一种脂肪酶突变体及其在去污方面的应用

摘要

本发明公开了一种脂肪酶突变体及其在去污方面的应用，属于酶工程技术领域。本发明脂肪酶突变体的热稳定性好、pH稳定性好、洗涤性能好，因此，本发明的脂肪酶突变体在去污、油脂加工、乳品加工、面食加工、肉类加工、药物合成、柴油合成、高分子合成、手性化合物合成、皮革生产、制备洗涤剂和造纸等方面均有很重要的应用。

权利要求

1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第235位丝氨酸突变为丙氨酸、第343位丝氨酸突变为酪氨酸、第

332位谷氨酰胺突变为苯丙氨酸、第310位天冬氨酸突变为缬氨酸、第151位丝氨酸突变为天冬酰胺、第171位赖氨酸突变为精氨酸、第275位甘氨酸突变为丙氨酸、第180位亮氨酸突变为组氨酸、第316位苯丙氨酸突变为半胱氨酸、第340位甘氨酸突变为半胱氨酸、第178位丝氨酸突变为半胱氨酸以及第238位谷氨酰胺突变为半胱氨酸得到的。

2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的脂肪酶突变体。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求2所述的基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带权利要求2所述的基因或权利要求3的所述重组质粒。

5.一种洗涤剂，其特征在于，所述洗涤剂含有权利要求1所述的脂肪酶突变体。

6.如权利要求5所述的一种洗涤剂，其特征在于，所述洗涤剂含有权利要求1所述的脂肪酶突变体、表面活性剂以及缓冲液。

7.一种去污方法，其特征在于，所述方法为在需去污物品中添加权利要求1所述的脂肪酶突变体；或者，所述方法为在需去污物品中添加权利要求5或6所述的洗涤剂。

8.权利要求1所述的脂肪酶突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组质粒或权利要求4所述的宿主细胞在油脂加工、乳品加工、面食加工、肉类加工、药物合成、柴油合成、高分子合成、手性化合物合成、皮革生产、制备洗涤剂或造纸方面的应用。

9.权利要求1所述的脂肪酶突变体或权利要求5或6所述的洗涤剂或权利要求7所述的去污方法在去污方面的应用。

说明书

一种脂肪酶突变体及其在去污方面的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种脂肪酶突变体及其在去污方面的应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

[0002] 脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3，甘油酯水解酶)是水解脂肪的一类酶的总称。在有些反应系统中，脂肪酶可以催化水解、醇解、转酯、氢解、间接氧化还原转酯化作用，此外，脂肪酶还具有水解外消旋混合物以及酯合成和合成肽键的能力，因此，脂肪酶在很多领域均具有重要的应用，例如：

[0003] 1、脂肪酶可在油脂加工中应用，油脂的脂肪酶水解可在常温常压下进行，因此，不会使得油脂中的高度不饱和脂肪酸和生育酚等生物物质变性；

[0004] 2、脂肪酶可在乳品加工中应用，应用脂肪酶在乳品中进行乳脂水解，可增强干酪、奶粉、奶油的风味，促进干酪的成熟，改善乳制品的品质；

[0005] 3、脂肪酶可在面食加工中应用，在面食中加入脂肪酶，可使产品的弹性得到不同程度的提高，面皮薄而透明但不易破裂，改善食感，另外，在面食中加入脂肪酶，可释放出单酸甘油酯，延缓腐败，提高面食的保鲜能力；

[0006] 4、脂肪酶可在肉类加工中应用，在肉类中加入脂肪酶，可有效降解肉类中的脂类，制作无脂肪肉；

[0007] 5、脂肪酶可在药物合成中应用，微生物脂肪酶被用来从动物和植物中富集多不饱和脂肪酸，游离的多不饱和脂肪酸和它们的单双甘酯被用来生产各种药物，如硫氮草酮、萘普生、卡托普利等药物的合成中都要用到脂肪酶；

[0008] 6、脂肪酶可在柴油合成中应用，酶法合成柴油就是利用脂肪酶催化动植物油脂与低碳醇间的酯交换反应生成相应的脂肪酸酯，和传统化学催化合成柴油相比，该法具有提纯工艺简单、投资设备少、耗能低、污染小、对油脂原料要求低等优点，已日益引起人们的普遍关注；

[0009] 7、脂肪酶可在高分子合成中应用，当前，人工合成的高分子材料造成了严重的环境污染，因此，应用酶催化法合成可以被微生物降解的该分子材料越来越受到人们的重视；

[0010] 8、脂肪酶可在手性化合物合成中应用，脂肪酶可以在非水解质中起作用，其在非水解质中的酶催化反应可合成具有光学活性的醇、脂肪酸、内酯等医药农药中间体。

[0011] 9、脂肪酶可在皮革生产中应用，在皮革的加工过程中，一个重要的步骤是脱除与皮革或皮毛紧密相连的残余脂肪和蛋白质，其中，皮内脂肪由于受到脂肪膜的保护，很难被石灰处理等化学处理方法去除，利用脂肪酶的分解作用或与蛋白酶混合使用，能够轻易进入脂肪内部将其乳化出来，明显提高了皮革质量；

[0012] 10、脂肪酶可在制备洗涤剂中应用，应用遗传工程开发出洗涤剂用脂肪酶是现代生物技术大规模工业化最成功的的应用之一；

[0013] 11、脂肪酶可在造纸合成中应用，“洽脂”是木材中所有疏水性成分的总称，包括三甘酯和蜡脂，它会在干燥柱上沉积而影响纸的质量和生产能力，脂肪酶可除去纸浆中的“洽脂”，改善纸的质量。

[0014] 然而，脂肪酶的大多数应用都对脂肪酶的稳定性有一定的要求，例如，药物合成的过程中，常需使用较高的温度，这对脂肪酶的热稳定性有了更高的要求；皮革加工和造纸过程中需使用强碱，这对脂肪酶在碱性条件下的pH稳定性有了更高的要求，而现有的大多数脂肪酶稳定性都比较差，例如，来源于少根根霉(Rhizopus arrhizus)的脂肪酶RAL，其最适温度仅有35℃，在50℃下热处理10min后，只能残余40％的酶活，处理到40min后，酶活会完全丧失，其在pH大于9.5的条件下，会损失70％以上活性，这无疑大大限制了脂肪酶在上述应用中的进一步发展。

[0015] 因此，急需提供一种稳定性，尤其是热稳定性和在碱性条件下pH稳定性强的脂肪酶。

发明内容

[0016] [技术问题]

[0017] 本发明要解决的技术问题是提供一种稳定性，尤其是热稳定性和在碱性条件下pH稳定性强的脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)。

[0018] [技术方案]

[0019] 为解决上述问题，本发明提供了一种脂肪酶突变体，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第151位、第235位、第171位、第343位、第275位、第332位、第310位或第180位氨基酸进行突变得到的；

[0020] 或者，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第316位以及第340位氨基酸同时进行突变得到的；

[0021] 或者，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第178位以及第238位氨基酸同时进行突变得到的；

[0022] 或者，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第316位、第340位、第178位以及第238位氨基酸同时进行突变得到的；

[0023] 或者，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第235位、第343位、第332位以及第310位氨基酸同时进行突变得到的；

[0024] 或者，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第151位、第171位、第275位以及第180位氨基酸同时进行突变得到的；

[0025] 或者，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第235位、第343位、第332位、第310位、第151位、第171位、第275位以及第180位氨基酸同时进行突变得到的；

[0026] 或者，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第235位、第343位、第332位、第310位、第151位、第171位、第275位、第180位、第316位、第340位、第178位以及第238位氨基酸同时进行突变得到的。

[0027] 在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第151位丝氨酸突变为天冬酰胺得到的(S151N)，命名为L1；

[0028] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第235位丝氨酸突变为丙氨酸得到的(S235A)，命名为L2；

[0029] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第171位赖氨酸突变为精氨酸得到的(K171R)，命名为L3；

[0030] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第343位丝氨酸突变为酪氨酸得到的(S343Y)，命名为L4；

[0031] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第275位甘氨酸突变为丙氨酸得到的(G275A)，命名为L5；

[0032] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第332位谷氨酰胺突变为苯丙氨酸得到的(Q332F)，命名为L6；

[0033] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第310位天冬氨酸突变为缬氨酸得到的(D310V)，命名为L7；

[0034] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第180位亮氨酸突变为组氨酸得到的(L180H)，命名为L8；

[0035] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第316位苯丙氨酸突变为半胱氨酸以及第340位甘氨酸突变为半胱氨酸得到的(F316C\G340C)，命名为L9；

[0036] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第178位丝氨酸突变为半胱氨酸以及第238位谷氨酰胺突变为半胱氨酸得到的(S178C\Q238C)，命名为L10；

[0037] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第316位苯丙氨酸突变为半胱氨酸、第340位甘氨酸突变为半胱氨酸、第178位丝氨酸突变为半胱氨酸以及第238位谷氨酰胺突变为半胱氨酸得到的(F316C\G340C\S178C\Q238C)，命名为L11；

[0038] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第235位丝氨酸突变为丙氨酸、第343位丝氨酸突变为酪氨酸、第332位谷氨酰胺突变为苯丙氨酸以及第310位天冬氨酸突变为缬氨酸得到的(S235A\S343Y\Q332F\D310V)，命名为L12；

[0039] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第151位丝氨酸突变为天冬酰胺、第171位赖氨酸突变为精氨酸、第275位甘氨酸突变为丙氨酸以及第180位亮氨酸突变为组氨酸得到的(S151N\K171R\G275A\L180H)，命名为L13；

[0040] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第235位丝氨酸突变为丙氨酸、第343位丝氨酸突变为酪氨酸、第332位谷氨酰胺突变为苯丙氨酸、第310位天冬氨酸突变为缬氨酸、第151位丝氨酸突变为天冬酰胺、第171位赖氨酸突变为精氨酸、第275位甘氨酸突变为丙氨酸以及第180位亮氨酸突变为组氨酸得到的(S235A\S343Y\Q332F\D310V\S151N\K171R\G275A\L180H)，命名为L14；

[0041] 或者，所述脂肪酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的第235位丝氨酸突变为丙氨酸、第343位丝氨酸突变为酪氨酸、第332位谷氨酰胺突变为苯丙氨酸、第310位天冬氨酸突变为缬氨酸、第151位丝氨酸突变为天冬酰胺、第171位赖氨酸突变为精氨酸、第275位甘氨酸突变为丙氨酸、第180位亮氨酸突变为组氨酸、第316位苯丙氨酸突变为半胱氨酸、第340位甘氨酸突变为半胱氨酸、第178位丝氨酸突变为半胱氨酸以及第238位谷氨酰胺突变为半胱氨酸得到的(S235A\S343Y\Q332F\D310V\S151N\K171R\G275A\L180H\F316C\G340C\S178C\Q238C)，命名为L15。

[0042] 本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述脂肪酶突变体。

[0043] 本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。

[0044] 在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的表达载体为pPIC9K载体、pPIC3.5K载体、pPICZα载体或pPICZ载体。

[0045] 本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。

[0046] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为真菌或细菌。

[0047] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母。

[0048] 本发明还提供了一种洗涤剂，所述洗涤剂含有上述脂肪酶突变体。

[0049] 在本发明的一种实施方式中，其特征在于，所述洗涤剂含有上述脂肪酶突变体、表面活性剂以及缓冲液。

[0050] 在本发明的一种实施方式中，所述表面活性剂可为十二烷基硫酸钠(SDS)、乙氧基化烷基硫酸钠(AES)、脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO-9)和/或月桂基磺化琥珀酸单酯二钠(DLS)。

[0051] 在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液可为磷酸缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或碳酸钠盐缓冲液。

[0052] 在本发明的一种实施方式中，所述洗涤剂中上述脂肪酶突变体的浓度为10～400U/L。

[0053] 本发明还提供了一种去污方法，所述方法为在需去污物品中添加上述脂肪酶突变体；或者，所述方法为在需去污物品中添加上述洗涤剂。

[0054] 本发明还提供了上述脂肪酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在油脂加工、乳品加工、面食加工、肉类加工、药物合成、柴油合成、高分子合成、手性化合物合成、皮革生产、制备洗涤剂或造纸方面的应用。

[0055] 本发明还提供了上述脂肪酶突变体或上述洗涤剂或上述去污方法在去污方面的应用。

[0056] [有益效果]

[0057] (1)本发明脂肪酶突变体的热稳定性较野生型有了明显的改善，其中，L11的最适温度可达45℃，较野生型提高了5℃，L11的Tm值可达49.2℃，较野生型提高4.2℃，L11的在65℃的半衰期为3.9min，是野生型的4.59倍；L12的最适温度为45℃，较野生型提高了5℃，Tm值可达50.3℃，较野生型提高5.3℃，L12的在65℃的半衰期为4.9min，是野生型的5.76倍；L13的最适温度为43℃，较野生型提高了3℃，Tm值可达53.8℃，较野生型提高8.8℃，L13的在65℃的半衰期为7.6min，是野生型的8.94倍；L14的最适温度为48℃，较野生型提高了8℃，Tm值可达60.8℃，较野生型提高15.8℃，L14的在65℃的半衰期为19.8min，是野生型的
23.29倍；L15的最适温度可达50℃，较野生型提高了10℃，Tm值可达68.8℃，较野生型提高
23.8℃，L15的在65℃的半衰期为56.2min，是野生型的66.11倍；L1～L10的热稳定性也相比于野生型有了一定的改善；

[0058] (2)本发明脂肪酶突变体的pH稳定性较野生型有了明显的改善，其中，L9的最适pH由野生型的8.0提升至8.5；L11的最适pH由野生型的8.0提升至9.0，L11在pH为10的条件下的酶活可达最适pH条件下的酶活的80.5％，较野生型提高了10.73倍，L11在pH为10的条件下处理30min后的残余酶活可达90.8％，较野生型提高了2.20倍；L15的最适pH由野生型的8.0提升至9.0；L15在pH为10的条件下的酶活可达最适pH条件下的酶活的75.2％，较野生型提高了10.02倍，L15在pH为10的条件下处理30min后的残余酶活可达100％，较野生型提高了2.43倍；

[0059] (3)本发明脂肪酶突变体的洗涤性能好，其中，使用L9洗涤油污布的去油率可达92.8％；使用L11洗涤油污布的去油率可达93.5％；使用L15洗涤油污布的去油率可达
93.6％；

[0060] (4)本发明脂肪酶突变体的热稳定性好、pH稳定性好、洗涤性能好，因此，本发明的脂肪酶突变体在去污、油脂加工、乳品加工、面食加工、肉类加工、药物合成、柴油合成、高分子合成、手性化合物合成、皮革生产、制备洗涤剂和造纸等方面均有很重要的应用。

附图说明

[0061] 图1：含有编码不同突变体基因的重组质粒的全质粒PCR扩增电泳图；

[0062] 其中，M为DL10000DNA分子量标准，1为含有编码突变体S151N的基因的重组质粒的全质粒PCR扩增电泳结果，2为含有编码突变体S235A的基因的重组质粒的全质粒PCR扩增电泳结果，3为含有编码突变K171R的基因的重组质粒的全质粒PCR扩增电泳结果。

[0063] 图2：含有编码不同突变体基因的毕赤酵母工程菌的发酵上清液的蛋白纯化SDS-PAGE电泳图；

[0064] 其中，M为DL10000DNA分子量标准，1为含有编码突变体S151N的基因的毕赤酵母工程菌的发酵上清液的蛋白纯化SDS-PAGE电泳结果，2为含有编码突变体S235A的基因的毕赤酵母工程菌的发酵上清液的蛋白纯化SDS-PAGE电泳结果，3为含有编码突变K171R的基因的毕赤酵母工程菌的发酵上清液的蛋白纯化SDS-PAGE电泳结果。

[0065] 图3：野生型、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10在不同温度下的相对酶活。

[0066] 图4：野生型、L11、L12、L13、L14、L15、L16以及L17在不同温度下的相对酶活。

[0067] 图5：野生型、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10在不同pH下的相对酶活。

[0068] 图6：野生型、L11、L12、L13、L14、L15、L16以及L17在不同pH下的相对酶活。

具体实施方式

[0069] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

[0070] 下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109购自生工生物工程(上海)有限公司；下述实施例中涉及的毕赤酵母GS115购自Invitrogen公司；下述实施例中涉及的pPIC9K载体购自Invitrogen公司。

[0071] 下述实施例中涉及的检测方法如下：

[0072] 脂肪酶酶活的检测方法：

[0073] pNPP法，具体参考文献：Pencreach G  et al.Enzyme  and Microbial Technol.1996,18:417-422.。

[0074] 其中，脂肪酶酶活的定义为：在pH 8.0，40℃的条件下反应，每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位(1U)。

[0075] 下述实施例中涉及的培养基如下：

[0076] LB液体培养基(m/m)：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％，pH7.0。

[0077] YPD液体培养基(m/m)：酵母提取物1％、胰蛋白胨2％、葡萄糖2％，121℃高压灭菌20min。

[0078] YPD平板(m/m)：酵母提取物1％、胰蛋白胨2％、葡萄糖2％、琼脂2％，121℃高压灭菌20min。

[0079] MD平板(m/m)：无氨基酵母氮源1.34％、生物素4×10-5％、葡萄糖2％、琼脂2％。

[0080] MM平板(m/m)：无氨基酵母氮源1.34％、生物素4×10-5％、甲醇0.5％、琼脂2％。

[0081] BMGY培养基(m/m)：酵母提取物1％、胰蛋白胨2％。

[0082] 实施例1：野生型脂肪酶的表达

[0083] 具体步骤如下：

[0084] 从华根霉(Rhizopus chinonsis)中扩增得到编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶的基因；将获得的基因proRCL通过Not I和EcoR I双酶切与pPIC9K载体连接，得到重组质粒pPIC9K-proRCL；将重组质粒pPIC9K-proRCL转化至大肠杆菌JM109中，得到大肠杆菌工程菌E.coli JM109/pPIC9K-proRCL；将E.coli JM109/pPIC9K-proRCL涂布于LB平板(含100mg/L卡那霉素)上，于37℃培养10h后，筛选阳性克隆并测序确认，得到验证正确的重组质粒pPIC9K-proRCL；将重组质粒pPIC9K-proRCL用Sal I线性化后，电转化入毕赤酵母GS115中，得到毕赤酵母工程菌Pichia GS115/pPIC9K-proRCL；将毕赤酵母工程菌Pichia GS115/pPIC9K-proRCL涂布于MD平板(含100mg/L卡那霉素)上，于37℃培养10h后，提取基因组、PCR鉴定确定阳性克隆，得到阳性转化子；将阳性转化子接种于含25mLBMGY培养基的250mL摇瓶中，30℃、250r/min培养至OD600为4.0，得到菌液；将菌液于8000r/min离心5min后收集菌体，用100mL的BMMY培养基重悬菌体至OD600为1.0，得到重悬液；将重悬液于30℃、
250r/min继续培养，每24h补加0.5％(体积比)甲醇诱导表达，96h后收集菌液，将菌液于
8000r/min离心5min，得到含有野生型酶的上清液；将上清液利用镍柱进行亲和层析，在
250mmol/L咪唑浓度时洗脱目的蛋白，得到纯化后的野生型酶，命名为野生型；

[0085] 其中，扩增引物如下：

[0086] Fm：5’-TCAAGATCCCTAGGGTTCCTGTTGCTGGTCATAAAGGTTC-3’(SEQ ID NO.2)；

[0087] Rm：5’-AATTCCAGTGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGAGAAGAACCCAAACAGCTTCCTTCGTTAATACC-3’(SEQ ID NO.3)。

[0088] 实施例2：脂肪酶突变体的制备及表达

[0089] 具体步骤如下：

[0090] 利用全质粒PCR技术，以实施例1获得的重组质粒pPIC9K-proRCL为模板进行定点突变，获得突变体S151N、S235A、K171R、S343Y、G275A、Q332F、D310V、L180H、F316C\G340C、S178C\Q238C、F316C\G340C\S178C\Q238C、S235A\S343Y\Q332F\D310V、S151N\K171R\G275A\L180H、S235A\S343Y\Q332F\D310V\S151N\K171R\G275A\L180H、S235A\S343Y\Q332F\D310V\S151N\K171R\G275A\L180H\F316C\G340C\S178C\Q238C、D159R以及T319V；

[0091] 其中，突变引物为：

[0092] S151N：

[0093] S151N-Fm：5’-CTGCTTACTGTCGTAACGTCGTTCCAGGTACC-3’(SEQ ID NO.4)；

[0094] S151N-Rm：5’-GGTACCTGGAACGACGTTACGACAGTAAGCAG-3’(SEQ ID NO.5)；

[0095] S235A：

[0096] S235A-Fm：5’-GTTTCCTTTCCGCATACAACCAAGTTGTCAAAG-3’(SEQ ID NO.6)；

[0097] S235A-Rm：5’-CTTTGACAACTTGGTTGTATGCGGAAAGGAAAC-3’(SEQ ID NO.7)；

[0098] K171R：

[0099] K171R-Fm：5’-GTCTCAAGTATGTTCCTGATGGTAGGCTTATCAAGAC-3’(SEQ ID NO.8)；

[0100] K171R-Rm：5’-GTCTTGATAAGCCTACCATCAGGAACATACTTGAGAC-3’(SEQ ID NO.9)；

[0101] S343Y：

[0102] S343Y-Fm：5’-CCCGGTGTCGAATATTGGATCAAGGAAGAC-3’(SEQ ID NO.10)；

[0103] S343Y-Rm：5’-GGGGTGAAGATAACCGGCGGCTTGAGGAGG-3’(SEQ ID NO.11)；

[0104] G275A：

[0105] G275A-Fm：5’-GCCTTGCTCGCTGCCATGGATCTCTACCAACGTG-3’(SEQ ID NO.12)；

[0106] G275A-Rm：5’-CACGTTGGTAGAGATCCATGGCAGCGAGCAAGGC-3’(SEQ ID NO.13)；

[0107] Q332F：

[0108] Q332F-Fm：5’-CCCTCATGTTCCTCCTTTCGCCTTCGGTTATCTTC-3’(SEQ ID NO.14)；

[0109] Q332F-Rm：5’-GAAGATAACCGAAGGCGAAAGGAGGAACATGAGGG-3’(SEQ ID NO.15)；

[0110] D310V：

[0111] D310V-Fm：5’-CATTCGCTTACTACGTCGTCAGCACCGGAATTCCC-3’(SEQ ID NO.16)；

[0112] D310V-Rm：5’-GGGAATTCCGGTGCTGACGACGTAGTAAGCGAATG-3’(SEQ ID NO.17)；

[0113] L180H：

[0114] L180H-Fm：5’-GACCTTCACTTCTCTTCACACTGATACCAATGGC-3’(SEQ ID NO.18)；

[0115] L180H-Rm：5’-GCCATTGGTATCAGTGTGAAGGCAAGTGAAGGTC-3’(SEQ ID NO.19)；

[0116] F316C\G340C：

[0117] F316C-Fm：5’-CACCGGAATTCCCTGCCACCGTACCGTTCAC-3’(SEQ ID NO.20)；

[0118] F316C-Rm：5’-GTGAACGGTACGGTGGCAGGGAATTCCGGTG-3’(SEQ ID NO.21)；

[0119] G340C-Fm：5’-GTTATCTTCACCCCTGCGTCGAATCTTGGATC-3’(SEQ ID NO.22)；

[0120] G340C-Rm：5’-GATCCAAGATTCGACGCAGGGGTGAAGATAAC-3’(SEQ ID NO.23)；

[0121] S178C\Q238C：

[0122] S178C-Fm：5’-GACCTTCACTTGCCTTCTCACTGATACCAATG-3’(SEQ ID NO.24)；

[0123] S178C-Rm：5’-CATTGGTATCAGTGAGAAGGCAAGTGAAGGTC-3’(SEQ ID NO.25)；

[0124] Q238C-Fm：5’-CCTTTCCTCATACAACTGCGTTGTCAAAGACTACTTCCCCG-3’(SEQ ID NO.26)；

[0125] Q238C-Rm：5’-CGGGGAAGTAGTCTTTGACAACGCAGTTGTATGAGGAAAGG-3’(SEQ ID NO.27)；

[0126] F316C\G340C\S178C\Q238C、S235A\S343Y\Q332F\D310V、S151N\K171R\G275A\L180H、S235A\S343Y\Q332F\D310V\S151N\K171R\G275A\L180H以及S235A\S343Y\Q332F\D310V\S151N\K171R\G275A\L180H\F316C\G340C\S178C\Q238C：同上；

[0127] D159R；

[0128] D159R-Fm：5’-GGTACCAAGTGGCGATGTAAGCAATGTCTC-3’(SEQ ID NO.28)；

[0129] D159R-Rm：5’-GAGACATTGCTTACATCGCCACTTGGTACC-3’(SEQ ID NO.29)；

[0130] T319V：

[0131] T319V-Fm：5’-CCCTTCCACCGTGTCGTTCACAAGCGTG-3’(SEQ ID NO.30)；

[0132] T319V-Rm：5’-CACGCTTGTGAACGACACGGTGGAAGGG-3’(SEQ ID NO.31)；

[0133] PCR体系为：10μM正向引物和反向引物各1μL，dNTPMix 2μL，5×PS Buffer 2.5μL，PrimeStar GXLpolymerase0.5μL，模板0.5μL，加双蒸水补齐25μL；

[0134] PCR条件为：95℃2min；95℃20s，55～63℃1min，68℃11min，共18个循环；68℃5min。

[0135] PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，将检测后正确的PCR产物用Dpn I进行消化，后转化至大肠杆菌JM109中，得到含有编码突变体的基因的大肠杆菌工程菌；将大肠杆菌工程菌涂布于LB平板(含100mg/L卡那霉素)上，于37℃培养10h后，筛选阳性克隆并测序确认，得到验证正确的重组质粒(含有编码突变体S151N、S235A、K171R的基因的重组质粒的全质粒PCR扩增电泳图见图1)；将重组质粒用Sal I线性化后，电转化入毕赤酵母GS115中，得到含有编码突变体的基因的毕赤酵母工程菌；将毕赤酵母工程菌涂布于MD平板(含100mg/L卡那霉素)上，于37℃培养10h后，提取基因组、PCR鉴定确定阳性克隆，得到阳性转化子；将阳性转化子接种于含25mLBMGY培养基的250mL摇瓶中，30℃、250r/min培养至OD600为4.0，得到菌液；将菌液于8000r/min离心5min后收集菌体，用100mL的BMMY培养基重悬菌体至OD600为1.0，得到重悬液；将重悬液于30℃、250r/min继续培养，每24h补加0.5％(体积比)甲醇诱导表达，96h后收集菌液，将菌液于8000r/min离心5min，得到分别含有不同突变体的上清液(含有编码突变体S151N、S235A、K171R的基因的毕赤酵母工程菌的发酵上清液的蛋白纯化SDS-PAGE电泳图见图2)；将上清液利用镍柱进行亲和层析，在250mmol/L咪唑浓度时洗脱目的蛋白，得到纯化后的突变体S151N、S235A、K171R、S343Y、G275A、Q332F、D310V、L180H、F316C\G340C、S178C\Q238C、F316C\G340C\S178C\Q238C、S235A\S343Y\Q332F\D310V、S151N\K171R\G275A\L180H、S235A\S343Y\Q332F\D310V\S151N\K171R\G275A\L180H、S235A\S343Y\Q332F\D310V\S151N\K171R\G275A\L180H\F316C\G340C\S178C\Q238C、D159R或T319V，分别命名为L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16以及L17。

[0136] 实施例3：不同脂肪酶的酶学性质研究

[0137] 具体步骤如下：

[0138] 1、最适温度(Topt)

[0139] 分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃的条件下测定实施例1获得的野生型和实施例2获得的L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16以及L17的脂肪酶酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，以考察酶的最适作用温度(检测结果见图3-4)。

[0140] 由图3-4可知，野生型的最适温度均为40℃；L1、L2、L3、L4、L5、L6、L8、L9、L10、L16和L17的最适温度也均为40℃，与野生型相比没有提升；而L7的最适温度提升至45℃；L13的最适温度提升至43℃；L11和L12的最适温度提升至45℃；L14的最适温度提升至48℃；L15的最适温度提升最多，为50℃，较野生型提升了10℃。

[0141] 2、变性温度(Tm)

[0142] 将实施例1获得的野生型和实施例2获得的L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16以及L17先分别于40℃～70℃的恒温水浴中处理30min，然后分别冰浴20min，最后于40℃下测定脂肪酶酶活，当酶活为初始酶活的50％时，该热处理温度即为酶的变性温度(检测结果见表1)。

[0143] 由表2可知，与野生型相比，L1～L15的变性温度均有不同程度的提升，其中，提高程度较大的为L11～L15，变性温度分别为49.2℃、50.3℃、53.8℃、60.8℃和68.8℃，分别比野生型提高了4.2℃、5.3℃、8.8℃、15.8℃和23.8℃；而L16的变性温度为40.1℃，L17的变性温度为38.5℃，分别较野生型降低了4.9℃和6.5℃。

[0144] 表1不同脂肪酶的变性温度(Tm)

[0145]

[0146]

[0147] 3、半衰期(t1/2)

[0148] 将实施例1获得的野生型和实施例2获得的L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16以及L17分别置于65℃恒温水浴中，每隔一段时间取样一次，测其残留酶活，比较其热稳定性(检测结果见表2)。

[0149] 由表3可知，与野生型相比，L1～L15在65℃下半衰期均有不同程度的延长，其中，延长程度较大的为L11～L15，半衰期分别为3.9min、4.9min、7.6min、19.8min和56.2min，分别比野生型延长了4.59倍、5.76倍、8.94倍、23.29倍和66.11倍；而L16的半衰期为0.75min，L17的半衰期为0.5min，分别较野生型降低了11.76％和41.18％。

[0150] 表2不同脂肪酶在65℃下处理后的半衰期

[0151]

[0152]

[0153] 4、最适pH

[0154] 分别配置浓度为0.05mol/L的柠檬酸缓冲液(pH 6)、浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6～8)、浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8～9)以及浓度为0.05mol/L的碳酸盐缓冲(pH 9～10)代替脂肪酶活力测定方法中的缓冲液，在40℃下测定实施例1获得的野生型和实施例2获得的L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16以及L17的脂肪酶酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，以考察酶的最适作用pH(检测结果见图5-6)。

[0155] 由图5-6可知，野生型的最适pH为8.0；L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L10、L12、L13、L14、L16和L17的最适pH也为8.0，与野生型相比没有变化；L9的最适pH均上升为8.5，较野生型提升了0.5；L11和L15的最适pH均上升为9.0，较野生型提升了1，更加偏好碱性条件。

[0156] 5、耐碱能力

[0157] 根据4中的结果，计算实施例1获得的野生型和实施例2获得的L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16以及L17在pH为10的条件下的酶活占最适pH条件下酶活的比例，计算结果见表3。

[0158] 由表3可知，L9、L11和L15在pH为10的条件下的酶活占最适pH条件下酶活的90.6％、80.5％和75.2％，分别较野生型分别提高了12.1倍、10.7倍和10.0倍；L16和L17在pH为10的条件下的酶活占最适pH条件下酶活的7.2％和6.9％，与野生型相比略有降低；其余突变体在pH为10的条件下的酶活占最适pH条件下酶活的比例与野生型相差不大或略有上升。

[0159] 表3不同脂肪酶在pH为10的条件下的酶活占最适pH条件下酶活的比例

[0160]

[0161]

[0162] 6、pH稳定性

[0163] 配置浓度为0.05mol/L、pH为10的碳酸盐缓冲代替脂肪酶活力测定方法中的缓冲液，将实施例1获得的野生型和实施例2获得的L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16以及L17分别在上述缓冲体系下于25℃保存30min后，在40℃下测定脂肪酶活力，以初始酶活为100％，保存后酶活与之相比计算残留酶活，以考察其pH稳定性(检测结果见表4)。

[0164] 由表4可知，L5在pH为10的条件下处理30min后的残余酶活为65.0％，较野生型提高了57.3％；L7在pH为10的条件下处理30min后的残余酶活为55.3％，较野生型提高了34.2％；L9在pH为10的条件下处理30min后的残余酶活为87.4％，较野生型提高了112％；
L11在pH为10的条件下处理30min后的残余酶活为98.8％，较野生型提高了139.8％；L12在pH为10的条件下处理30min后的残余酶活为55.8％，较野生型提高了35.4％；L13和L14在pH为10的条件下处理30min后的残余酶活为65.2％和65.8％，分别较野生型提高了58.3％和
59.7％；L15在pH为10的条件下处理30min后的酶活无损失，仍保持100％，较野生型提高了
142.7％；而L16和L17在pH为10的条件下处理30min后的残余酶活为39.4％和38.5％，比野生型略有降低；其余突变体在pH为10的条件下处理30min后的残余酶活与野生型相差不大或略有上升。

[0165] 表4不同脂肪酶在pH为10的条件下处理30min后的残余酶活

[0166] 编号 残余酶活野生型 41.2％
L1 40.6％
L2 48.3％
L3 44.4％
L4 47.2％
L5 65.0％
L6 37.8％
L7 55.3％
L8 42.1％
L9 87.4％
L10 40.5％
L11 90.8％
L12 55.8％
L13 65.2％
L14 65.8％
L15 100％
L16 39.4％
L17 38.5％

[0167] 实施例3：不同脂肪酶的洗涤性能评估

[0168] 具体步骤如下：

[0169] 1、油污布的制作

[0170] 将棉布裁剪成6×6cm大小的方形棉布块，在沸腾的三氯甲烷中煮沸脱脂4h，得到脱脂棉布；将橄榄油加入到甲苯中，得到浓度为200mg/mL的油污液；将油污液以每次0.1mL的量分两次滴加到脱脂棉布的两侧，得到滴加了油污液的脱脂棉布；将滴加了油污液的脱脂棉布先在通风橱里晾干，然后放置在60℃的烘箱中烘干1h，得到油污布。

[0171] 2、洗涤剂的制作

[0172] 配置浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH 9.0)，浓度为0.1mol/L的Tris缓冲液(pH 10.0、10.5、11.0)以及浓度为0.5％(m/m)的SDS溶液与实施例1获得的野生型和实施例2获得的L9、L11、L15、L16以及L17配制成洗涤液，洗衣液最终体积均为100mL，配方如下：

[0173] 洗涤剂1：缓冲液50mL，去离子水50mL；

[0174] 洗涤剂2～7：缓冲液50mL，实施例1获得的野生型和实施例2获得的L9、L11、L15、L16或L17100U，添加去离子水至总体积100mL；

[0175] 洗涤剂8：缓冲液50mL，SDS溶液25mL，添加去离子水至总体积100mL；

[0176] 洗涤剂9～14：缓冲液50mL，实施例1获得的野生型和实施例2获得的L9、L11、L15、L16或L17100U，SDS溶液25mL，添加去离子水至总体积100mL。

[0177] 3、油污布的洗涤

[0178] 经油污布分别放入洗衣液1～14中，在50℃、200rpm的条件下洗涤30min，洗涤完成后，将油污布取出，分别用100mL的纯净水在40℃、200rpm的条件下洗涤3次，每次2min，晾干后，将油污布放置60℃烘箱中继续烘干1h。

[0179] 4、洗涤性能的评估

[0180] 用精密天平称取洗前和洗后油污布的质量，去油率以洗前和洗后的油重量为衡量标准：

[0181] 去油率(％)＝[(洗前油重-洗后油重)/洗前油重]×100；

[0182] 每个条件下做15块重复油污布，不同脂肪酶对油污布的洗涤效果如表5。

[0183] 由表5可知，在pH为9.0和10.0、10.5和11.0的四个条件下加入野生型后，去油率与未添加相比没有提升，还略有降低，说明野生型并无洗涤性能；

[0184] 在pH为9.0和10.0、10.5和11.0的四个条件下加入L9后，去油率比仅用缓冲液洗涤时提升近一倍，当洗涤剂中含有SDS时，再加入L9，去油率可以由79.9％、78.6％、75.8％和76.1％分别上升至88.1％、90.5％、92.8％和85.5％，提升幅度为10.3％、15.3％、22.4％和
12.4％；在pH为9.0和10.0、10.5和11.0的四个条件下加入L11后，去油率比仅用缓冲液洗涤时提升一倍，当洗涤剂中含有SDS时，再加入L11，去油率可以由79.9％、78.6％、75.8％和
76.1％分别上升至87.5％、90.4％、93.5％和86.3％，提升幅度为9.9％、15.0％、23.4％和
13.4％；在pH为9.0和10.0、10.5和11.0的四个条件下加入L15后，去油率比仅用缓冲液洗涤时提升一倍，当洗涤剂中含有SDS时，再加入L15，去油率可以由79.9％、78.6％、75.8％和
76.1％分别上升至87.1％、89.1％、93.6％和86.5％，提升幅度为9.0％、13.4％、23.4％和
13.7％，说明L9、L11、L15具有非常良好的洗涤效果，应用前景广泛；

[0185] 在pH为9.0和10.0、10.5和11.0的四个条件下加入L16或L17后，去油率与未添加相比没有提升，说明L16和L17也并无洗涤性能。

[0186] 表5含有不同脂肪酶的洗涤剂在不同pH下的洗涤性能

[0187]

[0188]

[0189] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。