一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用

摘要

本公开属于微生物技术领域，具体涉及一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用。采用微生物制剂提高作物的产量及防治病虫害问题，可有效的减少传统化学试剂对土壤的危害作用。本公开提供了一种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c及其复合制剂，该菌株对植物真菌病原菌和植物细菌病原菌有拮抗作用，尤其对植物根腐病的防治效果显著；同时复合制剂应用于大棚番茄实验，可促进果实增产15％；有效防治番茄生长过程中出现的病害，其防治效果高达80％以上；番茄果实各项指标均有提升，其中番茄红素含量有显著提高。在提高作物品质的同时，减少对土壤的危害作用，具有良好的推广意义。

权利要求

1.一种复合菌剂，其特征在于，包括枯草芽孢杆菌（B. subtilis）21c、水生拉恩氏菌（R. aquatilis）27及枯草芽孢杆菌（B. subtilis）4(2)；其中，所述水生拉恩氏菌（R. aquatilis）于2018年8月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC  M 2018566；所述枯草芽孢杆菌（B. subtilis）4(2)菌株于2018年8月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号CCTCC M 2018563；

所述枯草芽孢杆菌（B. subtilis）21c菌株已于2018年8月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，其生物保藏号为： CCTCC M 

2018565；

所述复合菌剂中所述枯草芽孢杆菌（B. subtilis）21c：水生拉恩氏菌（R. aquatilis）

27：枯草芽孢杆菌（B. subtilis）4(2)的比例为1:1:1。

2.如权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌（B. subtilis）21c菌种的培养基为糖蜜 2.5~3.5%，蛋白胨 1.5~2.5%，K2HPO4×3H2O 0.5~1.0%，KH2PO4 0.2~

0.5%，(NH4)2SO4 0.1~0.3%，柠檬酸钠×2H2O 0.02~0.08%，MgSO4×7H2O 0.008~0.012%，余量为水，рН 6-7。

3.如权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中，有效活菌数为≥10亿cfu/mL。

4.如权利要求1-3任一项所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂的剂型为液体菌剂、粉剂或颗粒剂。

5.如权利要求4所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂的剂型为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。

6.如权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中还包括农药学上可接受的辅料。

7.如权利要求6所述的复合菌剂，其特征在于，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。

8.权利要求1-7任一项所述的复合菌剂在下列任一方面的应用：（1）抑制植物真菌病原菌及植物细菌病原菌；

（2）提高番茄果实品质。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物真菌病原菌为尖孢镰刀菌、水稻纹枯病菌、链格孢、灰霉病病原菌、核盘菌、小麦根腐病病原菌、虫疫病病原菌。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物细菌病原菌为欧文式杆菌、根癌土壤杆菌、黄单胞菌、丁香假单胞菌、番茄溃疡病菌、马铃薯黑胫病菌。

11.如权利要求8所述的应用，其特征在于，提高番茄果实中可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C及番茄红素的含量。

说明书

一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本公开涉及微生物技术领域，具体涉及一种具有抗病及提高果实品质功效的的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)21c及其复合菌剂在抗病、提高果实品质方面的应用。

背景技术

[0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技
术。

[0003] 在中国，每年在农业生产过程中因病虫害造成的损失占农业总产值的30％以上，为了挽回这些损失，普遍采用了化学防治、生物防治、遗传防治、物理防治等方法。化学防治
具有防效高、速度快、成本低、使用简便等优点，从而得到迅速发展，成为防治病虫草害的一
个重要手段。但由于化学农药长期大量的反复使用，也带了一些弊端，如污染土壤、水体以
及大气，农副产品中农药的残留量增加，果蔬品质下降，直接危害了人类的健康及生存环
境；同时，长期使用化学农药，造成病害的抗药性增强，导致农药使用频率及用量逐年增加，
形成了恶性循环；此外化学农药在杀死病虫的同时也会杀死农田有益微生物，破坏农业微
生态系统。

[0004] 随着现代生物科技的进步，人们对利用微生物提高林木产量和防治病虫害给予了高度关注。从自然界寻找能够促进植物生长或防治植物病害的有益微生物，利用生物多样
性促进植物生长、改善果实品质和对病害的可持续控制及无害化处理已经显示出良好的应
用前景。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生胞外分泌物枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短
杆菌肽等活性物质，致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用，相关研究表明
某些枯草芽孢杆菌能够抑制部分植物病菌真菌。除此之外，还有相关研究表明，枯草芽孢杆
菌还具有提高茄果类果实品质的效果。基于枯草芽孢杆菌的上述效果，有望作为一种良好
的微生态制剂肥料进行应用。微生态制剂能够很好地解决农药化肥带来的土壤污染及病虫
害抗性等问题，相比化学试剂而言，微生态制剂对土壤的危害程度更低。针对该问题，发明
人认为：目前市面上生物防控微生态制剂产品种类繁多，但仍存在一定的使用缺陷，许多生
防制剂的效果不稳定，预防的病害较为单一、抑菌谱窄。另外，将多种菌株进行配合制成复
合微生物制剂也是本领域内的常见操作，提供更多效果优良的复合微生物制剂有利于促进
微生物制剂的应用。

发明内容

[0005] 针对上述研究背景，发明人认为提供一种具有广谱抑菌效果的菌株有利于克服目前生防制剂防效单一的缺陷。另外，现有技术中针对枯草芽孢杆菌的促生作用进行开发的
菌剂往往侧重于提高作物的亩产量，发明人认为提供一种能够提高农作物果实品质，提高
作物中营养物质的复合菌剂具有良好的应用价值。为了实现上述技术效果，本公开提供以
下技术方案：

[0006] 本公开第一方面，提供一种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c，该菌株已于2018年8月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，其
生物保藏号为：CCTCC M 2018565。

[0007] 第一方面所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c具有SEQ ID NO:1所示的16S rDNA序列。

[0008] 该菌株分离自山东省宁阳县的土壤样品，该序列与其他已知同属的芽孢杆菌的16S rDNA序列有98％的相似性，综合测序与生理生化反应结果确定为枯草芽孢杆菌，定名
为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c。

[0009] 所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c的形态学特征如下：

[0010] 菌体特征：革兰氏阳性直杆，大小为0.6×1.0-1.4μm，具有圆形末端，单个或成对分组，形成内生孢子。孢子是椭圆形的，具有中心或亚顶部定位。孢子囊没有肿胀。

[0011] 菌落特征：NA平板固体培养基培养48h后干燥，有褶皱，规则，奶油状，直径2-4mm，有扁平轮廓。

[0012] 参考伯杰氏系统细菌学手册，所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c的生理生化特征如下：

[0013] 氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸盐的利用、明胶水解实验、普里斯考尔试验、硝酸盐还原试验、丙二酸盐利用试验、淀粉水解试验、酶解酪蛋白试验阳性；吲哚检测、H2S试验、NH3试
验、尿素分解试验、甲基化试验、卵磷脂酶、苯丙氨酸阴性。

[0014] 优选的，上述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c的培养基为糖蜜2.5～3.5％，蛋白胨1.5～2.5％，K2HPO4×3H2O 0.5～1.0％，KH2PO4 0.2～0.5％，(NH4)2SO4 0.1～0.3％，柠檬酸
钠×2H2O 0.02～0.08％，MgSO4×7H2O 0.008～0.12％，余量为水，рН6-7。

[0015] 本公开提供的菌株能够抑制多种植物真菌病原菌及植物细菌病原菌，其中植物真菌病原菌包括但不限于尖孢镰刀菌、水稻纹枯病菌、链格孢、灰霉病病原菌、核盘菌、小麦根
腐病病原菌、虫疫病病原菌；植物细菌病原菌包括但不限于欧文式杆菌、根癌土壤杆菌、黄
单胞菌、波氏假单胞菌、丁香假单胞菌、番茄溃疡病菌、马铃薯黑胫病菌。该菌株的抑菌谱
广，针对引发作物疾病的多种病原菌都有抑制效果，可以有效防止多种病害，减少化学农药
的使用。

[0016] 本公开第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c和/或菌的培养物。

[0017] 优选的，所述菌的培养物通过如下方法制备：将所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c接种于上述培养基中26～34℃下培养24～48h，搅拌速率100～260rpm/min。

[0018] 本公开第三方面，提供一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一方面所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c、水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)27及枯草芽孢杆菌
(B.subtilis)4(2)和/或各菌株的培养物，其中水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27于2018年8
月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌
珞珈山，保藏号：CCTCC M 2018566；所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)菌株于2018年8月
23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞
珈山，保藏号CCTCCM 2018563。

[0019] 经本公开实验验证，该复合菌剂应用于茄果类作物的种植，能够有效提高果实中营养成分的含量。现有技术中针对枯草芽孢杆菌的促生作用往往体现在对植物生长重量、
高度及果实重量的增产效果，而本公开中筛选得到的复合菌剂应用于茄果类植株的生产，
实现的是果实中营养成分的提升。该复合菌剂应用于番茄的生产，可有效提高果实中可溶
性糖含量、可溶性蛋白、维生素C、可滴定酸、番茄红素等主要营养物质的含量。

[0020] 优选的，所述复合菌剂中，所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c：水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)的比例为0.8-3:0.8-3:0.8-4。

[0021] 进一步优选的，所述复合菌剂中，三种菌的比例为1:1:1。

[0022] 进一步优选的，所述复合菌剂中，有效活菌数为≥10亿/mL。

[0023] 由于菌株对培养基的营养需求不同，菌株胞外分泌物的种类不同等，不同菌种处于混合状态时有可能表现出抑制、促进的效果，菌株的比例不同，其共同表现出的效果也不
相同，经本公开验证，上述比例下的三种菌株混合时，制备成为微生物制剂的作用效果较
好。

[0024] 优选的，所述水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27的培养基为玉米淀粉2.5～3.5％，蛋白胨1.5～2.5％，K2HPO4×3H2O 0.6～0.8％，KH2PO4 0.2～0.4％，(NH4)2SO40.1～0.2％，柠
檬酸钠×2H2O 0.1～0.2％，MgSO4×7H2O 0.05～1.5％，余量为水；和/或发酵条件为рН5.5
～7；30～40℃，搅拌速率120～180rpm/min，培养36～50小时，获得水生拉恩氏菌
(R.aquatilis)27发酵液。

[0025] 优选的，所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)的培养基为糖蜜2.5～3.5％，蛋白胨1.5～2.5％，K2HPO4×3H2O 0.6～0.8％，KH2PO4 0.2～0.4％，(NH4)2SO4 0.1～0.2％，柠檬
酸钠×2H2O 0.1～0.2％，MgSO4×7H2O 0.05～1.5％；余量为水；和/或发酵条件为рН5.5～
7；30～40℃，搅拌速率120～180rpm/min，培养18-36小时，获得枯草芽孢杆菌(B.subtilis)
4(2)发酵液。

[0026] 优选的，第二方面所述菌剂或第三方面所述复合菌剂剂型为液体菌剂、粉剂或颗粒剂；进一步的为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。

[0027] 作为优选，所述菌剂或复合菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中
的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市
售产品即可。

[0028] 本公开第四方面，提供上述第一方面所述菌株、第二方面所述菌剂和/或第三方面所述复合菌剂在下列任一方面的应用：

[0029] (1)抑制植物真菌病原菌及植物病细菌病原菌；

[0030] (2)提高果实品质；

[0031] 优选的，所述植物真菌病原菌包括但不限于尖孢镰刀菌、水稻纹枯病菌、链格孢、灰霉病病原菌、核盘菌、小麦根腐病病原菌、虫疫病病原菌；

[0032] 优选的，所述植物细菌病原菌包括但不限于欧文式杆菌、根癌土壤杆菌、黄单胞菌、丁香假单胞菌、番茄溃疡病菌、马铃薯黑胫病菌；

[0033] 优选的，所述促进植物生长体现在提高果实品质；进一步的，提高番茄果实中包括但不限于可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C、可滴定酸及番茄红素的含量；所述植物包括但不
限于番茄、生菜、黄瓜和小麦。

[0034] 与现有技术相比，本公开的有益效果是：

[0035] 1、本公开中的菌株具有良好广谱抑菌效果，针对引发农作疾病的多种植物真菌病原菌及细菌病原菌都具有良好的抑制效果。采用该菌株及包含该菌株培养物的菌剂制备微
生物复合制剂可有效克服现有产品的防效单一的缺陷。

[0036] 2、本公开针对上述菌株进一步提供了一种复合菌株产品，当三种菌株以一定比例混合后，能够获得较高的活菌数量，并且经本公开实验验证该复合菌剂具有良好的抑菌、防
病及提高果实品质的功效。相比现有技术中采用枯草芽孢杆菌应用于番茄产量的提升，本
公开的菌剂不仅具有提升产量的效果，还能够实现提高果实中营养成分含量的效果。应用
于实际生产，一方面可以降低农药及肥料的使用剂量，一方面可以提高果实品质，提高经济
收益。

附图说明

[0037] 构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

[0038] 图1为实施例1中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c显微镜下观察图；

[0039] 图2为实施例1中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c菌落形态图；

[0040] 图3为实施例1中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c对丁香假单胞菌拮抗实验图。

具体实施方式

[0041] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常
理解的相同含义。

[0042] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式
也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包
括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

[0043] 正如背景技术所介绍的，采用微生物制剂提高作物的产量及防治病虫害问题，可有效的减少传统化学试剂对土壤的危害作用。本公开提供了一种枯草芽孢杆菌
(B.subtilis)21c及其复合制剂，该菌株对植物真菌病原菌和植物细菌病原菌有拮抗作用，
尤其对植物根腐病的防治效果显著；同时复合制剂应用于大棚番茄实验，可促进果实增产
22％；有效防治番茄生长过程中出现的病害，其防治效果高达80％以上；番茄果实各项指标
均有提升，其中番茄红素含量有显著提高。在提高作物品质的同时，减少对土壤的危害作
用，具有良好的推广意义。。

[0044] 实验过程中涉及的普通培养基及其成分如下：

[0045] NB培养基：蛋白胨-1％，牛肉粉-0.3％，氯化钠-0.5％；琼脂-2％为NA培养基。

[0046] PDA培养基：土豆-20％，葡萄糖-2％，琼脂-2％。

[0047] 本公开提供的具有抗病提高果实品质的枯草芽孢杆菌已于2018年8月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，其生物保藏号
为：CCTCC M 2018565。

[0048] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

[0049] 实施例1

[0050] 一、菌株的筛选与鉴定

[0051] 从山东省宁阳县收集土壤样品，称取1g样品接入100ml无菌水中，30℃恒温箱中震荡培养5-7d，对土壤样液进行105-106倍数稀释，稀释液涂布在含有NA固体培养基的平板内，
30℃培养过夜。从长出菌落的平板上分离菌株并纯化，接入NA斜面培养基保存。

[0052] 显微镜下观察纯化后的菌株特征(如图1、图2)：细菌形状的革兰氏阳性直杆，大小为0.6×1.0-1.4μm，具有圆形末端，单个或成对分组，形成内生孢子。孢子是椭圆形的，具有
中心或亚顶部定位。孢子囊没有肿胀。菌落干燥，有褶皱，规则，奶油状，直径2-4mm，有扁平
轮廓。

[0053] 参考伯杰氏系统细菌学手册鉴定方法，利用氧化实验、硫化氢实验、尿素分解实验、柠檬酸利用实验、明胶水解实验、硝酸盐还原实验等生理生化反应进一步验证目的菌
株，结果如表1所示。

[0054] 表1、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c生理生化反应

[0055]

[0056] 挑取单菌落接种至NB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养24h，取1-5ml菌液利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA。16S  rRNA通用引物8f(5'-
agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')对该菌株基因组DNA扩
增并送至上海生工生物公司测序。BLAST软件比对分析该菌株与以下菌株的同一性可达
98％：Bacillus velezensis FZB42(98％),Bacillus subtilis subsp.subtilis 168
(98％),Bacillus subtilis IAM 12118(98％),Bacillus amyloliquefaciens MPA 1034
(98％),Bacillus amyloliquefaciens NBRC 15535(98％)；MALDI-TOF质谱分析其与
Bacillus subtilis准确率达2.201。

[0057] 综合测序与生理生化反应结果确定该菌株属于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c，将其送入中国典型培养物保藏中心(武汉大学)进行保
藏，保藏号为CCTCC M 2018565。

[0058] 二、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c的抗病抑菌作用

[0059] 在实验室研究基础上选用改良后的Maynell’s培养基作为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c的发酵培养基，其成分与发酵条件如下：糖蜜–3.0％，蛋白胨–2.0％，
K2HPO4×3H2O–0.7％，KH2PO4–0.3％，(NH4)2SO4–0.15％，柠檬酸钠×2H2O–0.05％，MgSO4×
7H2O–0.01％，余量为水，рН6.8；培养条件为：30℃培养28h，搅拌速率180rpm/min。

[0060] 采用平板打孔拮抗法测定枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c对农业主要致病细菌和真菌的抑制作用，下层培养基为2％NA培养基，凝固后取1ml病原菌与5ml 1.2％NA培养基
(1.2％PDA培养基)充分混匀作上层培养基，凝固后打孔器打孔，加入100μl枯草芽孢杆菌
(B.subtilis)21c菌液，于冰箱内静置2h，37℃(细菌)/28℃(真菌)正置培养48小时。通过测
量抑菌圈直径，检测待测菌的抑菌能力，表2、表3。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c对植物真
菌病原菌(尖孢镰刀菌、水稻纹枯病菌、链格孢、灰霉病病原菌、核盘菌、小麦根腐病病原菌、
虫疫病病原菌)和植物细菌病原菌(欧文式杆菌、根癌土壤杆菌、黄单胞菌、波氏假单胞菌、
丁香假单胞菌、番茄溃疡病菌、马铃薯黑胫病菌)均有良好的抑制作用，抑菌圈分别为24-
30mm和20-30mm。

[0061] 表2、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c对植物真菌病原菌的抑制作用

[0062]

[0063] 表3、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c对植物细菌病原菌的抑制作用

[0064]

[0065] 三、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c的应用

[0066] 水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27菌种保藏单位为武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M 2018566。水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27其培养基及发酵条件为：玉
米淀粉3.0％，蛋白胨2.0％，K2HPO4×3H2O 0.7％，KH2PO4 0.3％，(NH4)2SO4 0.15％，柠檬酸
钠×2H2O 0.05％，MgSO4×7H2O 0.01％，余量为水，рН 6.8；37℃，搅拌速率150rpm/min，培
养48小时，获得水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27发酵液。

[0067] 枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M 2018563，其菌液制备方式：糖蜜3.0％，蛋白胨2.0％，K2HPO4×3H2O 0.7％，
KH2PO4 0.3％，(NH4)2SO4 0.15％，柠檬酸钠×2H2O 0.05％，MgSO4×7H2O 0.01％，余量为水，
рН6.8；37℃，搅拌速率180rpm/min，培养28小时，获得枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)发
酵液。

[0068] 1、复合制剂的产品特征

[0069] 一种复合制剂，由水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液按照一定比例制得。设置不同的比例配比产
品：

[0070] 配方1、水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液＝1:1:1；

[0071] 配方2、水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液＝3:3:4；

[0072] 配方3、水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液＝2:4:4。

[0073] 对复合制剂的基本特性进行测定，情况如表4所示：复合制剂为液态深褐色，具有特殊气味，pH值7.5-8.0，活菌数为≥10亿cfu/ml。复合制剂对植物病原真菌和植物病原细
菌均有拮抗作用，本实施例中以尖孢镰刀菌及丁香假单胞菌作为真菌病原菌及细菌病原菌
的代表，对其抑菌作用进行考察，抑菌圈分别为24(2)9mm和23-27mm(表5)。

[0074] 表4、复合制剂的基本特性

[0075]

[0076] 表5、复合制剂对植物病原菌的拮抗作用

[0077]

[0078] 2、复合制剂的植物保护作用

[0079] 将三株菌的发酵液按照三个配方中的比例分别混合后，稀释50倍，得到三个2％浓度的复合制剂，2％浓度的复合制剂(三个配方)分别处理后的番茄、黄瓜、生菜种子，感染根
腐病病原菌后置于培养箱内培养，2周后统计各组根腐病发病率(表6)，病情分级标准：0级，
全植株无病；1级，茎基部有很少病斑，占茎基部面积1/5以下；2级，茎基部有少数病斑，占茎
基部面积的1/5-1/3；3级，茎基部有许多病斑，占茎基部面积1/3-2/3，叶片出现黄叶现象；4
级，茎基部全部染病斑，植株枯萎。

[0080]

[0081]

[0082] 表6、复合制剂的植物保护作用

[0083]

[0084] 统计结果显示经2％浓度的复合制剂处理后可以使根腐病的发病率降低25-52％。

[0085] 综合复合制剂拮抗实验与植物保护实验效果，三种发酵液比例为1:1:1时复合制剂的植物保护作用与抑菌效果最好。

[0086] 3、复合制剂的大棚实验

[0087] 复合制剂使用方法的研究及使用效果评价在番茄大棚中展开实验，大棚占地500m2，共分为5组，每组占地面积100m2，栽番茄苗300棵，每组使用有机肥与无机肥量相同，
除以下变量外，实行统一管理。每周取样一次，定期测定植株的产量及病害发展。

[0088] 实验组一：水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液＝1:1:1，微生物制剂的使用量为18ml/m2，随水冲
施，不使用农药；

[0089] 实验组二：水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液＝3:3:4，微生物制剂的使用量为18ml/m2，随水冲
施，不使用农药；

[0090] 实验组三：水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液＝2:4:4，微生物制剂的使用量为18ml/m2，随水冲
施，不使用农药；

[0091] 对照组1：正常使用农药。

[0092] 对照组2：不使用农药。

[0093] 使用复合制剂可有效提高果实产量(表7)，其中实验组一中果实收获产量比对照组高15.82％，且实验组一较另两个实验组效果稍好。

[0094] 表7不同实验组中番茄不同时间收获产量(kg)

[0095]

[0096] 注：A-对照组1，B-实验组一，C-实验组二，D-实验组三

[0097] 表8、复合制剂对番茄病害的防效

[0098]

[0099] 注：A-对照组1，B-对照组2，C-实验组一，D-实验组二，E-实验组三

[0100] 于番茄苗栽种后开始统计病发情况，表8结果显示，使用本制剂可有效防治番茄生长过程中出现的病害，实施例一对植株病害的防治效果稍好于使用农药的对照组，该结果
说明该复合制剂一定程度上可以替代农药达到防治病害的目的。

[0101]

[0102] 4、番茄果实品质鉴定

[0103] 番茄生长90-100天进行果实采摘，每组选择果实1-3个，测定可溶性糖含量、可溶性蛋白、维生素C、可滴定酸、番茄红素等指标(表9)。结果显示，使用复合制剂产品的实验组
各指标均有所提高。其中，实验组维生素C、番茄红素与可溶性蛋白提升明显。

[0104] 表9、复合制剂对番茄果实品质的影响

[0105]

[0106] 注：A-对照组1，B-实验组一，C实验组二，D-实验组三

[0107] 以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修
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