一种检测核酸固体样品甲胺及甲胺盐溶剂残留的方法

摘要

本发明公开了一种检测核酸固体样品甲胺及甲胺盐溶剂残留的方法，步骤如下：采用甲胺和三乙胺‑异丙醇溶液配置对照品溶液；采用样品和三乙胺‑异丙醇溶液进行分散离心，取上清液，获得供试品溶液；采用三乙胺‑异丙醇溶液作为空白溶剂；采用配备FID检测器的气相色谱仪作为检测仪器，分别将空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液进样，进行气相色谱检测，获取检测结果。本发明采用了异丙醇衍生化法使甲胺被异丙醇衍生成较大分子，从而能延长保留时间，提高分离度，提高FID检测的灵敏度，通过加入三乙胺是甲胺盐以甲胺的形式游离处理提取出来，从而保证检测的准确性，解决了甲胺难以被检测的技术难题。

权利要求

1.一种检测核酸固体样品甲胺及甲胺盐溶剂残留的方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备对照品溶液：采用甲胺和三乙胺‑异丙醇溶液配置对照品溶液，制备方法如下：a）精确称取40%甲胺水溶液55mg，放入10mL容量瓶中，加入三乙胺‑异丙醇溶液进行定容，摇匀，三乙胺‑异丙醇溶液中三乙胺的体积浓度为1%，获得第一对照品储备液；b）精确量取第一对照品储备液200μL，放入10mL容量瓶中，加入三乙胺‑异丙醇溶液进行定容，摇匀，三乙胺‑异丙醇溶液中三乙胺的体积浓度为1%，获得第二对照品储备液；c）精确量取第二对照品储备液2mL，放入10mL容量瓶中，加入三乙胺‑异丙醇溶液进行定容，摇匀，三乙胺‑异丙醇溶液中三乙胺的体积浓度为1%，获得对照品溶液；

2）制备供试品溶液：制备方法如下：精确称取适量样品至离心管中，加入0.5‑1.0mL的三乙胺‑异丙醇溶液，三乙胺‑异丙醇溶液中三乙胺的体积浓度为1%，离心处理10min，吸取上清液，获得供试品溶液；

3）制备空白溶剂：采用三乙胺‑异丙醇溶液作为空白溶剂，三乙胺‑异丙醇溶液中三乙胺的体积浓度为1%；

4）进样检测：采用配备FID检测器的气相色谱仪作为检测仪器，分别将空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液进样，进行气相色谱检测，气相色谱条件为：色谱柱：HP‑5，30m*

0.32mm*0.25μm；载气：99.999%氮气；流速：2.0mL/min；进样口：220℃；检测器：250℃；柱温：在60℃下保温1min，然后以10℃/min升温至120℃,再以 20℃/min升温至200℃，在200℃下保温3min；分流比：10:1，获取检测结果。

2.根据权利要求1所述的检测核酸固体样品甲胺及甲胺盐溶剂残留的方法，其特征在于，步骤2）中，所述离心处理的转速为4000‑8000rpm。

3.根据权利要求1所述的检测核酸固体样品甲胺及甲胺盐溶剂残留的方法，其特征在于，步骤4）中，进行气相色谱检测时，空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液的进样量为1μL。

说明书

一种检测核酸固体样品甲胺及甲胺盐溶剂残留的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种检测核酸固体样品甲胺及甲胺盐溶剂残留的方法。

背景技术

[0002] 甲胺在很多生产领域应用广泛，主要用作医药(咖啡因、麻黄素等)、农药(西维因、乐果、杀虫脒等)、染料(茜素中间体、蒽醌系中间体等)、炸药及燃料，表面活性剂、促进剂、
以及橡胶助剂、照相化学品和溶剂等的原料。另外在核酸合成工艺中，常用在核酸脱保护和
纯化过程中。

[0003] 在医药和核酸生产过程，由于甲胺碱性强，常以甲胺盐形式存在，极其难以挥发。因此在产品的生产过程中，甲胺容易形成残留。目前甲胺在《中国药典》2015版并没有规定
其残留量，在分类中属于第四类溶剂(尚无足够毒理学资料)。但是在很多文件中有说明其
有吸入危害和皮肤灼伤的情况发生。

[0004] 目前的甲胺的分析方法有：使用离子色谱法检测甲胺的方法，该方法用于控制副产物的，难以达到溶剂残留所需要的灵敏度。在甲胺残留残留测试时，甲胺由于沸点低导致
样品在气相色谱中难以保留；碱性强、易成盐的特点使之无法成气态被气相所检测；在FID
检测器中响应值低，难以达到要求的灵敏度；液相也无法保留且没有合适的检测器来检测
甲胺。因此，如何实现甲胺及甲胺盐溶剂残留的检测，是亟待解决的技术问题。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种检测核酸固体样品甲胺及甲胺盐溶剂残留的方法，采用异丙醇衍生化法，衍生化法中甲胺被异丙醇衍生成较大分子，并通过三乙胺抑制其成盐
从而能被检测器所检测，解决了灵敏度和准确度达不到检测要求的问题。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0007] 一种检测核酸固体样品甲胺及甲胺盐溶剂残留的方法，步骤如下：

[0008] 1)制备对照品溶液：采用甲胺和三乙胺‑异丙醇溶液配置对照品溶液；

[0009] 2)制备供试品溶液：采用样品和三乙胺‑异丙醇溶液进行分散离心，取上清液，获得供试品溶液；

[0010] 3)制备空白溶剂：采用三乙胺‑异丙醇溶液作为空白溶剂；

[0011] 4)进样检测：采用配备FID检测器的气相色谱仪作为检测仪器，分别将空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液进样，进行气相色谱检测，获取检测结果。

[0012] 作为本发明进一步的方案：所述三乙胺‑异丙醇溶液中三乙胺的体积浓度为1％。

[0013] 作为本发明再进一步的方案：步骤1)中，所述对照品溶液的制备方法如下：a)精确称取40％甲胺水溶液55mg，放入10mL容量瓶中，加入三乙胺‑异丙醇溶液进行定容，摇匀，获
得第一对照品储备液；b)精确量取第一对照品储备液200μL，放入10mL容量瓶中，加入三乙
胺‑异丙醇溶液进行定容，摇匀，获得第二对照品储备液；c)精确量取第二对照品储备液
2mL，放入10mL容量瓶中，加入三乙胺‑异丙醇溶液进行定容，摇匀，获得对照品溶液。

[0014] 作为本发明再进一步的方案：步骤2)中，所述供试品溶液的制备方法如下：精确称取适量样品至离心管中，加入0.5‑1.0mL的三乙胺‑异丙醇溶液，离心处理10min，吸取上清
液，获得供试品溶液。

[0015] 作为本发明再进一步的方案：步骤2)中，所述离心处理的转速为4000‑8000rpm。

[0016] 作为本发明再进一步的方案：步骤4)中，进行气相色谱检测时，空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液的进样量为1μL。

[0017] 作为本发明再进一步的方案：步骤4)中，所述气相色谱检测的气相色谱条件为：色谱柱：HP‑5，30m*0.32mm*0.25μm；载气：99.999％氮气；流速：2.0mL/min；进样口：220℃；检
测器：250℃；柱温：在60℃下保温1min，然后以10℃/min升温至120℃,再以20℃/min升温至
200℃，在200℃下保温3min；分流比：10:1。

[0018] 所述的检测方法在测定核酸固体样品甲胺及甲胺盐溶剂残留中的用途。

[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0020] 本发明解决了甲胺难以被检测的技术难题；本发明采用了异丙醇衍生化法使甲胺被异丙醇衍生成较大分子，从而能延长保留时间，提高分离度，提高FID检测的灵敏度；本发
明通过加入三乙胺是甲胺盐以甲胺的形式游离处理提取出来，从而保证检测的准确性。

附图说明

[0021] 图1为进行线性与范围测定时所获得的线形图。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

[0023] 一种检测核酸固体样品甲胺及甲胺盐溶剂残留的方法，步骤如下：

[0024] 1)制备对照品溶液；a)精确称取40％甲胺水溶液55mg，放入10mL容量瓶中，加入1％三乙胺‑异丙醇溶液进行定容，摇匀，获得第一对照品储备液；b)精确量取第一对照品储
备液200μL，放入10mL容量瓶中，加入1％三乙胺‑异丙醇溶液进行定容，摇匀，获得第二对照
品储备液；c)精确量取第二对照品储备液2mL，放入10mL容量瓶中，加入1％三乙胺‑异丙醇
溶液进行定容，摇匀，获得对照品溶液；

[0025] 2)制备供试品溶液：精确称取样品20mg至离心管中，加入0.5mL的1％三乙胺‑异丙醇溶液，在4000rpm下离心处理10min，吸取上清液，获得供试品溶液；

[0026] 3)制备空白溶剂：采用1％三乙胺‑异丙醇溶液作为空白溶剂；

[0027] 4)进样检测：采用配备FID检测器的气相色谱仪作为检测仪器，分别将空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液进样1μL，进行气相色谱检测，获取检测结果。

[0028] 所述气相色谱检测的气相色谱条件为：

[0029] 仪器：岛津GC‑2010plus气相色谱仪配备HS‑10顶空进样器和FID检测器。

[0030] 色谱柱：HP‑5，30m*0.32mm*0.25μm；

[0031] 载气：99.999％氮气；

[0032] 流速：2.0mL/min；进

[0033] 样口：220℃；

[0034] 检测器：250℃；

[0035] 柱温：60℃(1min)，10℃/min→120℃,20℃/min→200℃(3min)；

[0036] 分流比：10:1。

[0037] 判断样品中甲胺及甲胺盐溶剂残留量可接受标准：供试品中甲胺异丙醇衍生物峰面积应小于对照品的峰面积。

[0038] 一、仪器、试剂与样品

[0039] 所用仪器清单如下：

[0040]名称 型号 生产厂家
气相色谱仪 GC‑2010plus 岛津
色谱柱 HP‑5(30m*0.32mm*0.25μm) 岛津技迩
分析天平 Sartorius BT25S 赛多利斯

[0041] 所用试剂及对照品的清单如下：

[0042]试剂 规格 批号 生产厂家
三乙胺 分析纯 BWPICCR 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司
40％甲胺水溶液 分析纯 C10033705 麦克林
异丙醇 分析纯 140211 西陇化工股份有限公司

[0043] 所用供试品的信息如下：

[0044]名称 批号 生产厂家
NKT‑OLIGO 20170810 厦门纽克泰生物技术有限公司

[0045] 二、验证结果汇总

[0046] 对本发明检测方法进行效果验证，验证结果如表1所示。

[0047] 表1本发明方法验证结果

[0048]

[0049]

[0050] 三、对本发明检测方法进行效果验证的各试验过程及结果

[0051] 表2专属性(空白试验及系统适用性试验)

[0052]

[0053]

[0054] 表3重复性试验

[0055]

[0056] 表4中间精密度试验

[0057]

[0058]

[0059] 表5线性与范围测定结果

[0060]

[0061] 表6回收率测定结果

[0062]

[0063]

[0064] 表7溶液稳定性

[0065]

[0066]

[0067] 表8耐用性实验

[0068]

[0069] 表9定量限

[0070]

[0071] 本发明解决了甲胺难以被检测的技术难题；本发明采用了异丙醇衍生化法使甲胺被异丙醇衍生成较大分子，从而能延长保留时间，提高分离度，提高FID检测的灵敏度；本发
明通过加入三乙胺是甲胺盐以甲胺的形式游离处理提取出来，从而保证检测的准确性。

[0072] 上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下
作出各种变化。