阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的制备方法及应用

摘要

本发明提供一种阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的制备及其应用。通过以磷脂、胆固醇、阿糖胞苷‑PEG2k‑DSPE和甲氨喋呤为原料，采用薄膜分散法结合超声、高压匀质法，经溶解，成膜，水化，超声、高压匀质，冷冻干燥制备。本方法制备的脂质体的粒径约为125nm，分散系数为0.218，甲氨喋呤的载药量约为10.37％，包封率约为85.26％。绒毛膜癌细胞表面的核苷转运蛋白1能够特异性识别阿糖胞苷并介导阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体进入细胞，进而增了药物的细胞毒性。该阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体制备工艺简单，易于放大生产，为绒毛膜癌治疗提供新型药物制剂。

权利要求

1.一种阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）阿糖胞苷-PEG2k-DSPE的合成：

（a）取DSPE-PEG2k-COOH，溶于二甲基甲酰胺后摇匀，然后取阿糖胞苷，2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、三乙胺、和1-羟基苯并三唑，依次加入到上述二甲基甲酰胺溶液体系，冰浴搅拌3-5 h；其中DSPE-PEG2k-COOH，阿糖胞苷，2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，1-羟基苯并三唑与三乙胺的摩尔比为1:1.2:1.2:

1.2:2；

（b）步骤（a）反应完成以后，将反应体系移至截留分子量为3500 Da的透析袋，在1000 ml去离子水中透析72 h，每隔6 h换一次去离子水；

（c）透析结束后，将透析袋中的液体程序降温后冷冻干燥48 h，即得到阿糖胞苷-PEG2k-DSPE；

（2）阿糖胞苷修饰载甲氨喋呤的脂质体的制备：

（a）溶解：取卵磷脂和胆固醇，溶于氯仿10 mL中，涡旋直至完全溶解；

（b）成膜: 将上述氯仿溶液加入至500 mL梨形烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸发，至瓶壁上形成一层浅黄色的薄膜，置于真空干燥箱内过夜，除去痕量残留氯仿；其中减压蒸发条件：水浴锅温度：45℃，压力：50 Pa，时间60 min；

（c）水化：先配置0.5 M NaOH溶液，用于溶解甲氨喋呤，然后用HCl溶液调pH至7-8；纯水定容配置成2 mg/ml的甲氨喋呤溶液，取2 mg/ml MTX溶液，加入至成膜后的梨形烧瓶中，40℃水化30 min，至黄色澄清溶液逐渐变黄色胶体状溶液；

（d）超声：将上述黄色胶体状溶液移至15 ml离心管，然后用细胞超声粉碎仪超声5 min；

（e）高压匀质机过膜：在高压匀质机装上100 nm有机滤膜，将上述超声处理后的分散液匀质15 分钟，即得到粒径均一的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体分散液；

（f）冷冻干燥：将上述制备完成的脂质体分散液加入冻干保护剂后程序降温，并冷冻干燥72 h得到阿糖胞苷修饰载甲氨喋呤的脂质体，所述冻干保护剂为5%甘露糖。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）的（d）中，超声粉碎仪超声功率：900 w，工作1s停1s。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）的（e）中，分散液匀质循环进行10次。

4.权利要求1所述方法在制备治疗滋养细胞引起的肿瘤的药物中的应用。

说明书

阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的制备方法以及在治疗滋养细胞肿瘤中的应用。

背景技术

[0002] 随着我国全面二孩政策出台，妇女再生育需求急剧增长，妊娠滋养细胞肿瘤(包括绒毛膜癌)的发病率进一步呈显著上升趋势。若未能及早诊断或处理不当，妊娠滋养细胞肿瘤可能引发严重出血、子宫破裂、切除子宫等，严重威胁妇女的生殖健康甚至生命。甲氨蝶呤是治疗妊娠滋养细胞肿瘤的一线用药，然而，甲氨喋呤全身给药时，特异性分布能力差，在治疗妊娠滋养细胞肿瘤时容易出现肝损伤、腹痛、胃肠道反应、粘膜损伤以及骨髓抑制等不良反应，发生率超过30％，甚至出现过敏性肺炎与高热惊厥等严重不良反应，进而对育龄患者的正常组织造成严重的损害。因此构建一种能够高效且安全地治疗妊娠滋养细胞肿瘤的药物制剂是十分有意义的。

[0003] 脂质体是由磷脂、胆固醇等组成的内部为水相、具有类细胞膜结构的双分子层闭合囊泡。可以运载亲水性和亲脂性的物质，在生物医药、食品营养、化妆品等领域有广泛的应用。阿糖胞苷是胞嘧啶核苷的类似物，能够经人体平衡型核苷转运蛋白1(ENT1)特异性转运进入细胞，临床常与其它抗肿瘤药物联用，以增强对实体瘤的抑制作用。另外，绒毛膜癌细胞上特异性高表达ENT1，因此制备阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体能够在ENT1的介导下高效转运进入细胞，进而增强了药物的细胞毒性。

发明内容

[0004] 本发明的目的是为了针对甲氨喋呤在治疗滋养细胞肿瘤时特异性不高，副作用严重且疾病复发率较高等不足，提供一种阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的制备方法，[0005] 以提高滋养细胞肿瘤细胞对递药体系的摄取，并增强药物的细胞毒性。本发明旨在促进阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的开发。本发明的方法，通过以下步骤实现：

[0006] 1.阿糖胞苷-PEG2k-DSPE的合成：

[0007] (1)精密称取140.00mg DSPE-PEG2k-COOH(MW：2800)，溶于10ml的二甲基甲酰胺后摇匀。然后精密称取14.60mg阿糖胞苷(MW：243.22)，22.80mg 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、三乙胺、和1-羟基苯并三唑(HOBt)，依次加入到上述二甲基甲酰胺溶液体系，冰浴搅拌3-5h，其中DSPE-PEG2k-COOH，阿糖胞苷，HATU，HOBt与三乙胺的摩尔比为1:1.2:1.2:1.2:2。化学反应方程式如下所示：

[0008]

[0009] (2)待(1)反应完成以后，将反应体系移至截留分子量为3500Da的透析袋，在1000ml去离子水中透析72h，每隔6h换一次去离子水。

[0010] (3)透析结束后，将透析袋中的液体程序降温后冷冻干燥48h，即得到阿糖胞苷-PEG2k-DSPE。

[0011] 2.阿糖胞苷修饰载甲氨喋呤的脂质体的制备：

[0012] (1)溶解：称取卵磷脂94mg和胆固醇21mg，溶于氯仿10mL中，涡旋直至完全溶解。

[0013] (2)成膜:将上述氯仿溶液加入至500mL梨形烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸发(水浴锅温度：45℃，压力：50Pa，时间60min)，至瓶壁上形成一层浅黄色的薄膜，置于真空干燥箱内过夜，除去痕量残留氯仿。

[0014] (3)水化：首先配置0.5M NaOH溶液，取适量体积溶解甲氨喋呤，然后用HCl溶液调pH至7-8。纯水定容配置成2mg/ml的甲氨喋呤溶液。量取2mg/ml MTX溶液10ml，加入至成膜后的梨形烧瓶中，40℃水化约30min，黄色澄清溶液逐渐变黄色胶体状溶液。

[0015] (4)超声：将上述黄色胶体状溶液移至15ml离心管，然后用细胞超声粉碎仪超声5min(功率：900w，工作1s停1s)。

[0016] (5)高压匀质机过膜：在高压匀质机装上有机滤膜(100nm)，将上述超声处理后的分散液匀质约15分钟(循环匀质约10次)，即得到粒径均一的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体分散液。

[0017] (6)冷冻干燥：将上述制备完成的脂质体分散液加入5％的甘露醇(w/v)后程序降温，并冷冻干燥72h得到阿糖胞苷修饰载甲氨喋呤的脂质体。

[0018] 本发明的另一个目的是提供所述方法在制备治疗滋养细胞引起的肿瘤的药物中的应用。本发明制备的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体能够通过阿糖胞苷与滋养细胞肿瘤细胞膜上的人体平衡型核苷转运蛋白1特异性结合并且介导脂质体进入细胞，具有主动靶向的特征，进而发挥高效治疗作用并提高了甲氨喋呤治疗滋养细胞肿瘤的安全性。

[0019] 发明CN101439021A公开了一种共载双氯芬酸钠与甲氨喋呤的柔性脂质体及其制备方法，其通过超声过膜法制备，而本发明先采用薄膜分散法制备脂质体，然后通过超声与高压匀质法使得脂质体的粒径更加均一，两者制备方法不同。在应用方面，本发明制备的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体是用于治疗滋养细胞肿瘤，而CN101439021A叙述的脂质体制剂是用于类风湿关节炎等炎性疾病。此外，本发明制备的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体能够通过阿糖胞苷与滋养细胞肿瘤细胞膜上的人体平衡型核苷转运蛋白1特异性结合并且介导脂质体进入细胞，具有主动靶向的特征，进而发挥高效治疗作用并提高了甲氨喋呤治疗滋养细胞肿瘤肿瘤的安全性。

附图说明

[0020] 图1为DSPE-PEG2k-COOH与实施例1中合成的阿糖胞苷-PEG2k-DSPE的飞行质谱图。

[0021] 图2为DSPE-PEG2k-COOH与实施例1中合成的阿糖胞苷-PEG2k-DSPE的红外光谱图。

[0022] 图3为实施例1中制备的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的透射电镜图。

[0023] 图4为实施例1中制备的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的粒径图。

[0024] 图5为实施例1中制备的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的电位图。

[0025] 图6为实施例1中制备的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的细胞毒性图。

[0026] 图7为人绒毛膜癌(JEG-3)细胞对实施例1中制备的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的细胞摄取图。

具体实施方式

[0027] 本发明结合附图和实施例进一步说明本发明的内容，但是不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，都属于本发明的范畴。

[0028] 实施例1

[0029] 1.阿糖胞苷-PEG2k-DSPE的合成：

[0030] (1)精密称取140.00mg DSPE-PEG2k-COOH(MW：2800)，溶于10ml的二甲基甲酰胺后摇匀。然后精密称取14.60mg阿糖胞苷(MW：243.22)，22.80mg 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、三乙胺、和1-羟基苯并三唑(HOBt)，依次加入到上述二甲基甲酰胺溶液体系，冰浴搅拌3h，其中DSPE-PEG2k-COOH，阿糖胞苷，HATU，HOBt与三乙胺的摩尔比为1:1.2:1.2:1.2:2。

[0031] (2)待(1)反应完成以后，将反应体系移至截留分子量为3500Da的透析袋，在1000ml去离子水中透析72h，每隔6h换一次去离子水。

[0032] (3)透析结束后，将透析袋中的液体程序降温后冷冻干燥48h，即得到阿糖胞苷-PEG2k-DSPE。

[0033] 2.阿糖胞苷修饰载甲氨喋呤的脂质体的制备：

[0034] (1)溶解：称取卵磷脂94mg和胆固醇21mg，溶于氯仿10mL中，涡旋直至完全溶解。

[0035] (2)成膜:将上述氯仿溶液加入至500mL梨形烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸发(水浴锅温度：45℃，压力：50Pa，时间60min)，至瓶壁上形成一层浅黄色的薄膜，置于真空干燥箱内过夜，除去痕量残留氯仿。

[0036] (3)水化：首先配置0.5M NaOH溶液，取适量体积溶解甲氨喋呤，然后用HCl溶液调pH至7-8。纯水定容配置成2mg/ml的甲氨喋呤溶液。量取2mg/ml MTX溶液10ml，加入至成膜后的梨形烧瓶中，40℃水化约30min，黄色澄清溶液逐渐变黄色胶体状溶液。

[0037] (4)超声：将上述黄色胶体状溶液移至15ml离心管，然后用细胞超声粉碎仪超声5min(功率：900w，工作1s停1s)。

[0038] (5)高压匀质机过膜：在高压匀质机装上有机滤膜(100nm)，将上述超声处理后的分散液匀质约15分钟(循环匀质约10次)，即得到粒径均一的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体分散液。

[0039] (6)冷冻干燥：将上述制备完成的脂质体分散液加入5％的甘露醇(w/v)后程序降温，并冷冻干燥72h得到阿糖胞苷修饰载甲氨喋呤的脂质体。

[0040] 按照实施例1的制备方法，所制备的阿糖胞苷-PEG2k-DSPE的纯度为90.24％，飞行质谱图中，DSPE-PEG2k-COOH的峰值约在2750m/z(图1)，阿糖胞苷-PEG2k-DSPE的峰值约在2995m/z(图1)，差值为245，正好是一个阿糖胞苷的摩尔分子量(243.23)，并且阿糖胞苷-PEG2k-DSPE没有杂峰，证明阿糖胞苷与DSPE-PEG2k-COOH的成功键合；此外，DSPE-PEG2k-COOH与阿糖胞苷-PEG2k-DSPE(图2)红外图谱表征比较，阿糖胞苷-PEG2k-DSPE中1643.82cm-1处的峰归属于阿糖胞苷嘧啶酮羰基；874.49cm-1处为环氧基团特征峰进一步证明了阿糖胞苷-PEG2k-DSPE的成功合成。由透射电镜图像可知，阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体形状规则，分布均匀(图3)。甲氨喋呤的载药量约为10.37％，包封率约为85.26％。所制备的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的平均粒径约为125nm(图4)，分散系数为0.218，电位约为-
25mV(图5)。

[0041] 发明人前期还进行了甲氨喋呤溶液、甲氨喋呤与阿糖胞苷的物理混合物、载甲氨喋呤脂质体与阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体四种制剂对人绒毛膜癌细胞(JEG-3)毒性研究(图6)；上述四种制剂对JEG-3细胞毒性分别是：阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体(8.66±1.58μg/ml)>载甲氨喋呤脂质体(13.35±1.77μg/ml)>甲氨喋呤与阿糖胞苷的物理混合物(15.22±3.10μg/ml)>甲氨喋呤溶液(17.83±1.63μg/ml)，阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体的细胞毒性显著高于其余三种制剂。说明阿糖胞苷修饰的脂质体能够增强所负载的甲氨喋呤的细胞毒性。为了研究阿糖胞苷修饰的脂质体对JEG-3细胞的靶向性，课题组已经构建了FITC标记荧光脂质体以及阿糖胞苷修饰的荧光脂质体，并研究了JEG-3对它们的摄取情况。如图7所示，同一时间点，JEG-3细胞对阿糖胞苷修饰的荧光脂质体的摄取明显高于FITC标记荧光脂质体，这是JEG-3细胞高表达的核苷转运蛋白介导阿糖胞苷修饰的荧光脂质体入胞的结果。说明经过阿糖胞苷修饰，能够增加JEG-3细胞对递药载体的摄取。

[0042] 实施例2

[0043] 1.阿糖胞苷-PEG2k-DSPE的合成：

[0044] (1)精密称取140.00mg DSPE-PEG2k-COOH(MW：2800)，溶于10ml的二甲基甲酰胺后摇匀。然后精密称取14.60mg阿糖胞苷(MW：243.22)，22.80mg 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、三乙胺、和1-羟基苯并三唑(HOBt)，依次加入到上述二甲基甲酰胺溶液体系，冰浴搅拌3h，其中DSPE-PEG2k-COOH，阿糖胞苷，HATU，HOBt与三乙胺的摩尔比为1:2:1.2:1.2:2。

[0045] (2)待(1)反应完成以后，将反应体系移至截留分子量为3500Da的透析袋，在1000ml去离子水中透析72h，每隔6h换一次去离子水。

[0046] (3)透析结束后，将透析袋中的液体程序降温后冷冻干燥48h，即得到阿糖胞苷-PEG2k-DSPE。

[0047] 2.阿糖胞苷修饰载甲氨喋呤的脂质体的制备：

[0048] (1)溶解：称取卵磷脂94mg和胆固醇21mg，溶于氯仿10mL中，涡旋直至完全溶解。

[0049] (2)成膜:将上述氯仿溶液加入至500mL梨形烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸发(水浴锅温度：45℃，压力：50Pa，时间60min)，至瓶壁上形成一层浅黄色的薄膜，置于真空干燥箱内过夜，除去痕量残留氯仿。

[0050] (3)水化：首先配置0.5M NaOH溶液，取适量体积溶解甲氨喋呤，然后用HCl溶液调pH至7-8。纯水定容配置成2mg/ml的甲氨喋呤溶液。量取2mg/ml MTX溶液10ml，加入至成膜后的梨形烧瓶中，40℃水化约30min，黄色澄清溶液逐渐变黄色胶体状溶液。

[0051] (4)超声：将上述黄色胶体状溶液移至15ml离心管，然后用细胞超声粉碎仪超声5min(功率：900w，工作1s停1s)。

[0052] (5)高压匀质机过膜：在高压匀质机装上有机滤膜(100nm)，将上述超声处理后的分散液匀质约15分钟(循环匀质约10次)，即得到粒径均一的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体分散液。

[0053] (6)冷冻干燥：将上述制备完成的脂质体分散液加入5％的甘露醇(w/v)后程序降温，并冷冻干燥72h得到阿糖胞苷修饰载甲氨喋呤的脂质体。

[0054] 实施例3

[0055] 1.阿糖胞苷-PEG2k-DSPE的合成：

[0056] (1)精密称取140.00mg DSPE-PEG2k-COOH(MW：2800)，溶于10ml的二甲基甲酰胺后摇匀。然后精密称取14.60mg阿糖胞苷(MW：243.22)，22.80mg 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、三乙胺、和1-羟基苯并三唑(HOBt)，依次加入到上述二甲基甲酰胺溶液体系，冰浴搅拌5h，其中DSPE-PEG2k-COOH，阿糖胞苷，HATU，HOBt与三乙胺的摩尔比为1:1.2:1.2:1.2:2。

[0057] (2)待(1)反应完成以后，将反应体系移至截留分子量为3500Da的透析袋，在1000ml去离子水中透析72h，每隔6h换一次去离子水。

[0058] (3)透析结束后，将透析袋中的液体程序降温后冷冻干燥48h，即得到阿糖胞苷-PEG2k-DSPE。

[0059] 2.阿糖胞苷修饰载甲氨喋呤的脂质体的制备：

[0060] (1)溶解：称取卵磷脂94mg和胆固醇21mg，溶于氯仿10mL中，涡旋直至完全溶解。

[0061] (2)成膜:将上述氯仿溶液加入至500mL梨形烧瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸发(水浴锅温度：45℃，压力：50Pa，时间60min)，至瓶壁上形成一层浅黄色的薄膜，置于真空干燥箱内过夜，除去痕量残留氯仿。

[0062] (3)水化：首先配置0.5M NaOH溶液，取适量体积溶解甲氨喋呤，然后用HCl溶液调pH至7-8。纯水定容配置成2mg/ml的甲氨喋呤溶液。量取2mg/ml MTX溶液10ml，加入至成膜后的梨形烧瓶中，40℃水化约30min，黄色澄清溶液逐渐变黄色胶体状溶液。

[0063] (4)超声：将上述黄色胶体状溶液移至15ml离心管，然后用细胞超声粉碎仪超声5min(功率：900w，工作1s停1s)。

[0064] (5)高压匀质机过膜：在高压匀质机装上有机滤膜(100nm)，将上述超声处理后的分散液匀质约15分钟(循环匀质约10次)，即得到粒径均一的阿糖胞苷修饰的载甲氨喋呤脂质体分散液。

[0065] (6)冷冻干燥：将上述制备完成的脂质体分散液加入5％的甘露醇(w/v)后程序降温，并冷冻干燥72h得到阿糖胞苷修饰载甲氨喋呤的脂质体。