 1#载体和2#载体在分析拟南芥microRNA对其靶基因调控模式的应用。

[0041] 利用实施例1构建成功的载体(构建成功的1#载体和2#载体)分别转化拟南芥，经潮霉素筛选，均获得转基因拟南芥阳性苗，结果如图4所示，进一步观察转基因株系主根根尖分生组织区域的GFP信号，如图5所示，对比分析GFP信号，1#载体的GFP信号代表靶基因的转录水平的表达，2#载体的GFP信号代表靶基因受miRNA剪切的转录后水平的表达，通过比较两种载体转基因系的GFP信号差异，可清晰展示MYB33在拟南芥根尖分生组织区域受miR159调控前后的表达模式。

[0042] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。