修饰电极、组合产品及其电致化学发光生物传感器与应用

摘要

本发明涉及修饰电极、组合产品及其电致化学发光生物传感器与应用。所述修饰电极包括电极以及修饰在所述电极上的发光体；所述发光体主要为羧基功能化的聚[(9,9‑二辛基芴‑2,7‑二基)‑共‑(1,4‑苯并‑{2,1’,3}‑噻二唑)]点。所述电致化学发光生物传感器无共反应试剂，能够克服现有的在共反应试剂存在下进行的ECL生物传感器测定中存在的系统稳定性不足、测量存在误差、检测中缺乏再现性等缺陷，构建了无共反应试剂型的双重信号放大电致化学发光策略，同时具有较理想的ECL信号响应值和优异的ECL发光效率，具有优异的高灵敏性、特异选择性和稳定性，为核酸的检测提供一种新方法。

权利要求

1.检测核酸的方法，其特征在于，包括采用以下组合产品对待检测核酸进行检测；

所述组合产品包括：

修饰电极；DNA S1、DNA S2；DNA发夹H1及DNA发夹H2；

所述DNA S1及DNA S2能够互补配对，所述DNA S2上偶联有淬灭剂；

所述DNA发夹H1及DNA发夹H2能够在待检测核酸催化下组装形成双足DNA步行器；所述双足DNA步行器的双足部分能够与所述DNA S1互补配对，并在所述配对后的DNA S1上预留出DNA外切酶的酶切位点；

所述组合产品不包括共反应试剂；

所述DNAS1的序列如SEQ ID NO:1所示；

所述DNAS2的序列如SEQ ID NO:2所示；

所述核酸为miRNAs-155，其序列如SEQ ID NO:3所示；

所述H1的序列如SEQ ID NO:4所示，所述H2的序列如SEQ ID NO:5所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合产品还包括所述DNA外切酶；

所述DNA外切酶为核酸外切酶Ⅲ；

所述猝灭剂选自黑洞淬灭剂、二茂铁。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述猝灭剂为黑洞淬灭剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述修饰电极包括电极以及修饰在所述电极上的发光体；

所述发光体主要为羧基功能化的聚[(9,9-二辛基芴-2,7-二基)-共-(1,4-苯并-{2,

1’,3}-噻二唑)]点；

所述电极选自玻碳电极、金电极。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述电极选自玻碳电极。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括电致化学发光生物传感器的组装方法：a)以所述修饰电极为基质组装DNA S1，引入与所述DNA S1互补配对的DNA S2；

b)在所述待检测核酸催化下，DNA发夹H1及H2组装产生双足DNA步行器；

c)将所述双足DNA步行器和所述DNA外切酶与步骤a)中所得电极共孵育；

其中，步骤a)与b)无先后顺序。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述DNA S1在交联剂存在下在所述修饰电极上组装；所述交联剂为EDC和NHS。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述修饰电极的制备方法包括：将所述发光体的分散液滴涂于所述电极的表面，干燥成膜，得到所述修饰电极。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述分散液的分散介质选自二次蒸馏水或超纯水；所述分散液中所述发光体的浓度为0.2mg·mL-1～0.4mg·mL-1。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述双足DNA步行器的制备过程包括：将目标物、DNA发夹H1和DNA发夹H2混合得到混合物，并将混合物在25℃～65℃下孵育

60～120分钟。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，将混合物在37℃下孵育90分钟，获得双足DNA步行器。

12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述双足DNA步行器和所述DNA外切酶在所述电极上的孵育时间为1～3小时。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述双足DNA步行器和所述DNA外切酶在所述电极上的孵育时间为2小时。

14.电致化学发光生物传感器，其由权利要求6、7、10～13中任一项定义的组装方法所组装得到。

说明书

修饰电极、组合产品及其电致化学发光生物传感器与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物传感器领域，具体而言，涉及修饰电极、组合产品及其电致化学发光生物传感器与应用。

背景技术

[0002] MicroRNAs(miRNAs)是一种内源性，非蛋白质编码，短(通常约19-25个碱基)和单链的RNAs，已被证实是几种生物过程如造血功能，细胞增殖和细胞凋亡中的重要调节因子。研究表明，miRNA可以作为理想的生物标志物候选物，并且miRNA的异常表达与各种癌症的发生密切相关。因此，迫切需要开发高灵敏，高度特异且可靠的技术来检测miRNA。

[0003] 电致化学发光(ECL)不仅具有电化学方法的优点，例如设备的简单性和稳定性，而且还具有比常规化学发光(CL)更广泛的动态范围和更高的灵敏度。因而已广泛用于环境分析，生物化学检测和临床检测。通常，ECL测定基本都是在共反应试剂存在下进行的。然而，在检测溶液中添加外源性共反应试剂会影响测试溶液的环境，使ECL系统缺乏足够的稳定性，从而导致测量误差。此外，虽然利用溶解氧作为共反应试剂也可以避免添加外源共反应试剂的缺陷，但在溶解氧作为共反应试剂的情况下，未知浓度的溶解氧将导致不可避免的误差并且在检测中缺乏再现性。

[0004] 因此，开发具有高ECL发射效率且无需任何共反应试剂的用于检测miRNAs的灵敏、简单ECL系统具有重要的实际意义。

[0005] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0006] 本发明的第一目的在于提供一种修饰电极，所述修饰电极修饰有共轭聚合物点发光体，该电极为表面功能化电极，具有高电荷载流子迁移率、快速辐射率等优势。

[0007] 本发明的第二目的在于提供包括上述修饰电极的组合产品，该组合产品是基于无共反应试剂型的双重信号放大电致化学发光(ECL)策略设计的，能够用于构建无共反应试剂型双重信号放大电致化学发光生物传感器。

[0008] 本发明的第三目的在于提供由上述组合产品组装得到的电致化学发光生物传感器，所述电致化学发光生物传感器为无共反应试剂型ECL生物传感器，结合双足DNA步行器(walker)双重放大策略，能够克服现有的在共反应试剂存在下进行的ECL生物传感器测定中存在的系统稳定性不足、测量存在误差、检测中缺乏再现性等缺陷，同时具有较理想的ECL信号响应值和优异的ECL发光效率。

[0009] 本发明的第四目的在于提供上述电致化学发光生物传感器在检测核酸、尤其是miRNA方面的应用。

[0010] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

[0011] 修饰电极，其包括电极以及修饰在所述电极上的发光体。

[0012] 所述发光体主要为羧基功能化的聚[(9,9-二辛基芴-2,7-二基)-共-(1,4-苯并-{2,1’,3}-噻二唑)]点。

[0013] 可选地，所述电极选自玻碳电极、金电极。

[0014] 可选地，所述电极选自玻碳电极。

[0015] 作为一种实施方式，本发明中PFBT-COOH点为聚(苯乙烯-马来酸酐)(PSMA)功能化的PFBT点。

[0016] 本申请中修饰电极以共轭聚合物、共轭聚合物点作为发光体，尤其是PFBT和羧基功能化的PFBT-COOH点，这类聚合物和聚合物点具有高电荷载流子迁移率，快速辐射率，易于表面功能化，良好的光稳定性等多种突出特征，这类材料的使用为构建无共反应试剂型的ECL生物传感器提供了一个很好的平台，并扩展了共轭聚合物点在临床分析中的应用。

[0017] 本发明中，PFBT-COOH点不仅表现出更高的ECL强度，而且还显示出更优异的成膜能力和稳定性。在不添加任何共反应试剂并用N2除去溶解氧的情况下，在光电倍增管(PMT)的电压设置为800V，放大级数设置为3时，PFBT-COOH点的ECL强度可达到18,000a.u.，信号强度比PS-COOH-co-PFO点的ECL信号响应值高了约5倍，比纯PFBTECL信号响应值高了24倍。因此，PFBT-COOH点为无共反应试剂型的ECL传感平台的构建提供了更为理想的选择。

[0018] 根据本发明的另一目的，提供了一种组合产品，其包括上述修饰电极、DNA S1、DNA S2；DNA发夹H1及DNA发夹H2。

[0019] 所述DNA S1及DNA S2能够互补配对，所述DNA S2上偶联有淬灭剂。

[0020] 所述DNA发夹H1及DNA发夹H2能够在待检测核酸催化下组装形成双足DNA步行器；所述双足DNA步行器的双足部分能够与所述DNA S1互补配对，并在所述配对后的DNA S1上预留出DNA外切酶的酶切位点。

[0021] 所述组合产品不包括共反应试剂。

[0022] 可选地，所述组合产品还包括所述DNA外切酶。

[0023] 可选地，所述DNA外切酶为核酸外切酶Ⅲ。

[0024] 可选地，所述猝灭剂选自黑洞淬灭剂、二茂铁。

[0025] 可选地，所述猝灭剂为黑洞淬灭剂。

[0026] 本发明中，DNA外切酶，尤其是核酸外切酶Ⅲ(Exo III)，能够对ECL信号强度进行两步扩增，使得电致化学发光生物传感器获得显著增强的ECL信号，双重扩增策略能赋予传感器更优的信号放大能力。

[0027] 根据本发明的另一目的，提供了检测核酸的方法，所述方法包括使用上述组合产品对待检测核酸进行检测。

[0028] 可选地，所述检测核酸的方法包括电致化学发光生物传感器的组装方法：

[0029] a)以所述修饰电极为基质组装DNA S1，引入与所述DNA S1互补配对的DNA S2；

[0030] b)在所述待检测核酸催化下，DNA发夹H1及H2组装产生双足DNA步行器；

[0031] c)将所述双足DNA步行器和所述DNA外切酶与步骤a)中所得电极共孵育；

[0032] 其中，步骤a)与b)无先后顺序。

[0033] 可选地，步骤a)中所述DNA S1在交联剂存在下在所述修饰电极上组装；所述交联剂为EDC和NHS。

[0034] 可选地，所述修饰电极的制备方法包括：

[0035] 将所述发光体的分散液滴涂于所述电极的表面，干燥成膜，得到所述修饰电极。

[0036] 可选地，所述分散液的分散介质选自二次蒸馏水或超纯水。

[0037] 可选地，所述分散液中所述发光体的浓度为0.2mg·mL-1～0.4mg·mL-1。

[0038] 可选地，在所述发光体修饰所述电极之前，还包括电极的预处理。

[0039] 可选地，所述预处理包括：将所述电极进行至少2次抛光，然后在清洗剂存在下进行超声清洗。

[0040] 可选地，所述抛光采用氧化铝抛光；所述氧化铝的粒径不超过0.30μm，并且粒径随抛光次数的增加而降低。

[0041] 可选地，所述清洗剂包括乙醇、水。

[0042] 可选地，所述超声的功率为160～200W，超声时间为2～5分钟。

[0043] 可选地，所述双足DNA步行器的制备过程包括：

[0044] 将DNA发夹H1和DNA发夹H2加热至90℃～100℃下保持5～10分钟，优选加热至95℃下保持5分钟，缓慢冷却至室温，形成发夹结构；

[0045] 将目标物、DNA发夹H1和DNA发夹H2混合得到混合物，并将混合物在25℃～65℃下孵育60～120分钟，优选在37℃下孵育90分钟，获得双足DNA步行器。

[0046] 可选地，所述双足DNA步行器和所述DNA外切酶在所述电极上的孵育时间为1～3小时，优选为2小时。

[0047] 作为一种实施方式，DNA S1以经过发光体修饰的电极为基质进行组装，在不添加任何共反应试剂的条件下以获得强ECL信号；然后，通过与DNA S1杂交引入黑洞猝灭剂(BHQ)标记的DNA S2(BHQ-S2)。由于BHQ对PFBT-COOH信号的高效猝灭作用，ECL信号达到“信号关闭”状态，由此实现了信号转换功能。

[0048] 作为一种实施方式，通过将目标物催化发夹组装产生的双足DNA步行器和DNA外切酶同时孵育到电极上。一方面，BHQ-S2被双足DNA步行器置换以从电极表面释放出来。另一方面，DNA外切酶可以消化双链DNA(dsDNA)中钝的或凹陷的3’末端。在DNA外切酶的帮助下，DNA walker释放出来再取代另一个BHQ-S2来实现DNA walker循环过程。如预期的那样，ECL信号切换到“信号开”的状态。由于共轭聚合物点发光体的高发光效率，BHQ的高猝灭效率以及双重扩增策略的结合，所提出的ECL“off-on”模型的生物传感器实现了目标物的超灵敏检测。

[0049] 可选地，所述核酸为RNA，优选为miRNAs。

[0050] 可选地，所述核酸为miRNAs-155。

[0051] 可选地，所述DNA S1的序列如SEQ ID NO:1所示；

[0052] 所述DNA S2的序列如SEQ ID NO:2所示；

[0053] 所述miRNAs-155，其序列如SEQ ID NO:3所示；

[0054] 所述H1的序列如SEQ ID NO:4所示，所述H2的序列如SEQ ID NO:5所示。

[0055] 可选地，上述检测方法的线性范围为10amol·L-1～5pmol·L-1，检测限为3.3amol·L-1。

[0056] 根据本发明的另一重要目的，提供了由上述组装方法组装得到的电致化学发光生物传感器。

[0057] 本发明提供的电致化学发光生物传感器，利用共轭聚合物点作为发光体，构建了无共反应试剂型的ECL生物传感器，在不添加任何共反应试剂的条件下实现了强ECL信号的获得、信号淬灭再到信号恢复的循环过程，即ECL信号的“信号开”状态-“信号关闭”状态-“信号开”状态的循环切换，完成ECL信号的传感。

[0058] 与现有技术相比，本发明的有益效果包括但不限于：

[0059] (1)本发明提供的修饰电极为表面功能化电极，具有高电荷载流子迁移率、快速辐射率等优势。

[0060] (2)本发明提供的组合产品是基于无共反应试剂型的双重信号放大电致化学发光(ECL)策略设计的，能够用于构建无共反应试剂型双重信号放大电致化学发光生物传感器。

[0061] (3)本发明提供的电致化学发光生物传感器，未使用共反应物，结合双足DNA步行器(walker)及酶触发双重放大策略，能够克服现有的在共反应试剂存在下进行的ECL生物传感器测定中存在的系统稳定性不足、测量存在误差、检测中缺乏再现性等缺陷，构建了无共反应试剂型的双重信号放大电致化学发光策略，同时具有较理想的ECL信号响应值和优异的ECL发光效率。

[0062] (4)本发明提供的电致化学发光生物传感器，用于检测miRNA时具有优异的高灵敏性和更低的检测限、特异选择性和稳定性，检测miRNA的线性范围为10amol·L-1～5pmol·L-1，检测限为3.3amol·L-1，为miRNA的检测提供一种新方法。

附图说明

[0063] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0064] 图1为本发明一种实施方式中电致化学发光生物传感器的构建过程；

[0065] 图2为本发明一种实施方式中双足DNA步行器的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果；

[0066] 图3为本发明一种实施方式中电致化学发光生物传感器的循环伏安特性表征结果(A)和ECL响应结果(B)；

[0067] 其中，图3A中曲线a表示裸电极的氧化还原曲线，曲线b表示PFBT-COOH点修饰电极的氧化还原曲线，曲线c表示孵育DNAS1后的氧化还原曲线，曲线d表示用HT封闭后的氧化还原曲线，曲线e表示引入BHQ-S2后的氧化还原曲线，曲线f表示DNA步行器和ExoIII同时孵育到电极表面上后的氧化还原曲线；

[0068] 图3B中曲线a表示裸电极的ECL信号响应曲线，曲线b表示PFBT-COOH点修饰电极的ECL信号响应曲线，曲线c表示孵育DNAS1并用HT封闭后的ECL信号响应曲线，曲线d表示引入BHQ-S2后的ECL信号响应曲线，曲线e表示DNA步行器和ExoIII同时孵育到电极表面上后的ECL信号响应曲线；

[0069] 图4为本发明一种实施方式中电致化学发光生物传感器对不同浓度的目标物的ECL信号响应结果；其中，图4A为ECL响应曲线，曲线a～i分别对应目标物浓度为0、10amol·-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1L 、100amol·L 、1fmol·L 、5fmol·L 、50fmol·L 、100fmol·L 、1pmol·L 以及
5pmol·L-1下的响应曲线；图4B为校准曲线；

[0070] 图5为本发明一种实施方式中，未使用外切酶的电致化学发光生物传感器对不同浓度的目标物的ECL信号响应结果及与使用触发酶的生物传感器的对比结果；其中，图5A为ECL响应曲线，曲线a～h分别对应目标物浓度为0.5fmol·L-1、1fmol·L-1、5fmol·L-1、10fmol·L-1、50fmol·L-1、100fmol·L-1、0.5pmol·L-1以及5pmol·L-1下的响应曲线；图5B为校准曲线；图5C和图5D分别为目标物浓度为5fmol·L-1和1pmol·L-1时，使用与不使用DNA外切酶的ECL信号响应对比结果；

[0071] 图6为本发明一种实施方式中电致化学发光生物传感器的选择性(A)和稳定性(B)结果；其中，图6A中a为空白对照，b～g分别为浓度为100fmol·L-1的miRNA-21、100fmol·L-1 -1 -1 -1的miRNA-141、100fmol·L 的miRNA-126、100fmol·L 的let-7a、1fmol·L 的miRNA-
155、miRNA-155和干扰物质的混合物的ECL信号响应结果；

[0072] 图7为本发明一种实施方式中电致化学发光生物传感器在不同细胞裂解液中的ECL信号响应结果；其中，a为空白对照，b～e分别为细胞浓度为10、102、103、104的结果。

具体实施方式

[0073] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0074] 其中：N-(3-(二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(NHS)和四氢呋喃(THF)购自西格玛奥德里奇有限公司(美国圣路易斯)；

[0075] 聚[(9,9-二辛基芴-2,7-二基)-共-(1,4-苯并-{2,1’,3}-噻二唑)](PFBT)购自美国聚合物源公司；

[0076] 聚(苯乙烯-马来酸酐)(PSMA)购自阿拉丁有限公司(中国上海)；

[0077] 本发明中所有DNA寡核苷酸和核酸外切酶III(Exo III)都是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并提纯的；

[0078] 磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH 7.4，0.10mol·L-1)由H3PO4和NaOH配制。通过用PBS缓冲液溶解铁氰化钾和亚铁氰化钾，得到铁氰化物溶液(Fe(CN)63-/4-，5mmol·L-1，pH 7.4)。

[0079] 本发明中所使用的表征仪器信息如下：

[0080] 使用MPI-A ECL分析仪(西安瑞迈电子科技有限公司，中国西安)进行ECL测量，扫描电位设置为0到1.25V，光电倍增管设置为800V；

[0081] 使用CHI600D电化学工作站(上海辰华有限公司仪器，中国上海)进行电化学测量；

[0082] 使用透射电子显微镜(TEM)表征材料的形貌。

[0083] 实验例1 PFBT-COOH点的合成

[0084] 首先，将PFBT和PSMA溶解在THF中，分别制备浓度为1.0mg·mL-1的储备溶液。然后，将4.0mL制备好的PFBT和800μL PSMA混合并超声处理以形成均匀的混合溶液。随后，将10mL二次蒸馏水注入上述溶液中并搅拌过夜。最后，通过局部真空蒸发除去THF，得到PFBT-COOH点，避光保存。

[0085] 实施例1生物传感器的制备

[0086] 双足DNA步行器的制备

[0087] 通过目标物催化发夹组装过程(CHA)合成双足DNA步行器。

[0088] 将DNA发夹H1和DNA发夹H2加热至95℃，保持反应5min，然后缓慢冷却至室温使之形成发夹结构；

[0089] 将10μL不同浓度的目标物miRNA-155和5μL 10μmol·L-1DNA发夹H1加入到5μL 10μmol·L-1DNA发夹H2中；然后，将混合物在37℃下孵育90min。获得双足DNA步行器。

[0090] 生物传感器的构建

[0091] 图1展示了ECL生物传感器的逐步构建和组装过程。

[0092] a)将玻碳电极(GCE，Φ＝4.0mm)用0.30和0.05μm氧化铝分别抛光后，依次用乙醇和二次蒸馏水进行超声清洗；

[0093] b)将10μL的PFBT-COOH点的二次蒸馏水分散液滴涂于玻碳电极表面，在空气中干燥成膜后，将修饰电极在室温下浸入交联剂(0.02g·mL-1EDC和0.01g·mL-1NHS)中30min；

[0094] c)将10μL的浓度为10μmol·L-1的DNA S1连接至具有活性羧基的PFBT-COOH点修饰-1的电极上，在4℃下孵育过夜；在室温下用1.0mmol·L 己硫醇(HT)封闭40min后，将BHQ-S2复合物(10μL，10μmol·L-1)在37℃于修饰到电极上孵育2h；

[0095] d)将10μL已经制备好的双足DNA步行器和5μL的ExoⅢ滴加到已经修饰好的电极表面上，孵育2h，获得电致化学发光生物传感器。

[0096] 对比例1未使用DNA外切酶的ECL生物传感器

[0097] 本对比例中构建ECL生物传感器的过程与实施例1基本相同，不同之处仅在于，未使用DNA外切酶。

[0098] 实验例2双足DNA步行器的表征

[0099] 用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法分析通过目标物催化发夹组装合成的双足DNA步行器。

[0100] 在新制备的聚丙烯酰胺凝胶(16％)凹槽中滴入制备好的DNA链，然后在1×TBE缓冲液中，电位为120V，进行电泳120min。用溴化乙锭(EB)染色后，用生物凝胶成像系统进行拍摄成像。如图2所示，泳道1中的丢失带对应于miRNA-155(1.0μmol·L-1)，因为其具有很少的核苷酸碱基并且不容易染色。泳道2和泳道3分别显示对应于H2(1.0μmol·L-1)和H1(1.0μmol·L-1)的不同条带。在泳道4中出现两个独立的条带(1.0μmol·L-1的H2和1.0μmol·L-1的H1)，表明H2和H1可以在溶液中稳定共存。正如预期的那样，当加入miRNA-155(1.0μmol·L-1)，H1(1.0μmol·L-1)和H2(1.0μmol·L-1)的混合物时，在泳道5的顶部存在明显的DNA复合物带，证明通过目标物催化发夹组装过程，成功生产出双足DNA步行器。

[0101] 实验例3生物传感器的电化学表征和ECL信号表征

[0102] 电化学表征

[0103] 在5.0mmol·L-1的[Fe(CN)6]3-/4-中测量循环伏安图(CVs)以表征实施例1中制备的生物传感器的逐步构建过程。

[0104] 如图3A所示，裸电极的CVs显示出可逆的氧化还原峰(曲线a)。PFBT-COOH点修饰电极的氧化还原峰电流下降(曲线b)，这归因于电极表面上的修饰膜阻碍了电子传递。由于DNA链阻碍电子传递的特性，在制备的电极上孵育DNA S1后检测到显著降低的氧化还原峰电流(曲线c)。用HT封闭后，氧化还原峰电流略微上升(曲线d)。当引入BHQ-S2时，峰电流再一次略微下降(曲线e)，说明BHQ-S2成功引入。最后，当双足DNA步行器和ExoIII在电极表面上同时被孵育后，氧化还原电流明显增加(曲线f)，这是因为一方面BHQ-S2被双足DNA步行器置换从电极表面释放，同时，在ExoIII的辅助下DNAS1被剪切，使DNA步行器可以释放并自由地置换另一个BHQ-S2，最终使DNA链全部脱离电极。

[0105] ECL信号表征

[0106] 图3B显示了实施例1中制备得到的电致化学发光生物传感器在PBS(0.10mol·L-1，pH 7.4)中逐步构建过程的ECL信号响应曲线。如图3B中所示，在PBS中，裸电极几乎没有ECL信号响应(曲线a)，而PFBT-COOH点修饰电极(曲线b)呈现出一强的ECL信号相应，响应值接近18000a.u.，表明PFBT-COOH点具有强的ECL发光效率。将电极孵育上DNA S1并进一步用HT封闭后(曲线c)，ECL信号响应略微下降。当引入BHQ-S2时(曲线d)，由于BHQ对PFBT-COOH点高效的ECL猝灭效应，ECL信号响应值显著降低。然而，当DNA步行器和Exo III同时孵育到电极表面上时(曲线e)，BHQ-S2被双足DNA步行器从电极表面置换出来，使得淬灭的ECL信号恢复到“on”的状态。

[0107] 实验例4 ECL生物传感器用于miRNA的ECL检测

[0108] 实施例1所制备的ECL生物传感器对目标物miRNA-155的响应

[0109] 以miRNA-155为目标物，测试实施例1所制备的ECL生物传感器对目标物miRNA-155的响应。测试结果如图4所示。

[0110] 从图4A可以看出，阳极ECL信号随miRNA-155浓度从10amol·L-1到5pmol·L-1的增加而增加。在信噪比(S/N)为3时，计算得检测限为3.3amol·L-1，其中，曲线a为没有目标存在时的ECL响应。

[0111] 图4B显示了所测得的ECL信号与miRNA-155浓度的对数值呈良好的正相关，线性方程为I＝45813.8+2573.6lgc，相关系数R2＝0.9938。此处，I代表ECL信号强度，c代表miRNA-155的浓度。

[0112] 对比例1所制备的ECL生物传感器对目标物miRNA-155的响应

[0113] 以miRNA-155为目标物，测试对比例1所制备的生物传感器对目标物miRNA-155的响应。测试结果如图5所示。

[0114] 如图5A所示，在ExoIII不存在时，ECL强度随着miRNA-155浓度从0.5fmol·L-1增加至5pmol·L-1时而逐步增加，在信噪比(S/N)为3时检测限为0.17fmol·L-1。与实施例1中存在Exo III进行两步扩增(图4A)相比，检测限增加了约50倍。图5C和图5D展示了在相同浓度miRNA-155存在下，存在和不存在ExoIII的ECL信号强度比较。由结果可以发现，对比例中没有使用ExoIII进行二次放大的生物传感器，表现出相对较低的ECL信号。然而，当使用ExoIII进行两步扩增时，生物传感器获得了显著增强的ECL信号，表明本发明中双重扩增策略能赋予传感器更优的信号放大能力。

[0115] 本发明与现有技术中已经报道的方法对比

[0116] 将本发明提供的检测目标物的方法与现有技术中已经报道的方法进行对比，结果如表1中所示。由表1中结果可以发现，本发明提供的ECL生物传感器miRNA的检测中表现出更高的灵敏度和更低的检测限，这归因于以下原因：(1)PFBT-COOH点具有卓越的发光效率；(2)从PFBT-COOH激发态到BHQ的共振能量转移使BHQ具有对PFBT-COOH点的ECL信号的高猝灭效率，背景信号低；(3)结合目标物催化发夹组装和双足DNA步行器以实现了双重信号放大。

[0117] 表1本发明中ECL生物传感器与其他检测miRNA的策略对比结果

[0118] 检测方法 线性范围 检测限 文献荧光 1fmol·L-1～100nmol·L-1 1fmol·L-1 1
电化学 5fmol·L-1～5pmol·L-1 10fmol·L-1 2
ECL 1fmol·L-1～50pmol·L-1 0.33fmol·L-1 3
-1 -1 -1
ECL 100amol·L ～1nmol·L 29.5amol·L 4
ECL 10amol·L-1～5pmol·L-1 3.3amol·L-1 本发明

[0119] 文献列表如下：

[0120] 1.Yin,B.C.；Liu,Y.Q.；Ye,B.C.Sensitive Detection of MicroRNA in Complex Biological Samples via Enzymatic Signal Amplification Using DNA Polymerase Coupled with Nicking Endonuclease.Anal.Chem.2013,85,11487-11493.[0121] 2.Koo,K.M.；Carrascosa,L.G.；Shiddiky,M.J.A.；Trau,M.Poly(A)Extensions of MiRNAs for Amplification-Free Electrochemical Detection on Screen-Printed Gold Electrodes.Anal.Chem.2016,88,2000-2005.

[0122] 3.Zhang,P.；Lin,Z.F.；Zhuo,Y.；Yuan,R.；Chai,Y.Q.Dual microRNAs-Fueled DNA  Nanogears:A  Case  of  Regenerated  Strategy  for  Multiple Electrochemiluminescence  Detection  of  MicroRNAs with  Single Luminophore.Anal.Chem.2017,89,1338-1345.

[0123] 4.Liu,J.L.；Tang,Z.L.；Zhang,J.Q.；Chai,Y.Q.；Zhuo,Y.；Yuan,R.Morphology-Controlled 9,10-Diphenylanthracene Nanoblocks as Electrochemiluminescence Emitters  for  MicroRNA  Detection  with  One-Step  DNA  Walker Amplification.Anal.Chem.2018,90,5298-5305.

[0124] 实验例5 ECL生物传感器的选择性和稳定性

[0125] ECL生物传感器的选择性

[0126] 选择常见的短单链RNA(包括miRNA-21，miRNA-141，miRNA-126和let-7a)作为潜在的干扰物质来研究本发明提供的ECL生物传感器的选择性。

[0127] 如图6A所示，所提出的生物传感器在分别加入miRNA-21(100fmol·L-1)、miRNA-141(100fmol·L-1)、miRNA-126(100fmol·L-1)和let-7a(100fmol·L-1)时的ECL信号强度与空白对照是一致。然而，当在较低浓度(1fmol·L-1)下测试miRNA-155时，ECL信号强度显著增强。此外，在加入miRNA-155和干扰物质的混合物后，得到的ECL信号强度与浓度为-1
1fmol·L miRNA-155的响应相比，没有明显差异。上述结果表明本发明所提供的ECL生物传感器能够特异性检测miRNA-155。

[0128] ECL生物传感器的稳定性

[0129] 在浓度为10fmol·L-1的miRNA-155存在下，通过连续扫描来评估生物传感器的稳定性。如图6B所示，在连续循环电位下扫描16圈，ECL信号强度没有显示出明显的波动，相对标准偏差(RSD)为0.04％，这表明本发明提供的ECL生物传感器具有令人满意的稳定性。

[0130] 实验例6 ECL生物传感器的应用

[0131] 通过研究miRNA-155在人类宫颈癌细胞(Hela)和乳腺癌细胞(MCF-7)的细胞裂解液中的表达来评估生物传感器的实用性。

[0132] 如图7所示，空白试验显示出很弱的ECL信号发射。而随着Hela的细胞数增加，ECL信号强度增加，说明miRNA-155在Hela细胞中有一定的表达。同时，随着MCF-7浓度从10增加到104个细胞，ECL信号强度也明显增加，表明miRNA-155在MCF-7中过表达。上述结果表明，本发明提供的ECL生物传感器为miRNA的检测提供一种新方法。

[0133] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。