一种黄曲霉致病基因wprA的应用转让专利
申请号 : CN201910420619.0
文献号 : CN110172465B
文献日 : 2020-12-29
发明人 : 聂鑫怡 , 张轶 , 王银春 , 王佳琪 , 张双焘 , 徐杭容 , 汪世华
申请人 : 福建农林大学
摘要 :
本发明提供了一种黄曲霉致病基因wprA的应用，为用于制备、筛选抑制黄曲霉致病性的潜在药物。更加具体地，该方法包含，在黄曲霉的培养体系中添加待筛选的候选物，并检测黄曲霉体内的wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平，并与不添加候选物的对照组进行比较，如果测试组中wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制黄曲霉的致病性的潜在药物。
权利要求 :
1.黄曲霉致病基因在筛选抑制黄曲霉致病性潜在药物中的应用，所述基因为wprA基因：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述wprA基因编码的WprA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，筛选抑制黄曲霉致病性潜在药物的方法包括：
(a) 在测试组中，在黄曲霉培养体系中添加待筛选的候选物，检测黄曲霉体内的wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平，并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、所述菌株的培养体系中，检测wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平；
(b) 将步骤(a)测试组中wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平，与对照组中wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平进行比较，测试组中wprA基因的转录表达水平或WprA蛋白的表达水平在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制黄曲霉致病性的潜在药物。
说明书 :
一种黄曲霉致病基因wprA的应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物学领域，具体涉及一种黄曲霉致病基因wprA的在筛选抑制黄曲霉致病性潜在药物中的应用。
背景技术
[0002] 黄曲霉（Aspergillus flavus）是广泛分布于自然界的腐生真菌，可以寄生于粮食、食品及饲料中进行生长繁殖并产生剧毒的黄曲霉毒素，造成巨大的经济损失，严重危害人畜健康。我国花生和玉米被黄曲霉污染的情况比较普遍，畜禽饲料和水产饲料的黄曲霉污染则更为严重。因此研究黄曲霉产毒调控机制，寻找预防和控制黄曲霉毒素污染的方法和策略是当务之急，具有重大的意义。
[0003] 目前，防控黄曲霉及黄曲霉毒素污染的策略有培育抗黄曲霉的作物品种、用不产毒黄曲霉菌株进行种群替换以及运用一些分子生物学手段来控制黄曲霉产毒等。这些方法的目的是做到提前干预，防止或降低黄曲霉毒素污染，不仅能有效的减少农业和食品加工业的损失，也能够更好的保障粮食/食品安全和公共健康。
[0004] 具有WOPR box结构域的转录因子是一类功能强大的蛋白，参与细胞内多种生物学过程，并发挥重要的作用。粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中发现的一个WOPR蛋白Pac2能够通过调节ste11基因的表达来控制细胞进行有性生殖交配的起始，另一个WOPR蛋白Gti1在葡萄糖饥饿的条件下能促进酵母对葡糖酸的摄取。白念珠菌（Candida albicans）的WOPR蛋白Wor1控制着白念珠菌的白-灰形态转换。构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的WOPR蛋白OsaA参与调控菌株的无性生殖和有性生殖过程。黄曲霉WOPR家族成员WprA与黄曲霉的生长发育和产毒相关。
[0005] 本发明人从黄曲霉中分离出wprA基因，通过基因敲除和表型分析验证了wprA在黄曲霉生长发育和产毒过程中的作用。因此，本发明公开了一种黄曲霉致病基因wprA在防治黄曲霉及黄曲霉毒素污染方面的应用，即通过检测黄曲霉体内wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平来筛选抑制黄曲霉致病性的潜在药物的方法。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种黄曲霉致病基因wprA在筛选抑制黄曲霉致病性潜在药物方面的应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 通过生物信息学同源比对分析方法，在黄曲霉基因组中寻找与白念珠菌WOR1基因同源的wprA基因；
[0009] 构建黄曲霉wprA基因缺失株，验证wprA基因缺失是否影响黄曲霉致病性：
[0010] 检测黄曲霉致病性相关检测指标包括：
[0011] (1) 相对于野生型黄曲霉，黄曲霉毒素的产量；
[0012] (2) 相对于野生型黄曲霉，产毒相关基因的表达；
[0013] (3) 所述的产毒相关基因包括：aflR基因、aflS基因、aflA基因，aflB基因，aflC基因、aflD基因、aflE基因、aflF基因、aflG基因、aflH基因、aflI基因、aflJ基因、aflK基因、aflL基因、aflM基因、aflN基因、aflO基因、aflP基因或aflQ基因。
[0014] (4) 相对于野生型黄曲霉，侵染宿主的能力；
[0015] (5) 所述的宿主包括：粮食及其制品、豆类及其制品、坚果及其制品、植物油及其制品、调味香辛料及其制品和饲料；
[0016] (6) 所述的侵染宿主的能力包括：在宿主上定殖生成菌丝、产生孢子、产生黄曲霉毒素AFB1或AFB2。
[0017] ⊿wprA菌株通过同源重组的方法（Nie et al., Journal of agricultural and food chemistry, 2016, Sep 7, 64(35):6772-6782.）从黄曲霉菌株的染色体中敲除wprA基因或基因片段获得，所述的wprA基因：
[0018] (1) 具有SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列；或
[0019] (2) 截短的SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列，且该基因不编码WprA蛋白或编码降低活性（优选活性降低50%，更优选降低80%，更优选无活性）的WprA蛋白或蛋白片段。wprA基因编码的WprA蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
[0020] 本发明的第二目的，是提供一种抑制黄曲霉致病性潜在药物的筛选方法，所述方法包括：
[0021] (a) 在测试组中，在黄曲霉培养体系中添加待筛选的候选物，检测黄曲霉体内的wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平，并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、所述菌株的培养体系中，检测黄曲霉体内的wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平；
[0022] 在一具体的实施方式中，所述检测黄曲霉体内的wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平包括：
[0023] (1) 检测黄曲霉体内wprA基因的mRNA转录水平；或
[0024] (2) 检测黄曲霉体内WprA蛋白的表达水平；
[0025] (b) 将步骤(a)测试组黄曲霉体内的wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平与对照组中黄曲霉体内的wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平进行比较，
[0026] 如果测试组中黄曲霉体内的wprA基因的转录水平或WprA蛋白的表达水平在统计学上低于（优选显著低于，较佳的低20%或更低；更佳的低40%或更低；进一步更佳的低60%或更低）对照组，就表明该候选物是抑制黄曲霉致病性的潜在药物。
[0027] 本发明的优点在于：只需要在mRNA或蛋白水平上检测鉴定药物对黄曲霉毒性的抑制效果，而不需要提取黄曲霉毒素，因此缩短了黄曲霉的培养时间和实验周期，减少了提取黄曲霉毒素过程中各种有毒有机挥发性化学试剂的使用，减少对环境的污染，同时也大大减少可能对实验操作人员产生的毒害。
附图说明
[0028] 图1. 在黄曲霉中敲除wprA基因的策略及其染色体上的酶切图谱（A）、Southern杂交图谱（B）。图中WT表示PTs⊿ku70⊿pyrG菌株，⊿wprA表示wprA基因敲除株，PvuI代表限制性内切酶PvuI的酶切位点，Probe表示用于Southern杂交分析的探针。
[0029] 图2. 黄曲霉⊿wprA菌株和对照菌株在YESSB培养基中产生黄曲霉毒素AFB1的薄层层析分析。图中WT表示对照菌株，⊿wprA表示wprA基因敲除株，AFB1表示黄曲霉毒素B1。
[0030] 图3. 黄曲霉⊿wprA菌株和对照菌株侵染花生、玉米种子5天后的形态（3A）以及花生、玉米子叶中黄曲霉毒素含量的薄层层析分析（3B）。图中WT表示对照菌株，⊿wprA表示wprA基因敲除株，Mock为空白对照，标准品为黄曲霉毒素B1标准品，AFB1表示黄曲霉毒素B1。
[0031] 图4. 在广谱抗真菌药物两性霉素B作用条件下，黄曲霉wprA基因的转录水平qPCR分析。图中图示（-AmB）代表黄曲霉培养体系内未加入两性霉素B，图示（+AmB）代表在黄曲霉培养体系内加入终浓度为1.0 μg/ml的两性霉素B，培养时间为24小时。qPCR分析所使用的内参基因为beta-tubulin（β-tub）。
[0032] 图5. 在广谱抗真菌药物两性霉素B作用条件下，黄曲霉EYFP-WprA蛋白的表达水平分析。（A）表达EYFP-WprA菌株的构建策略示意图；（B）EYFP-WprA表达水平的荧光观察；（C）EYFP-WprA表达水平的Western免疫杂交分析。图中图示（-AmB）代表黄曲霉培养体系内未加入两性霉素B，图示（+AmB）代表在黄曲霉培养体系内加入终浓度为0.5 μg/ml的两性霉素B，培养时间为24小时。Western免疫杂交分析使用的内参蛋白为alpha-Actin（α-Actin）。
具体实施方式
[0033] 如本文所用，黄曲霉wprA基因（SEQ ID NO:1）用斜体wprA表示，黄曲霉的缺失株用⊿wprA表示，黄曲霉的野生型对照菌株用WT表示。黄曲霉WprA蛋白（SEQ ID NO:2）用正体WprA表示。
[0034] 如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0035] 如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0036] wprA基因基本上不表达的菌株可以通过各种基因抑制、基因沉默、基因敲除等技术来构建。例如，可以通过基于同源重组的基因敲除技术来将wprA基因从染色体上敲除，从而使得wprA基因缺失；可以针对wprA基因设计干扰性RNA或反义核苷酸来使wprA基因表达抑制或沉默。
[0037] 作为本发明的一具体实施方式，一种使得wprA基因缺失的方法是基因敲除技术，所述的wprA基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，也包括截短形式的wprA基因（或称为wprA基因片段），WprA蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，也包括截短形式的WprA蛋白。只要wprA基因片段在被敲除后可导致WprA蛋白不表达或表达异常，或其表达的WprA蛋白片段活性降低或没有活性。
[0038] 在本发明的一具体实施方式中，本发明通过搜索FungiDB数据库（http://fungidb.org/fungidb/），利用生物信息学比较分析，在黄曲霉的基因组序列中找到编号为AFLA_055650（ GeneID: 7920648）的基因，该基因编码的产物与白念珠菌的Wor1蛋白具有较高的同源性，为黄曲霉wprA基因。本发明体外构建wprA基因敲除片段，通过同源重组的方法，把黄曲霉染色体上包含wprA基因的1.4 kb DNA片段用烟曲霉pyrG基因片段替换，从而敲除染色体上的wprA基因。
[0039] wprA基因缺失严重影响黄曲霉产毒，薄层层析没有检测明显的黄曲霉毒素AFB1。在黄曲霉侵染花生和玉米种子的实验中，⊿wprA菌株侵染花生和子叶后提取毒素，TLC薄层层析发现⊿wprA菌株能产生极少量的黄曲霉毒素。这些结果表明wprA正向调控黄曲霉产毒，影响该菌的致病性表现。
[0040] 所述的wprA基因可以作为一种黄曲霉致病性鉴定的标志物。例如可通过检测待测黄曲霉中wprA基因的转录表达情况来确定黄曲霉的致病性；若相对于野生型黄曲霉，待测黄曲霉wprA基因正常表达或超表达（即相对于野生型黄曲霉，待测黄曲霉中wprA基因的表达高20%或更高，更佳的高50%或更高），则该黄曲霉具有一般致病性或高致病性；若相对于野生型黄曲霉，待测黄曲霉wprA基因低表达或不表达，则该黄曲霉具有低致病性或无致病性。
[0041] wprA基因还可以作为黄曲霉减毒的靶标。本发明提供了一种筛选抑制黄曲霉致病性的潜在药物的方法，即可以在黄曲霉培养体系中添加候选药物，通过检测黄曲霉体内的wprA的转录水平或WprA蛋白的表达水平，筛选抑制黄曲霉致病性的潜在药物。
[0042] 所述用于分析检测黄曲霉体内的wprA基因的转录水平的方法可以是Northern blot杂交分析，qPCR荧光定量分析等。
[0043] 所述用于分析检测黄曲霉体内的WprA蛋白表达水平的方法可以是Western blot免疫印迹杂交分析、荧光强度分析法、酶联免疫吸附法（ELISA法）和点杂交法等。用于分析检测WprA蛋白表达水平的相应抗体可以是直接针对WprA蛋白或蛋白片段的抗体，也可以是将WprA蛋白的N端或C端与小分子多肽标签进行融合表达后针对小分子多肽标签的抗体。所述小分子多肽标签包括：His标签、HA标签、Flag标签、Myc标签、GST标签、GFP标签、YFP标签、RFP标签、mCherry标签等。
[0044] 如果测试组中wprA的转录水平或WprA蛋白的表达水平在统计学上低于（优选显著低于，较佳的低20%或更低；更佳的低40%或更低；进一步更佳的低60%或更低）对照组，就表明该候选物是抑制黄曲霉致病性的潜在药物。
[0045] 在一具体的实施方式中，所述的方法还包括：对获得的潜在药物进行进一步的黄曲霉产毒抑制或种子侵染抑制试验，以进一步选择和确定对于抑制黄曲霉致病性有用的物质。
[0046] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0047] I.材料和方法
[0048] 1. 总RNA提取与反转录
[0049] 黄曲霉菌丝加入液氮冷冻后迅速研磨成粉末，按每100mg菌丝粉末加入1 mL的Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific），参照说明书提取黄曲霉总RNA，用无核酸酶水溶解并通过琼脂糖凝胶电泳检测抽提的RNA质量。
[0050] RNA的反转录参照Thermo Scientific RevertAcid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书。
[0051] 2. 总蛋白提取与Western杂交
[0052] 黄曲霉菌丝加入液氮冷冻后迅速研磨成粉末，按每100mg菌丝粉末加入500 μl的RIPA裂解液（Beyotime），加入PMSF至终浓度1mM，混匀后冰上裂解30min，4℃高速离心10 min，收集上清并测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，用湿法将蛋白条带转移到尼龙膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液RT封闭1小时，一抗4℃杂交过夜，用TBST 室温洗膜3次，每次5分钟，用相应的二抗于室温结合1小时，再用TBST洗膜3次，每次5分钟，用ECL试剂显色。
[0053] 3. 黄曲霉毒素提取及分析
[0054] 在YES液体培养基中接种黄曲霉孢子至浓度106个/ml，28℃持续黑暗静置培养5天，吸取500 µl液体培养基加入等体积氯仿，振荡混匀，高速离心5 min，吸取有机相液体，干燥后用200 µl氯仿重新溶解并取10 µl点样，进行薄层层析（TLC）分析。
[0055] 4. 种子侵染实验
[0056] 花生去皮，小心去掉胚芽，玉米去掉胚芽，将完好的花生或玉米子叶置于0.05%次氯酸钠中浸泡3 min，转至无菌水中漂洗30 s，70%乙醇浸泡5 s，再用无菌水中漂洗1 min，5
沥干水后用20 ml孢子溶液（终浓度10个/ml）浸泡子叶，空白对照用无菌水浸泡，50 rpm，
30 min，每个培养皿放置重量相近的20片花生子叶或10片玉米子叶，培养皿中铺三层润湿的滤纸，29℃培养3-5天；将侵染后的子叶放入装有10 mL 0.01%吐温20的孢子洗脱液中，涡旋振荡1 min，取1 ml用于孢子计数，其余液加入5 ml丙酮150 rpm，10 min，室温静置5 min，加入5 ml氯仿，150 rpm，10 min，室温静置10 min，涡旋混匀，2000 rpm离心15 min，收集下层有机相液体，干燥后用5 ml 0.1 M NaCl甲醇:水(55:45)和2.5 mL己烷涡旋混匀1 min，2000 rpm离心15 min，收集己烷层，去掉油脂层（中间），剩余的水相按上述方法再抽提一次，合并收集样，干燥，用500 μl氯仿重溶，取10 μL点薄层层析板。
沥干水后用20 ml孢子溶液（终浓度10个/ml）浸泡子叶，空白对照用无菌水浸泡，50 rpm，
30 min，每个培养皿放置重量相近的20片花生子叶或10片玉米子叶，培养皿中铺三层润湿的滤纸，29℃培养3-5天；将侵染后的子叶放入装有10 mL 0.01%吐温20的孢子洗脱液中，涡旋振荡1 min，取1 ml用于孢子计数，其余液加入5 ml丙酮150 rpm，10 min，室温静置5 min，加入5 ml氯仿，150 rpm，10 min，室温静置10 min，涡旋混匀，2000 rpm离心15 min，收集下层有机相液体，干燥后用5 ml 0.1 M NaCl甲醇:水(55:45)和2.5 mL己烷涡旋混匀1 min，2000 rpm离心15 min，收集己烷层，去掉油脂层（中间），剩余的水相按上述方法再抽提一次，合并收集样，干燥，用500 μl氯仿重溶，取10 μL点薄层层析板。
[0057] II. 实施例
[0058] 实施例1、黄曲霉中wprA基因的敲除
[0059] 为了研究黄曲霉wprA基因在黄曲霉形态发生和毒性表现中的功能，首先在黄曲霉中敲除wprA基因。
[0060] 图1A显示了基因敲除的策略。体外构建wprA基因敲除片段，通过同源重组的方法，把染色体wprA基因中的5.4 kb DNA片段用pyrG替换，从而敲除染色体上的wprA基因。
[0061] 具体方法如下：
[0062] 利用5’引物AACCTTTGCCCCATCCTG（SEQ ID NO.3）；和3’引物GGGTGAAGAGCATTGTTTGAGGCCAACAAAGTAGTCACTCCC（SEQ ID NO.4）；从黄曲霉基因组DNA中用PCR的方法扩增约0.9 kb上游片段；
[0063] 利用5’引物GCCTCAAACAATGCTCTTCACCC（SEQ ID NO.5）；和3’引物GTCTGAGAGGAGGCACTGATGC（SEQ ID NO.6）；从烟曲霉基因组DNA中用PCR的方法扩增约1.9 kb的pyrG基因片段；
[0064] 利用5’引物GCATCAGTGCCTCCTCTCAGACATGCTACGGATGATTACCC（SEQ ID NO.7）；和3’引物CCTAACAGAAAAGACAGACC（SEQ ID NO.8）；从黄曲霉基因组DNA中用PCR的方法扩增约0.9 kb的下游片段；
[0065] 将上述三个片段用融合PCR法连接到一起构建wprA敲除片段，导入黄曲霉PTs⊿ku70⊿pyrG菌株（Chang et al., Journal of microbiological methods, 2010, Jun, 81(3):240-246.），在不含尿嘧啶和尿苷的培养基上筛选阳性转化子。通过敲除片段上、下游的两个同源片段与染色体上wprA基因的上、下游同源片段的同源重组，把染色体上的wprA基因给替换掉，从而敲除染色体上的wprA基因。正确插入的转化子的基因型用Southern杂交技术检测确定。这些菌株的基因组DNA用PvuI酶切，与探针杂交。杂交结果表明，野生型菌株显示一条0.7 kb 杂交条带，⊿wprA缺失株显示3.1 kb的杂交条带。图1B显示了野生型菌株和⊿wprA缺失株基因型Southern杂交分析的图谱。
[0066] 实施例2、wprA基因的敲除对黄曲霉菌产毒的影响
[0067] 为了检测wprA基因的缺失是否会影响黄曲霉产毒，本发明在YESSB液体培养基（2%酵母提取物，15%蔗糖，1%大豆蛋白胨，pH 5.5）内接种孢子至终浓度105个/ml，29℃的持续黑暗条件下静置培养5天，提取毒素，通过薄层层析分析各菌株的产毒情况。结果表明WT菌株产生了大量的黄曲霉毒素AFB1，而⊿wprA缺失株则没有检测到AFB1的产生，数据统计分析也说明了这一点（图2）。
[0068] 以上结果说明，wprA基因的缺失会影响黄曲霉产毒。
[0069] 实施例3、wprA基因的敲除对黄曲霉致病力的影响
[0070] 产孢、产毒能力与黄曲霉的致病性密切相关，不能产孢或产毒的菌株其致病性会丧失或大幅下降。
[0071] 本发明构建的⊿wprA缺失株产孢和产毒的能力都有缺陷，于是本发明通过花生和玉米种子侵染试验来检测⊿wprA菌株的致病性。以野生型菌株WT为阳性对照，以无菌水为空白对照，检测⊿wprA菌株的致病性。
[0072] 将去胚后完好的花生或玉米子叶用次氯酸钠和酒精消毒，用20 ml孢子溶液（终浓度105个/ml）浸泡29 ℃后黑暗培养5天（图3A）；将侵染后的花生或玉米子叶提取黄曲霉毒素进行薄层层析检测，WT菌株能够正常产毒，而⊿wprA的产毒量极少（图3B）。这些结果说明⊿wprA菌株的致病性明显低于野生型WT菌株。
[0073] 因此，WprA调控黄曲霉的致病性表现，是一个重要的致病相关因子。
[0074] 实施例4、根据wprA转录水平筛选抑制黄曲霉致病性的潜在药物
[0075] 为了验证黄曲霉体内wprA转录水平与黄曲霉致病性的联系，本发明设计建立了荧光定量PCR法分析系统。
[0076] 具体方法如下：
[0077] 在黄曲霉菌株的培养体系中加入或不加入广谱康真菌药物两性霉素B培养24小时，提取总RNA并反转录成cDNA，检测wprA基因mRNA的转录水平。
[0078] 利用5’引物TTGAGCCCTACAACGCCACT（SEQ ID NO.9）；和3’引物TGGTTCAGGTCACCGTAAGAGG（SEQ ID NO.10）；从上述cDNA中用PCR的方法扩增约142 bp片段来代表内参基因beta-tubulin（β-tub）的转录水平。
[0079] 利用5’引物ATTGATGATCTAGAGACTGG（SEQ ID NO.11）；和3’引物ATGGGTTGCCGCATAAGGG（SEQ ID NO.12）；从上述cDNA中用PCR的方法扩增约159 bp片段来代表wprA基因转录水平。
[0080] 利用REST分析软件来统计分析wprA基因在加入和不加入两性霉素B条件下转录水平的差异（图4）。在加入两性霉素B的培养条件下，黄曲霉野生型菌株中wprA基因的转录水平显著低于未加入两性霉素B时该基因的转录水平（P<0.01）。这一结果说明，wprA基因的转录水平与黄曲霉的致病性密切相关，两性霉素B是抑制黄曲霉致病性或防治黄曲霉污染的潜在药物。
[0081] 实施例5、根据WprA蛋白的表达水平筛选抑制黄曲霉致病性的潜在药物
[0082] 为了验证黄曲霉体内WprA蛋白的表达水平与黄曲霉致病性的联系，本发明设计构建了WprA蛋白N端与小分子多肽标签EYFP融合的菌株（图5A），用荧光显微镜进行荧光观察，分析EYFP-WprA的表达水平（图5B）；此外，还可以用anti-GFP的抗体Western杂交，检测EYFP-WprA融合蛋白的表达水平（图5C）。
[0083] 具体方法如下：
[0084] 图5A显示了EYFP-WprA融合蛋白表达菌株的构建策略。体外构建包含up-pyrG-gpdA(p)-eyfp-wprA的同源重组片段，插入染色体上wprA基因座的位置。
[0085] 具体方法如下：
[0086] 利用5’引物AACCTTTGCCCCATCCTG（SEQ ID NO: 3）；和3’引物GGGTGAAGAGCATTGTTTGAGGCCAACAAAGTAGTCACTCCC（SEQ ID NO: 4）；从黄曲霉基因组DNA中用PCR的方法扩增约0.9 kb的上游片段；
[0087] 利用5’引物GCCTCAAACAATGCTCTTCACCC（SEQ ID NO: 5）；和3’引物GTCTGAGAGGAGGCACTGATGC（SEQ ID NO: 6）；从烟曲霉基因组DNA中用PCR的方法扩增约1.9 kb的pyrG基因片段；
[0088] 利用5’引物GCATCAGTGCCTCCTCTCAGACCATCCGGATGTCGAAGGCTTG（SEQ ID NO: 13）；和3’引物CTCGCCCTTGCTCACCATGTGATGTCTGCTCAAGCGGGGTAG（SEQ ID NO: 14）；从构巢曲霉基因组DNA中用PCR的方法扩增约1.5 kb的gpdA启动子片段；
[0089] 利用5’引物ATGGTGAGCAAGGGCGAG（SEQ ID NO: 15）；和3’引物CTTGTACAGCTCGTCCAT（SEQ ID NO:16）；从质粒pEYFP-C1上用PCR的方法扩增约0.7 kb的eyfp基因片段；
[0090] 利用5’引物ATGGACGAGCTGTACAAGATGGTCAACGGCACCACCAC（SEQ ID NO: 17）；和3’引物CAGTCACACTCATCGTCTTC（SEQ ID NO: 18）；从黄曲霉基因组DNA中用PCR的方法扩增约0.6 kb的wprA基因片段；
[0091] 将上述五个片段用融合PCR法连接到一起构建eyfp-wprA同源重组片段，导入黄曲霉PTs⊿ku70⊿pyrG菌株，在不含尿嘧啶和尿苷的培养基上筛选阳性转化子。通过敲除片段上、下游同源片段与染色体上wprA基因的上、下游同源片段的同源重组，在染色体上的wprA基因座位置插入融合片段，从而使黄曲霉表达EYFP-WprA融合蛋白。
[0092] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。