双抗原表位融合基因重组慢病毒载体、抗原提呈细胞和CTL细胞及其构建方法和应用

摘要

本发明提供了双抗原表位融合基因重组载体、抗原提呈细胞和CTL细胞及其构建方法和应用，属于肿瘤药物技术领域。双抗原表位融合基因重组慢病毒载体，包括由MAGE‑A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因。将所述重组病毒载体包装成重组慢病毒后，以所述重组慢病毒为介导载体将双抗原编码基因导入DC细胞的基因组中，得到同时提呈MAGE‑A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞。利用DC‑CTL技术用所述抗原提呈细胞诱导T细胞，得到靶向MAGE‑A3和KRAS突变的特异性CTL细胞。基于所述CTL细胞具有较强的双抗原杀伤作用，用于制备治疗癌症或肿瘤的药物。

权利要求

1.双抗原表位融合基因重组慢病毒载体，其特征在于，包括由MAGE-A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因；其中MAGE-A3基因和KRAS突变基因之间没有连接顺序；

所述KRAS突变基因中对应的氨基酸突变后蛋白质包括KRAS-G12D、KRAS-G12C、KRAS-G12V、KRAS-G12A、KRAS-G12S、KRAS-G13D和KRAS-Q61H中的一种。

2.根据权利要求1所述重组慢病毒载体，其特征在于，所述KRAS-G12D的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述KRAS-G12C的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述KRAS-G12V的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述KRAS-G12A的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述KRAS-G12S的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；

所述KRAS-G13D的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述KRAS-Q61H的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

3.根据权利要求1或2所述重组慢病毒载体，其特征在于，所述MAGE-A3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.一种同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A.将权利要求1～3任意一项所述重组慢病毒载体、慢病毒包装质粒、培养基和转染试剂混合，静置，得到转染液；

B.向含T细胞的培养基中逐滴加入所述转染液，培养6～7h，更换含体积浓度10％FBS的DEME培养基继续培养，收集上清液；

C.将所述上清液浓缩，用得到的病毒浓缩液感染DC细胞，得到同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述病毒浓缩液感染DC细胞的感染复数为5:1。

6.权利要求4或5所述构建方法构建得到的抗原提呈细胞，其特征在于，在所述抗原提呈细胞的基因组中包含由MAGE-A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因。

7.靶向MAGE-A3和KRAS突变的特异性CTL细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分离筛选得到表面表达CD8或CD3的T细胞；

(2)用权利要求6所述抗原提呈细胞或权利要求4或5所述构建方法构建得到的抗原提呈细胞和步骤(1)中得到的T细胞混合，得到的培养体系进行共培养；

(3)共培养2d后，每天向所述共培养液中添加IL-2，继续共培养，当培养液变黄时进行半量换液，共培养持续到21～22d时，收获的细胞即为特异性CTL。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述抗原提呈细胞和T细胞的比例为

1:100～500；所述T细胞的浓度为1×106/mL；所述抗原提呈细胞的浓度为1×106/mL。

9.权利要求7所述的构建方法得到的靶向MAGE-A3和KRAS突变的特异性CTL细胞。

10.权利要求9所述的特异性CTL细胞在制备治疗癌症或肿瘤药物中的应用。

说明书

双抗原表位融合基因重组慢病毒载体、抗原提呈细胞和CTL细

胞及其构建方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于肿瘤药物技术领域，具体涉及双抗原表位融合基因重组载体、抗原提呈细胞和CTL细胞及其构建方法和应用。

背景技术

[0002] MAGE-A3作为一种内源性肿瘤抗原，在细胞内生成后被降解成小分子多肽，并与MHC(主组织相容性复合体)分子结合形成复合物，被呈递到细胞表面。MAGE-A3蛋白在多种肿瘤类型中均有表达，包括黑色素瘤，以及其他固体肿瘤如胃癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌等。对于上述疾病的治疗，可以采用化疗和放射性治疗等方法，但都会对自身的正常细胞造成损害。

[0003] KRAS基因是ras基因家族中一种，与人类肿瘤相关的基因。KRAS参与细胞内信号传递，当KRAS基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞中信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。有效识别突变后KRAS基因表达的抗原，对癌症的治疗具有重要意义。

[0004] 肿瘤的治疗手段包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗。一般传统的肿瘤治疗手段都是采用手术治疗。这种治疗方法，对肿瘤没有扩散的情况下采取的积极治疗手段，但是对于患者的伤害过大。放疗和化疗是针对已经扩散的肿瘤进行的治疗手段，但是对患者的身体和心理都会造成较大的伤害。目前靶向药物治疗越来越受到关注，它通过与癌症发生、肿瘤生长所必需的特定分子靶点的作用来阻止癌细胞的生长。靶向药物的特点决定了其尤其适合身体虚弱的晚期患者使用。

[0005] 免疫治疗是激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。目前治疗用的瘤苗主要有肿瘤细胞瘤苗、基因工程疫苗、抗独特型抗体瘤苗、抗原提呈细胞为基础的瘤苗。DC-CTL技术，免疫治疗的一种方法，是利用DC和抗肿瘤效应细胞(T淋巴细胞)两种细胞联合协同治疗肿瘤。通过DC的抗原递呈，激活T淋巴细胞，生成机体抗肿瘤最重要的并赋予抗肿瘤特异性的效应细胞—细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CTL识别递呈发生在肿瘤细胞表面并与Main histologic complex(MHC)-I类分子结合的抗原肽片段，通过分泌型杀伤(胞吐颗粒释放效应分子如穿孔素、颗粒酶、淋巴毒素、TNF相关蛋白等引起靶细胞裂解或凋亡)或非分泌型杀伤(表达FasL和TRAIL与靶细胞表面的相应受体分子结合，启动信号转导途径而诱导凋亡)途径杀伤肿瘤细胞。虽然CTL具有特异性和相对较高效的杀瘤效应，但存在MHC限制性，据报道25％～75％的肿瘤细胞有不同形式的人白细胞抗原(HLA)表型改变，导致免疫识别障碍，为肿瘤免疫逃逸的主要原因之一；同时CTL的特异性杀伤效应虽然相对较高，但有限的靶向性只能杀死小部分肿瘤细胞，这些缺陷都严重限制了以CTL为基础的肿瘤免疫治疗的疗效。因此，增强针对肿瘤细胞的靶向杀伤效应、提高对肿瘤细胞的多靶点作用是目前免疫治疗研究的难题。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种增强对肿瘤细胞的靶向杀伤效应、提高对肿瘤细胞的多靶点作用的重组慢病毒载体、抗原提呈细胞和CTL细胞及其构建方法和应用。

[0007] 本发明提供了双抗原表位融合基因重组慢病毒载体，包括由MAGE-A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因；其中MAGE-A3基因和KRAS突变基因之间没有连接顺序；所述KRAS突变基因中对应的氨基酸突变后蛋白质包括KRAS-G12D、KRAS-G12C、KRAS-G12V、KRAS-G12A、KRAS-G12S、KRAS-G13D和KRAS-Q61H中的一种。

[0008] 优选的，所述KRAS-G12D的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

[0009] 所述KRAS-G12C的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

[0010] 所述KRAS-G12V的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

[0011] 所述KRAS-G12A的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；

[0012] 所述KRAS-G12S的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；

[0013] 所述KRAS-G13D的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；

[0014] 所述KRAS-Q61H的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

[0015] 优选的，所述MAGE-A3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0016] 本发明提供了一种同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞的构建方法，包括以下步骤：

[0017] A.将所述重组慢病毒载体、慢病毒包装质粒、培养基和转染试剂混合，静置，得到转染液；

[0018] B.向含T细胞的培养基中逐滴加入所述转染液，培养6～7h，更换含体积浓度10％FBS的DEME培养基继续培养，收集上清液；

[0019] C.将所述上清液浓缩，用得到的病毒浓缩液感染DC细胞，得到同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞。

[0020] 优选的，所述病毒浓缩液感染DC细胞的感染复数为5:1。

[0021] 本发明提供的所述构建方法构建得到的抗原提呈细胞，在所述抗原提呈细胞的基因组中包含由MAGE-A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因。

[0022] 本发明提供了靶向MAGE-A3和KRAS突变的特异性CTL细胞的构建方法，包括以下步骤：

[0023] (1)分离筛选得到表面表达CD8或CD3的T细胞；

[0024] (2)用所述抗原提呈细胞或所述构建方法构建得到的抗原提呈细胞和步骤(1)中得到的T细胞混合，得到的培养体系进行共培养；

[0025] (3)共培养2d后，每天向所述共培养液中添加IL-2，继续共培养，当培养液变黄时进行半量换液，共培养持续到21～22d时，收获的细胞即为特异性CTL。

[0026] 优选的，所述抗原提呈细胞和T细胞的比例为1:100～500；所述T细胞的浓度为1×106/mL；所述抗原提呈细胞的浓度为1×106/mL。

[0027] 本发明提供了所述的靶向MAGE-A3和KRAS突变的特异性CTL细胞。

[0028] 本发明还提供了所述的特异性CTL细胞在制备治疗癌症或肿瘤药物中的应用。

[0029] 本发明提供的双抗原表位融合基因重组慢病毒载体，包括由MAGE-A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因。本发明以慢病毒质粒为基础表达载体，将所述融合基因插入到慢病毒质粒中，得到同时表达MAGE-A3和KRAS突变蛋白质的重组载体，为后续构建具有双抗原特异性CTL做准备。

[0030] 本发明提供了一种同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞及其构建方法，本发明以慢病毒为介导载体，将MAGE-A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因导入到抗原提呈细胞的基因组中，获得稳定遗传表达体系，构建得到的抗原提呈细胞可以同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原，增加识别抗原的种类，应用范围更广。

[0031] 本发明提供了所述的靶向MAGE-A3和KRAS突变的特异性CTL细胞及其构建方法，制备的CTL细胞对MAGE-A3和KRAS突变抗原具有特异性，能够靶向杀伤具有MAGE-A3抗原和/或KRAS突变抗原的肿瘤细胞的作用。实验证明：与单独靶向MAGE-A3的CTL相比，同时靶向MAGE-A3和KRAS突变的CTL，对MAGE-A3和KRAS突变双阳的肿瘤细胞的杀伤能力更高。基于所述特异性CTL细胞的杀伤作用，将所述CTL细胞为肿瘤或癌症的免疫治疗提供了新方法。

附图说明

[0032] 图1为PCR检测不同MAGE-A3-KRAS突变的融合基因；

[0033] 图2为流式检测靶向MAGE-A3-G12D的CTL的细胞表型；

[0034] 图3为流式检测靶向MAGE-A3-G12C的CTL的细胞表型；

[0035] 图4为流式检测靶向MAGE-A3-G12V的CTL的细胞表型；

[0036] 图5为流式检测靶向MAGE-A3-G12A的CTL的细胞表型；

[0037] 图6为流式检测靶向MAGE-A3-G12S的CTL的细胞表型；

[0038] 图7为流式检测靶向MAGE-A3-G13D的CTL的细胞表型；

[0039] 图8为流式检测靶向MAGE-A3-G13D的CTL的细胞表型；

[0040] 图9为CTL对293T-KRAS突变靶细胞(MAGE-A3阴性+KRAS突变)的杀伤作用；

[0041] 图10为CTL对H358-KRAS突变(MAGE-A3阳性+KRAS-突变)靶细胞的杀伤作用；

[0042] 图11为CTL对H358(MAGE-A3阳性)靶细胞的杀伤作用。

具体实施方式

[0043] 本发明提供了双抗原表位融合基因重组慢病毒载体，包括由MAGE-A3基因和KRAS突变基因形成的融合基因；其中MAGE-A3基因和KRAS突变基因之间没有连接顺序；所述KRAS突变基因中对应的氨基酸突变后蛋白质包括KRAS-G12D、KRAS-G12C、KRAS-G12V、KRAS-G12A、KRAS-G12S、KRAS-G13D和KRAS-Q61H中的一种。

[0044] 在本发明中，所述KRAS-G12D的氨基酸序列优选如SEQ ID No.2所示；所述KRAS-G12C的氨基酸序列优选如SEQ ID No.3所示；所述KRAS-G12V的氨基酸序列优选如SEQ ID No.4所示；所述KRAS-G12A的氨基酸序列优选如SEQ ID No.5所示；所述KRAS-G12S的氨基酸序列优选如SEQ ID No.6所示；所述KRAS-G13D的氨基酸序列优选如SEQ ID No.7所示；所述KRAS-Q61H的氨基酸序列优选如SEQ ID No.8所示。所述MAGE-A3的核苷酸序列优选如SEQ ID No.1所示。

[0045] 在本发明中，所述融合基因对应的融合蛋白的组合方案包括MAGE-A3-KRAS-G12D(SEQ ID No.9)、MAGE-A3-KRAS-G12C(SEQ ID No.10)、MAGE-A3-KRAS-G12V(SEQ ID No.11)、MAGE-A3-KRAS-G12A(SEQ ID No.12)、MAGE-A3-KRAS-G12S(SEQ ID No.13)、MAGE-A3-KRAS-G13D(SEQ ID No.14)、MAGE-A3-KRAS-G61H(SEQ ID No.15)。KRAS-G12D-MAGE-A3、KRAS-G13D-MAGE-A3、KRAS-G12V-MAGE-A3、KRAS-G12C-MAGE-A3、KRAS-G12S-MAGE-A3、KRAS-G12A-MAGE-A3和KRAS-Q61H-MAGE-A3的氨基酸序列采用SEQ ID No.2～SEQ ID No.8与SEQ ID No.1组合形成。所述融合基因的核苷酸序列是编码SEQ ID No.9～SEQ ID No.15所示氨基酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括不同物种对同义密码子的使用偏好性中出现的不同频率的兼并密码子。为了举例说明，采用所述融合基因构建重组载体具体方法，采用融合蛋白中其中一种编码序列加以具体说明，但是这并不能理解成是对本发明的保护范围的限制，例如编码SEQ ID No.9～SEQ ID No.15所示氨基酸的核苷酸序列如SEQ IDNo.16～SEQ ID No.22所示。

[0046] 在本发明中，所述重组慢病毒载体的构建方法，优选包括以下步骤：

[0047] ①人工合成融合基因；

[0048] ②将所述步骤①中合成的融合基因的两端分别添加上酶切位点；

[0049] ③将步骤②中得到的连接有酶切位点的融合基因克隆至慢病毒载体中，得到重组慢病毒载体。

[0050] 在本发明中，为了验证所述重组慢病毒载体正确导入了融合基因，将所述重组慢病毒载体转化感受态细胞，挑取单克隆，进行测序，选择测序结果正确的克隆，进行后续实验。在本发明中，所述慢病毒载体包括pCDH。所述融合基因插入慢病毒载体中的多克隆位点为BamH I/NheI。

[0051] 本发明提供了一种同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞的构建方法，包括以下步骤：

[0052] A.将所述重组慢病毒载体、慢病毒包装质粒、培养基和转染试剂混合，静置，得到转染液；

[0053] B.向T细胞中添加所述培养基后，逐滴加入所述转染液，培养6～7h，更换含体积浓度10％FBS的DEME培养基继续培养，收集上清液；

[0054] C.将所述上清液浓缩，用得到的病毒浓缩液感染DC细胞，得到同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞。

[0055] 本发明将所述重组慢病毒载体、慢病毒包装质粒、培养基和转染试剂混合，静置，得到转染液。

[0056] 在本发明中，预先将重组慢病毒载体、慢病毒包装质粒、培养基混合形成慢病毒体系，同时将所述培养基和转染试剂混合形成转染试剂体系。所述重组慢病毒载体、慢病毒包装质粒、培养基的体积比为1:1:125。所述培养基和转染试剂的体积比为125:18。所述慢病毒体系和转染试剂的混合比为127:143。所述培养基优选为1640(无FBS)培养基。所述转染试剂优选为lipofectamine 2000。所述静置优选在室温条件下静置25min。

[0057] 在本发明中，所述T细胞优选为293T细胞。所述培养的温度优选为37℃，所述培养优选在5％CO2培养箱中进行。所述转染液的添加体积优选为每10ml的培养基中添加1ml转染液。更换培养基继续培养48h后优选收集上清液。所述收集上清液的方法优选为离心。所述离心的离心力优选为4000g，所述离心的时间优选为5min，所述离心的温度优选为4℃。

[0058] 得到上清液后，本发明将所述上清液浓缩，用得到的病毒浓缩液感染DC细胞，得到同时提呈MAGE-A3和KRAS突变双抗原的抗原提呈细胞。

[0059] 本发明对所述浓缩的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的浓缩方法即可。在本发明中，所述病毒浓缩液感染DC细胞的感染复数优选为5:1。本发明对所述DC细胞的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的DC细胞即可。

[0060] 本发明提供的所述构建方法构建得到的抗原提呈细胞，在所述抗原提呈细胞的基因组中包含由MAGE-A3和KRAS突变基因形成的融合基因。

[0061] 在本发明中，为了验证构建的抗原提呈细胞导入了上述融合基因，使用特异性引物进行PCR鉴定。融合基因鉴定用引物：F：ATGCCTCTTGAGCAGAGGAG(SEQ ID No.23)；R12：GGATCCCTGG ATGGTTAAAGCGCTCTTTCC CACT(SEQ ID No.24)；R13：CAGCTGGATGGTTAAAGCGC TCTT(SEQ ID No.25)；R61：GTACTGGTCC CTCATTGCACTGTAC(SEQ ID No.26)；以F和R12为引物，鉴定MAGE-A3+KRAS-G12N突变，即针对的是MAGE-A3+KRAS-G12的突变，突变成D、C、V、S、A的方案；以F和R13为引物，鉴定MAGE-A3+KRAS-G13D突变的方案；以F和R61为引物，鉴定MAGE-A3+KRAS-Q61H突变的方案。

[0062] 本发明提供了靶向MAGE-A3和KRAS突变的特异性CTL细胞的构建方法，包括以下步骤：

[0063] (1)分离筛选得到表面表达CD8或CD3的T细胞；

[0064] (2)用所述抗原提呈细胞或所述构建方法构建得到的抗原提呈细胞和步骤(1)中得到的T细胞混合，得到的培养体系进行共培养；

[0065] (3)共培养2d后，每天向所述共培养液中添加IL-2，继续共培养，当待培养基变黄时进行半量换液，共培养持续到21～22d时，收获细胞即为特异性CTL。

[0066] 本发明分离筛选得到表面表达CD8或CD3的T细胞。所述分离筛选的方法优选采用免疫磁珠法分离。

[0067] 得到T细胞后，本发明用所述抗原提呈细胞或所述构建方法构建得到的抗原提呈细胞和步骤(1)中得到的T细胞混合，得到的培养体系进行共培养。

[0068] 在本发明中，所述T细胞的浓度优选为1×106/mL；所述T细胞的浓度优选以X-VIVO培养基调整。所述抗原提呈细胞和T细胞的比例优选为1:100～500，更优选为1:200。所述抗原提呈细胞的浓度优选为1×106/mL。

[0069] 在本发明中，所述共培养的条件优选如下：5％CO2，37℃。

[0070] 所述共培养持续2d后，每天向所述共培养液中添加IL-2，继续共培养，当待培养基变黄时进行半量换液，共培养持续到21～22d时，收获细胞即为特异性CTL。

[0071] 在本发明中，所述IL-2的终浓度为50～1000IU/mL，更优选为50～60IU/mL。所述继续共培养优选持续3d。所述半量换液时新的培养液为含有50IU/mL IL-2的X-VIVO培养基。根据细胞生长情况补充培养基的量，使细胞密度维持在0.5～1×106/mL。

[0072] 在本发明中，为了验证培养得到的细胞为CTL细胞，对收集的CTL细胞进行流式分型鉴定。

[0073] 本发明提供了所述的靶向MAGE-A3和KRAS突变的特异性CTL细胞。

[0074] 本发明还提供了所述的特异性CTL细胞在制备治疗癌症或肿瘤药物中的应用。

[0075] 在本发明中，所述药物优选为注射液。所述注射液中特异性CTL细胞的浓度优选为1～3×107/mL。所述注射液的注射剂量优选为50～200。所述癌症或肿瘤优选包括KRAS突变阳性的所有肿瘤。

[0076] 下面结合实施例对本发明提供的双抗原表位融合基因重组载体、抗原提呈细胞和CTL细胞及其构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0077] 实施例1

[0078] 构建MAGE-A3和KRAS突变的融合基因表达载体

[0079] 1)人工合成融合蛋白的编码序列，并克隆到慢病毒质粒表达载体上；

[0080] 所述融合蛋白的方案包括MAGE-A3+KRAS-G12D、、MAGE-A3-KRAS-G12C、MAGE-A3-KRAS-G12V、MAGE-A3-KRAS-G12A、MAGE-A3-KRAS-G12S、MAGE-A3-KRAS-G13D、MAGE-A3-KRAS-G61H；

[0081] 2)上述得到的重组载体转化至感受态细胞，挑取单克隆，进行测序，测序结果比对正确后，用质粒提取试剂盒提取质粒，操作方法按照厂家说明书进行后续实验。

[0082] 实施例2

[0083] 慢病毒包装：

[0084] 1)转染前一天，预先将4×106的293T(加拿大)细胞接种10cm平皿上(10mL DMEM+10％FBS)；

[0085] 2)取15mL离心管标记为A，加入以下试剂并混匀：

[0086] 慢病毒质粒           12μg

[0087] 慢病毒包装质粒       6μg+6μg

[0088] 1640培养基           500μL

[0089] 3)取15mL离心管标记为B，分别加入500μL  1640(无FBS)培养基及72μL lipofectamine 2000，混匀，室温静置5min；

[0090] 4)将A管液体转入B管内，混匀，室温静置25min，

[0091] 5)293T细胞，从培养箱中取出，弃培养液，再加入10mL 1640(无FBS)培养液；

[0092] 6)将1mL混合物逐滴均匀加入到293T细胞培养液中，轻微混匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养6h；

[0093] 7)换正常培养液DEME+10％FBS培养

[0094] 8)48h后，收病毒液，将培养液转移至50mL离心管中4000g，离心5min，4℃收集上清病毒液，过0.45μm滤膜，然后4℃保存。

[0095] 慢病毒浓缩

[0096] 1)根据慢病毒上清液和浓缩液(购自合生基因)的体积比按5：1的比例混合，混匀后，4℃过夜。

[0097] 2)在4℃条件，4000g离心30min浓缩慢病毒；

[0098] 3)弃上清，用移液器吸走全部液体

[0099] 4)每管用150μL PBS重悬，混匀后，分装，留10μL进行滴度测定。

[0100] 实施例3

[0101] 1、分离DC和T细胞：

[0102] 1)单采血，分离外周血单个核细胞PBMC；

[0103] 2)将PBMC用含10％FBS的1640培养基调整至浓度为1×106细胞/mL置于培养皿中，在37℃条件下5％CO2培养箱中培养，静止过夜；收集悬浮细胞，标记为T细胞，备用；

[0104] 3)以含10％FBS的1640培养基对贴在培养皿底部的细胞进行吹打，收集贴壁的单核细胞，即得到DC细胞备用。

[0105] 2、慢病毒感染DC

[0106] 将实施例2制备的慢病毒感染分离得到的DC，慢病毒的MOI为5:1；12孔板，总体积1mL，每孔添加1μL Polybrene，得到具有同时提呈MAGE-A3+KRAS-G12D双抗原的抗原提呈细胞(i-DC)。

[0107] 3、双抗原抗原提呈细胞鉴定：

[0108] 提取慢病毒感染后DC的RNA，进行反转录，再以融合基因的特异性引物进行PCR鉴定，融合基因鉴定引物：融合基因鉴定用引物：F：ATGCCTCTTG AGCAGAGGAG(SEQ ID No.23)；R12：GGATCCCTGGATGGTTAAAG  CGCTCTTTCC  CACT(SEQ  ID No.24)；R13：
CAGCTGGATGGTTAAAGCGC TCTT(SEQ ID No.25)；R61：GTACTGGTCC CTCATTGCACTGTAC(SEQ ID No.26)；以F和R12为引物，鉴定MAGE-A3+KRAS-G12N突变，即针对的是MAGE-A3+KRAS-G12的突变，突变成D、C、V、S、A的方案；以F和R13为引物，鉴定MAGE-A3+KRAS-G13D突变的方案；以F和R61为引物，鉴定MAGE-A3+KRAS-Q61H突变。

[0109]

[0110] 扩增程序：(1)95℃5min；(2)95℃1min，62℃1min，72℃2min，25个循环；(3)72℃5min。

[0111] 结果如图1所示，其中1:Marker；2:阳性对照；3：阴性对照；4：MAGE-A3-G12D；5：MAGE-A3-G12C；6：MAGE-A3-G12V；7：MAGE-A3-G12A；8：MAGE-A3-G12S；9：MAGE-A3-G13D；10：
MAGE-A3-Q61H。由图1扩增电泳条带可知，可以鉴定出目的条带，说明MAGE-A3和KRAS突变的融合基因可表达。

[0112] 实施例4

[0113] 1、分离T细胞：

[0114] 1)300g离心实施例3中步骤2)得到的T+B细胞液10min，完全去除上清，收集沉淀细胞，以PBS重选，细胞过30μm细胞筛，过筛后计数；

[0115] 2)以分离缓冲液(PBS,pH 7.2,0.5％BSA+2mM EDTA)重悬细胞，每107cells以80μL分离缓冲液重悬；

[0116] 3)每107cells，加入20μL CD8/CD3标记的磁球；

[0117] 4)混匀后，在2～8℃条件下孵育15min；

[0118] 5)每107cells，加入1～2mL分离buffer重悬细胞，300g条件下离心10min，然后完全去除上清；

[0119] 6)将108cells以内的细胞用500μL分离缓冲液重悬，得到细胞悬液；

[0120] 7)用分离缓冲液润洗分离柱；MS：500μL，LS：3mL；

[0121] 8)将细胞悬液转移至分离柱；

[0122] 9)收集未结合的细胞，并以分离缓冲冲洗3次，液体完全流出时，再加入分离缓冲液；MS：3×500μL；

[0123] 10)从分离器上卸下柱子，放到适合的分离管上；

[0124] 11)加入适量的分离缓冲液，立即将细胞推出，收集T细胞备用。

[0125] 实施例5

[0126] DC诱导靶向MAGE-A3和KRAS突变的CTL细胞

[0127] 1)将CD3+T细胞或CD8+T细胞以X-VIVO培养基调整至1×106/mL，取2mL接种于6孔板中，将实施例3制备的i-DC按1：200比例加入孔中，进行共培养，此时标记为Day 0；

[0128] 2)共培养48h，从Day3开始按培养基体积，每天加入IL-2至培养液中IL-2的终浓度为50IU/mL；

[0129] 4)Day 5后，培养基变黄时用含50IU/mL IL-2的X-VIVO培养基进行半量换液；根据细胞生长情况补充培养基，细胞密度维持在0.5～1×106/mL；

[0130] 5)Day 21收获细胞，即为特异性CTL细胞。

[0131] 实施例6

[0132] CTL细胞的流式分型鉴定

[0133] 1)收集上述制备得到的特异性CTL细胞，1000rpm条件下离心5min；

[0134] 2)1×106cells/管，加入CD3、CD4、CD8和CD56的抗体，室温避光30min；

[0135] 3)用PBS洗两次，然后在1000rpm条件下离心5min；用PBS重悬，上机检测。

[0136] 检测结果见图2～8。由图2～8可知，不同的抗原组合诱导的CTL中，NK占比不高于10％，T细胞比例超过75％，其中CD8+T细胞占比超过70％。

[0137] 实施例7

[0138] 基于LDH法特异性CTL细胞的杀伤实验

[0139] 1)收集实施例5制备的靶细胞，在1000rpm条件下离心5min，去除上清液；

[0140] 2)用PBS洗一遍，在1000rpm条件下离心5min，去除上清液；

[0141] 3)用含2％FBS的1640培养基重悬后，计数调整至8×104cells/mL，分至96孔板中(U型底)，50μL/孔，备用；

[0142] 4)收集效应细胞，在1000rpm条件下离心5min；

[0143] 5)用PBS洗一遍，在1000rpm条件下离心5min；

[0144] 6)用含2％FBS的1640培养基重悬细胞，计数后，分至96孔板中(U型底)，50μL/孔，设置效靶比为10：1、5：1、2.5：1和1.25：1；

[0145] 7)在37℃，5％CO2共孵育3.5h后，进行LDH检测。

[0146] 对比例1

[0147] 靶向MAGE-A3的CTL细胞的制备方法

[0148] (1)人工合成MAGE-A3的编码序列；

[0149] (2)将所述MAGE-A3的编码序列插入慢病毒质粒中，形成重组慢病毒质粒；

[0150] (3)将所述重组慢病毒质粒转化入大肠杆菌中，培养，菌落测序，序列比对正确后，将阳性菌液中提取重组慢病毒质粒；

[0151] (4)将提取得到重组慢病毒质粒按照实施例2～3的方法构建慢病毒和DC细胞；

[0152] (5)将构建得到DC细胞经PCR扩增验证，得到目标长度的条带，说明构建的DC细胞能表达MAGE-A3蛋白；

[0153] (6)将所述DC细胞按照实施例5的方法诱导T细胞，得到单一抗原诱导的CTL。

[0154] 基于LDH法检测得到的CTL细胞的杀伤作用，方法同实施例7。

[0155] 靶向双抗原特异性CTL的杀伤作用结果

[0156] 以对比例1中制备的单一抗原诱导的CTL作为对照，与表达双抗原的DC诱导的CTL同时进行杀伤实验，靶细胞分别选取293T-KARS突变(293T(MAGE-A3-)、H358细胞(MAGE-A3+)和H358-KRAS突变(MAGE-A3+KRAS-G12D)作为靶细胞，比较两种CTL的杀伤效率。

[0157] 结果表明：单一抗原MAGE-A3的DC诱导的CTL，仅对H358和H358KRAS突变细胞，具有杀伤效果，而对于293T-KRAS突变细胞，无杀伤效果(图9)，这是因为单一抗原诱导的CTL，仅可识别MAGE-A3抗原的靶细胞，而293T-KRAS突变细胞中只有KRAS突变抗原，没有MAGE-A3抗原，所以，没有杀伤作用(见图3)。而表达双抗原的DC诱导的CTL，对三种靶细胞具有较高的杀伤效果(图9～图11)，且对表达双抗原的靶细胞H358-KRAS突变的杀伤效果明显高于单一抗原诱导的CTL(图10)。

[0158] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。