一种液态深层发酵生产灵芝三萜的方法

摘要

本发明公开了一种液态深层发酵生产灵芝三萜的方法，包括：(1)取在斜面培养基中活化后的灵芝菌丝体，挑取菌丝块接入种子培养基中，接种后于25‑30℃、100‑180r/min下培养8‑12天，获得种子培养液；(2)将培养好的种子培养液，按照8vol％‑12vol％的接种量接入发酵培养基中，接种后于25‑30℃、100‑180r/min下培养7‑10天，在发酵培养过程中添加0.8g/L‑1.5g/L的胆酸钠，发酵结束获得灵芝菌丝体，并提取菌丝体中的灵芝三萜。本发明的方法工艺简单、有效，在工业化生产中具有应用价值，可成功实现明显提高表达产物含量的目的，缩短了发酵周期，提高了生产效率，且对其它的真菌菌丝体发酵过程优化具有一定的指导和启迪意义。

权利要求

1.一种液态深层发酵生产灵芝三萜的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)取在斜面培养基中活化后的灵芝菌丝体，挑取菌丝块接入种子培养基中，接种后于

25‑30℃、100‑180r/min下培养8‑12天，获得种子培养液；

(2)将培养好的种子培养液，按照8vol％‑12vol％的接种量接入发酵培养基中，接种后于25‑30℃、100‑180r/min下培养7‑10天，在发酵培养过程中添加0.8g/L‑1.5g/L的胆酸钠，发酵结束获得灵芝菌丝体，并提取菌丝体中的灵芝三萜；

所述步骤(1)中的种子培养基的组分为：无水葡萄糖30g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁

1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH；

所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为：无水葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，七水硫酸镁

2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，自然pH；

所述步骤(2)中发酵培养第0h、第24h、第40h或第48h添加0.8g/L‑1.5g/L胆酸钠。

2.根据权利要求1所述的一种液态深层发酵生产灵芝三萜的方法，其特征在于：所述步骤(2)中在发酵培养过程中添加1.5g/L的胆酸钠。

3.根据权利要求1所述的一种液态深层发酵生产灵芝三萜的方法，其特征在于：所述步骤(2)中灵芝三萜的提取方法为：用90％‑95％的乙醇水溶液提取灵芝菌丝体获得灵芝三萜。

说明书

一种液态深层发酵生产灵芝三萜的方法

技术领域

[0001] 本发明属于灵芝发酵领域，特别涉及一种液态深层发酵生产灵芝三萜的方法。

背景技术

[0002] 灵芝(Ganoderma lucidum)是担子菌纲、多孔菌科、灵芝菌属真菌，是我国最著名的高等药用真菌。灵芝的关键药效成分是灵芝多糖和灵芝三萜。其中灵芝三萜具有消炎止痛、镇静、解毒、保肝、抗艾滋病病毒、抗肿瘤、保肝作用，抑制组胺释放、血管紧张素转化酶等功能，是灵芝发挥药效的重要物质基础。

[0003] 三萜类化合物是灵芝中主要的次级代谢产物，近年来，国内外学者对于灵芝的研究非常广泛。获取灵芝三萜的方式主要是从子实体、孢子粉和液态发酵三种方式，由于子实体栽培周期长，产品不稳定，孢子粉中三萜含量较少等原因存在一定弊端，通过液态发酵方式获取三萜成为一种新型手段。但是，仅通过优化液体发酵培养基和发酵工艺条件(如温度、pH值、转速和通气量)很难进一步提高灵芝三萜的产量，因此很多学者也开展了通过添加外源添加物质(如金属离子、中药提取物、脂肪酸、前体物质等)促进灵芝三萜合成的研究。

[0004] 目前研究表明，茉莉酸甲酯、苯巴比妥、阿司匹林、铜离子和钙离子都能够诱导灵芝三萜合成。这些工作为研究灵芝三萜生物合成的调控机制提供了很好的材料和表型。但是灵芝三萜发酵产品作为食品和药品，必须考虑其发酵的安全性和经济性。茉莉酸甲酯本身价格昂贵，苯巴比妥是一种普遍性中枢神经抑制药，阿司匹林是一种解热镇痛药，铜离子是一种重金属。

[0005] 因此，需要开发一种新的生产灵芝三萜的方法。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种液态深层发酵生产灵芝三萜的方法，该方法包括如下步骤：

[0007] (1)取在斜面培养基中活化后的灵芝菌丝体，挑取菌丝块接入种子培养基中，接种后于25‑30℃、100‑180r/min下培养8‑12天，获得种子培养液；

[0008] (2)将培养好的种子培养液，按照8‑12vol％的接种量接入发酵培养基中，接种后于25‑30℃、100‑180r/min下培养7‑10天，在培养过程中添加0.8‑1.5g/L的胆酸钠，发酵结束获得灵芝菌丝体，并提取菌丝体中的灵芝三萜；

[0009] 所述步骤(1)中的斜面培养基为：39g马铃薯葡萄糖琼脂溶于1L去离子水中灭菌后即得。

[0010] 所述步骤(1)中的种子培养基的组分为：无水葡萄糖30g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH。

[0011] 所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为：无水葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，七水硫酸镁2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，自然pH。

[0012] 所述步骤(2)中发酵培养第0h、第24h、第40h或第48h添加0.8g/L‑1.5g/L胆酸钠。

[0013] 所述步骤(2)中灵芝三萜的提取方法为：用90％‑95％的乙醇水溶液提取灵芝菌丝体获得灵芝三萜。

[0014] 有益效果

[0015] 本发明的液态深层发酵生产灵芝三萜的方法，添加的胆酸钠是食品安全级别的且价格低廉。本发明工艺简单、有效，可应用于灵芝三萜的工业化生产中，在工业化生产中具有应用价值，可成功实现明显提高表达产物产量的目的，缩短了发酵周期，提高了生产效率，且对其它的真菌菌丝体发酵过程优化具有一定的指导和启迪意义。

具体实施方式

[0016] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0017] 灵芝菌株：沪农灵芝1号Ganoderma lucidum，已在[Biotechnology and Bioprocess Engineering 2014年第19卷第4期727‑732]公开。

[0018] 实施例1(对照组)

[0019] (1)取在斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(美国BD公司生产)粉末39g溶于1L去离子水中灭菌后即得)中活化后的斜面灵芝菌丝体，挑取黄豆粒大小的菌丝块接入100mL种子培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下进行发酵培养10天；

[0020] (2)将培养好的种子培养液，按照10vol％的接种量接入发酵培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，七水硫酸镁2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，自然pH)中，接种后于26℃，
150r/min下培养8天获得灵芝菌丝体。

[0021] 其中灵芝三萜的提取方法和测定方法为：

[0022] 将发酵得到的灵芝菌丝体研磨成粉末后，1g菌丝体加入50ml 95％的乙醇水溶液中常温浸提14小时后过滤，上清液即为待测样品溶液。

[0023] 加待测样品溶液0.1ml于试管中(设三个重复)，再加5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.5ml，充分混匀后，在60℃水浴中保温20分钟，取出后立即冷却至室温，然后再加入冰醋酸5ml摇匀后在550nm处测定样品的吸光度，样品的三萜含量根据标准曲线上计算可得。

[0024] 测定灵芝三萜含量为(0.214±0.068)g/L。

[0025] 实施例2

[0026] (1)取在斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(美国BD公司生产)粉末39g溶于1L去离子水中灭菌后即得)中活化后的斜面灵芝菌丝体，挑取黄豆粒大小的菌丝块接入100mL种子培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下进行发酵培养10天；

[0027] (2)将培养好的种子培养液，按照10vol％的接种量接入发酵培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，七水硫酸镁2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，自然pH)中，接种后于26℃，
150r/min下培养8天获得灵芝菌丝体。

[0028] 步骤(2)中所述的发酵过程中采用发酵第0h添加1.5g/L胆酸钠的方法。

[0029] 灵芝三萜的提取方法和测定方法同实施例1，测定灵芝三萜含量为(0.681±0.014)g/L。

[0030] 实施例3

[0031] (1)取在斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(美国BD公司生产)粉末39g溶于1L去离子水中灭菌后即得)中活化后的斜面灵芝菌丝体，挑取黄豆粒大小的菌丝块接入100mL种子培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下进行发酵培养10天；

[0032] (2)将培养好的种子培养液，按照10vol％的接种量接入发酵培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，七水硫酸镁2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，自然pH)中，接种后于26℃，
150r/min下培养8天获得灵芝菌丝体。

[0033] 步骤(2)中所述的发酵过程中采用发酵第24h添加1.5g/L胆酸钠的方法。

[0034] 灵芝三萜的提取方法和测定方法同实施例1，测定灵芝三萜含量为(0.554±0.099)g/L。

[0035] 实施例4

[0036] (1)取在斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(美国BD公司生产)粉末39g溶于1L去离子水中灭菌后即得)中活化后的斜面灵芝菌丝体，挑取黄豆粒大小的菌丝块接入100mL种子培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下进行发酵培养10天；

[0037] (2)将培养好的种子培养液，按照10vol％的接种量接入发酵培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，七水硫酸镁2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，自然pH)中，接种后于26℃，
150r/min下培养8天获得灵芝菌丝体。

[0038] 步骤(2)中所述的发酵过程中采用发酵第40h添加1.5g/L胆酸钠的方法。

[0039] 灵芝三萜的提取方法和测定方法同实施例1，测定灵芝三萜含量为(0.715±0.027)g/L。

[0040] 实施例5

[0041] (1)取在斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(美国BD公司生产)粉末39g溶于1L去离子水中灭菌后即得)中活化后的斜面灵芝菌丝体，挑取黄豆粒大小的菌丝块接入100mL种子培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下进行发酵培养10天；

[0042] (2)将培养好的种子培养液，按照10vol％的接种量接入发酵培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，七水硫酸镁2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，自然pH)中，接种后于26℃，
150r/min下培养8天获得灵芝菌丝体。

[0043] 步骤(2)中所述的发酵过程中采用发酵第48h添加1.5g/L胆酸钠的方法。

[0044] 灵芝三萜的提取方法和测定方法同实施例1，测定灵芝三萜含量为(0.678±0.032)g/L。

[0045] 实施例6

[0046] (1)取在斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(美国BD公司生产)粉末39g溶于1L去离子水中灭菌后即得)中活化后的斜面灵芝菌丝体，挑取黄豆粒大小的菌丝块接入100mL种子培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下进行发酵培养10天；

[0047] (2)将培养好的种子培养液，按照10vol％的接种量接入发酵培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，七水硫酸镁2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，自然pH)中，接种后于26℃，
150r/min下培养8天获得灵芝菌丝体。

[0048] 步骤(2)中所述的发酵过程中采用发酵第40h添加1.2g/L胆酸钠的方法。

[0049] 灵芝三萜的提取方法和测定方法同实施例1，测定灵芝三萜含量为(0.405±0.041)g/L。

[0050] 实施例7

[0051] (1)取在斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(美国BD公司生产)粉末39g溶于1L去离子水中灭菌后即得)中活化后的斜面灵芝菌丝体，挑取黄豆粒大小的菌丝块接入100mL种子培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下进行发酵培养10天；

[0052] (2)将培养好的种子培养液，按照10vol％的接种量接入发酵培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，七水硫酸镁2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，自然pH)中，接种后于26℃，
150r/min下培养8天获得灵芝菌丝体。

[0053] 步骤(2)中所述的发酵过程中采用发酵第40h添加1.0g/L胆酸钠的方法。

[0054] 灵芝三萜的提取方法和测定方法同实施例1，测定灵芝三萜含量为(0.322±0.010)g/L。

[0055] 实施例8

[0056] (1)取在斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂(美国BD公司生产)粉末39g溶于1L去离子水中灭菌后即得)中活化后的斜面灵芝菌丝体，挑取黄豆粒大小的菌丝块接入100mL种子培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉1g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，自然pH)中，接种后于26℃，150r/min下进行发酵培养10天；

[0057] (2)将培养好的种子培养液，按照10vol％的接种量接入发酵培养基(无水葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，七水硫酸镁2.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，自然pH)中，接种后于26℃，
150r/min下培养8天获得灵芝菌丝体。

[0058] 步骤(2)中所述的发酵过程中采用发酵第40h添加0.8g/L胆酸钠的方法。

[0059] 灵芝三萜的提取方法和测定方法同实施例1，测定灵芝三萜含量为(0.298±0.033)g/L。