一种山兰原球茎的种苗快繁培养基及种苗快繁方法

摘要

本发明涉及组织培养技术领域，特别涉及一种山兰原球茎的种苗快繁培养基及种苗快繁方法。该种苗快繁培养基包括，伸长增殖培养基：含有蔗糖、琼脂粉、NAA、ZT的MS培养基；分化培养基：含有蔗糖、琼脂粉、IAA、6‑BA的MS培养基；生根培养基：含有蔗糖、琼脂粉、IAA、6‑BA的MS培养基。在本发明组培条件下，受激素调控，原球茎生长速度快，分枝状伸长增殖系数达到8.67，原球茎分化产生球茎系数达到5.14，即1个原球茎经过继代增殖和分化培养后可产生约45棵根茎叶完整的健壮种苗。

权利要求

1.一种山兰原球茎的种苗快繁培养基，其特征在于，由如下培养基组成：分枝状伸长增殖培养基：蔗糖28 32 g/L+ 琼脂粉4.0 5.0g/L+ NAA 0.5 1.5 mg/L+ ~ ~ ~ZT 0.5 1.5 mg/L+ MS培养基；

~

分化培养基：蔗糖28 32 g/L+ 琼脂粉4.0 5.0g/L+ IAA 2.0 3.0mg/L+ 6-BA 2.0~ ~ ~ ~

3.0mg/L+ MS培养基；

生根培养基：蔗糖28 32 g/L+ 琼脂粉4.0 5.0g/L+ IAA 2.0 3.0mg/L+ 6-BA 0.05~ ~ ~ ~

0.15mg/L+ MS培养基。

2.根据权利要求1所述的种苗快繁培养基，其特征在于，包括：分枝状伸长增殖培养基：蔗糖30 g/L+ 琼脂粉4.5g/L+ NAA 1.0mg/L+ ZT 1.0mg/L+ MS培养基；

分化培养基：蔗糖30 g/L+ 琼脂粉4.5g/L+ IAA 2.5mg/L+ 6-BA 2.5mg/L+ MS培养基；

生根培养基：蔗糖30 g/L+ 琼脂粉4.5g/L+ IAA 2.5mg/L+ 6-BA 0.1mg/L+ MS培养基。

3.一种山兰原球茎的种苗快繁方法，其特征在于，包括：采用分枝状伸长增殖培养基对原球茎外植体进行分枝状伸长增殖培养，得到分枝状伸长增殖后的原球茎；所述分枝状伸长增殖培养基为：蔗糖28 32 g/L+ 琼脂粉4.0 5.0g/L+ ~ ~NAA 0.5 1.5 mg/L+ ZT 0.5 1.5 mg/L+ MS培养基；

~ ~

采用分化培养基对分枝状伸长增殖后的原球茎进行分化培养，得到球茎；所述分化培养基为：蔗糖28 32 g/L+琼脂粉4.0 5.0g/L+ IAA 2.0 3.0mg/L+ 6-BA 2.0 3.0mg/L+ MS~ ~ ~ ~培养基；

采用生根培养基对球茎进行生根培养；所述生根培养基为：蔗糖28 32 g/L+ 琼脂粉~

4.0 5.0g/L+ IAA 2.0 3.0mg/L+ 6-BA 0.05 0.15mg/L+ MS培养基。

~ ~ ~

4.根据权利要求3所述的种苗快繁方法，其特征在于，所述分枝状伸长增殖培养基为：蔗糖30 g/L+ 琼脂粉4.5g/L+ NAA 1.0mg/L+ ZT 1.0mg/L+ MS培养基；

所述分化培养基为：蔗糖30 g/L+ 琼脂粉4.5g/L+ IAA 2.5mg/L+ 6-BA 2.5mg/L+ MS培养基；

所述生根培养基为：蔗糖30 g/L+ 琼脂粉4.5g/L+ IAA 2.5mg/L+ 6-BA 0.1mg/L+ MS培养基。

5.根据权利要求3所述的种苗快繁方法，其特征在于，所述外植体的大小为（2 4）×（2~ ~

4）×（4 6）mm。

~

6.根据权利要求3所述的种苗快繁方法，其特征在于，所述原球茎为1年生球茎产生的原球茎。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分枝状伸长增殖培养的条件为：培养温度为22 24℃，光暗周期为13 15h/9 11h，光照强度为1400 1600lx，培养时间50 60d。

~ ~ ~ ~ ~

8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述分枝状伸长增殖培养的条件为：培养温度为23℃，光暗周期为14h/10h，光照强度为1500lx，培养时间55d。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分化培养的条件为：培养温度为22 24~℃，光暗周期为13 15h/9 11h，光照强度为1400 1600lx，培养时间50 60d。

~ ~ ~ ~

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述生根培养的条件为：培养温度为22~

24℃，光暗周期为13 15h/9 11h，光照强度为1400 1600lx，培养时间50 60d。

~ ~ ~ ~

说明书

一种山兰原球茎的种苗快繁培养基及种苗快繁方法

技术领域

[0001] 本发明涉及组织培养技术领域，特别涉及一种山兰原球茎的种苗快繁培养基及种苗快繁方法。

背景技术

[0002] 山兰Oreorchis patens(Lindl.)Lindl.是兰科山兰属多年生阴生草本植物，广泛分布于我国西南、华中、西北及东北各地，朝鲜半岛至西伯利亚地区、日本等地也有少量分布。其干燥球茎入药，甘、辛，寒，有小毒。具有滋阴清肺、化痰止咳的功效，用于痈疳疮肿，瘰疬，无名肿毒，但长期以来山兰的药用价值并未受到重视，而是被当做山慈菇伪品对待或者作为习用品入药。随着近些年山兰需求量增加，价格暴涨，导致其野生资源遭到毁灭性破坏，被列为吉林省三级保护植物，关于其资源开发、药效成分、药理活性、野生驯化以及菌根真菌等的相关研究较多，但制约山兰大面积人工栽培的种苗繁育关键技术研究报道极少。

[0003] 组织培养技术是在人为创造的无菌条件下将生活的离体器官(如根、茎、叶、茎段、原生质体)、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养以获得细胞、组织或个体的技术。这种技术已广泛应用于农业和生物、医药的研究。

[0004] 在山兰组织培养技术中，有采用假鳞茎或叶片作为外植体进行原球茎的增殖培养的公开技术，如公开号为CN107736245A的中国专利公开了一种山兰无性快繁技术，该技术用山兰假鳞茎或叶片或花序梗作外植体大量生产山兰试管苗。以球茎出芽方式增殖，增殖系数低周期长，而以原球茎形式进行增殖增殖系数高，但与球茎出芽方式增殖多了一个原球茎分化为球茎的步骤。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种山兰原球茎的种苗快繁培养基及种苗快繁方法。该发明以1年生球茎产生的原球茎为外植体，分别研究4种生长素和分裂素对原球茎增殖分化的影响以及激素组合对原球茎分枝状伸长增殖分化、原球茎分化产生球茎和球茎生根的影响，形成一个完整的山兰原球茎途径种苗快繁技术体系。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明还提供了一种山兰原球茎的种苗快繁培养基，包括：

[0008] 伸长增殖培养基：含有蔗糖28～32g/L、琼脂粉4.0～5.0g/L、NAA 0.5～1.5mg/L、ZT 0.5～1.5mg/L的MS培养基；

[0009] 分化培养基：含有蔗糖28～32g/L、琼脂粉4.0～5.0g/L、IAA 2.0～3.0mg/L、6-BA 2.0～3.0mg/L的MS培养基；

[0010] 生根培养基：含有蔗糖28～32g/L、琼脂粉4.0～5.0g/L、IAA 2.0～3.0mg/L、6-BA 0.05～0.15mg/L的MS培养基。

[0011] 作为优选，该种苗快繁培养基包括：

[0012] 伸长增殖培养基：含有蔗糖30g/L、琼脂粉4.5g/L、NAA 1.0mg/L、ZT 1.0mg/L的MS培养基；

[0013] 分化培养基：含有蔗糖30g/L、琼脂粉4.5g/L、IAA 2.5mg/L、6-BA 2.5mg/L的MS培养基；

[0014] 生根培养基：含有蔗糖30g/L、琼脂粉4.5g/L、IAA 2.5mg/L、6-BA 0.1mg/L的MS培养基。

[0015] 本发明还提供了一种山兰原球茎的种苗快繁方法，包括：

[0016] 采用伸长增殖培养基对原球茎外植体进行伸长增殖培养，得到伸长增殖后的原球茎；伸长增殖培养基为含有蔗糖28～32g/L、琼脂粉4.0～5.0g/L、NAA 0.5～1.5mg/L、ZT 0.5～1.5mg/L的MS培养基；

[0017] 采用分化培养基对伸长增殖后的原球茎进行分化培养，得到球茎；分化培养基为含有蔗糖28～32g/L、琼脂粉4.0～5.0g/L、IAA 2.0～3.0mg/L、6-BA 2.0～3.0mg/L的MS培养基；

[0018] 采用生根培养基对球茎进行生根培养；生根培养基为含有蔗糖28～32g/L、琼脂粉4.0～5.0g/L、IAA 2.0～3.0mg/L、6-BA 0.05～0.15mg/L的MS培养基。

[0019] 作为优选，伸长增殖培养基为含有蔗糖30g/L、琼脂粉4.5g/L、NAA 1.0mg/L、ZT 1.0mg/L的MS培养基；

[0020] 分化培养基为含有蔗糖30g/L、琼脂粉4.5g/L、IAA 2.5mg/L、6-BA 2.5mg/L的MS培养基；

[0021] 生根培养基为含有蔗糖30g/L、琼脂粉4.5g/L、IAA 2.5mg/L、6-BA 0.1mg/L的MS培养基。

[0022] 作为优选，外植体的大小为(2～4)×(2～4)×(4～6)mm。

[0023] 优选地，外植体的大小为3×3×5mm。

[0024] 作为优选，原球茎为1年生球茎产生的原球茎。

[0025] 作为优选，伸长增殖培养的条件为：培养温度为22～24℃，光暗周期为13～15h/9～11h，光照强度为1400～1600lx，培养时间50～60d。

[0026] 优选地，伸长增殖培养的条件为：培养温度为23℃，光暗周期为14h/10h，光照强度为1500lx，培养时间55d。

[0027] 作为优选，分化培养的条件为：培养温度为22～24℃，光暗周期为13～15h/9～11h，光照强度为1400～1600lx，培养时间50～60d。

[0028] 优选地，分化培养的条件为：培养温度为23℃，光暗周期为14h/10h，光照强度为1500lx，培养时间55d。

[0029] 作为优选，生根培养的条件为：培养温度为22～24℃，光暗周期为13～15h/9～11h，光照强度为1400～1600lx，培养时间50～60d。

[0030] 优选地，生根培养的条件为：培养温度为23℃，光暗周期为14h/10h，光照强度为1500lx，培养时间55d。

[0031] 本发明提供了一种山兰原球茎的种苗快繁培养基及种苗快繁方法。该种苗快繁培养基包括，伸长增殖培养基：含有蔗糖28～32g/L、琼脂粉4.0～5.0g/L、NAA 0.5～1.5mg/L、ZT 0.5～1.5mg/L的MS培养基；分化培养基：含有蔗糖28～32g/L、琼脂粉4.0～5.0g/L、IAA 2.0～3.0mg/L、6-BA 2.0～3.0mg/L的MS培养基；生根培养基：含有蔗糖28～32g/L、琼脂粉
4.0～5.0g/L、IAA 2.0～3.0mg/L、6-BA 0.05～0.15mg/L的MS培养基。本发明具有的技术效果为：

[0032] 本申请试验以1年生球茎产生的原球茎为外植体，以MS为基本培养基，分别研究4种生长素和分裂素对原球茎增殖分化的影响以及激素组合对原球茎分枝状伸长增殖分化、原球茎分化产生球茎和球茎生根的影响。结果表明NAA和ZT利于原球茎分枝状伸长增殖，在NAA 1.0mg/L+ZT1.0mg/L时原球茎分枝状伸长增殖系数达到8.67；IAA和6-BA利于原球茎分化为球茎，在IAA 2.5mg/L+6-BA2.5mg/L时原球茎分化为球茎系数达到5.14；IAA和6-BA利于原球茎分化产生的球茎生根，在IAA 2.5mg/L+6-BA 0.1mg/L时球茎产生根数达到6.26条/球茎，根重达到9.90mg/条。

[0033] 本试验以1年生球茎产生的原球茎为外植体，分别研究4种生长素和分裂素对原球茎增殖分化的影响以及激素组合对原球茎分枝状伸长增殖分化、原球茎分化产生球茎和球茎生根的影响，形成一个完整的山兰原球茎途径种苗快繁技术体系。

[0034] 自然条件下，山兰原球茎分枝状增殖生长缓慢且只分化出1个球茎，自然繁殖效率低；在组培条件下，受激素调控，原球茎生长速度快，分枝状伸长增殖系数达到8.67，原球茎分化产生球茎系数达到5.14，即1个原球茎经过继代增殖和分化培养后可产生约45棵根茎叶完整的健壮种苗。

附图说明

[0035] 图1示原球茎分枝状伸长增殖；

[0036] 图2示原球茎分化产生球茎；

[0037] 图3示球茎分化产生根。

具体实施方式

[0038] 本发明公开了一种山兰原球茎的种苗快繁培养基及种苗快繁方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0039] 本发明提供的一种山兰原球茎的种苗快繁培养基及种苗快繁方法中所用种子、培养基组分、试剂均可由市场购得。

[0040] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0041] 实施例1

[0042] 1试验材料和方法

[0043] 1.1试验材料

[0044] 以1年生球茎产生的原球茎为外植体，球茎消毒及培养方法参考相关文献(王平平，王玉娇，陈旭辉，等.山兰菌根真菌离体培养条件的研究[J].北方园艺，2012，(09):66-69.)，外植体为带有生长点的原球茎，大小约3*3*5mm。

[0045] 1.2生长素对原球茎增殖分化的影响

[0046] 以MS+6-BA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.5g/L为基本培养基，分别添加2,4-D、NAA、IBA、IAA各0.1mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L、10.0mg/L；培养温度为23℃，光暗周期为14h/10h，光照强度为1500lx，培养时间55d，每处理3重复，每重复15个外植体，统计指标为原球茎分枝状伸长增殖分化系数、原球茎分化产生球茎系数和原球茎分化产生球茎平均生根数，原球茎分枝状伸长增殖分化系数＝原球茎分枝状伸长分枝数/接种原球茎数，原球茎分化产生球茎系数＝原球茎分枝状伸长分化产生的球茎数/原球茎分枝状伸长分枝数，原球茎分化产生球茎的平均生根数＝原球茎分化产生球茎的生根数/原球茎分化产生的球茎数。

[0047] 1.3分裂素对原球茎增殖分化的影响

[0048] 以MS+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉4.5g/L为基本培养基，分别添加TDZ、ZT、6-BA、KT各0.1mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L、10.0mg/L；培养温度为23℃，光暗周期为14h/10h，光照强度为1500lx，培养时间55d，每处理3重复，每重复15个外植体，统计指标同1.2。

[0049] 1.4 NAA和ZT组合对原球茎分枝状伸长增殖分化的影响

[0050] 以MS+蔗糖30g/L+琼脂粉4.5g/L为基本培养基，以对原球茎分枝状伸长增殖分化效果好的NAA和ZT进行组合，NAA浓度为0.1mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L，ZT浓度为0.1mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L；培养温度为23℃，光暗周期为14h/10h，光照强度为1500lx，培养时间55d，每处理3重复，每重复15个外植体，统计指标为原球茎分枝状伸长增殖分化系数。

[0051] 1.5 IAA和6-BA组合对原球茎分化产生球茎和球茎生根的影响

[0052] 以MS+蔗糖30g/L+琼脂粉4.5g/L为基本培养基，以对原球茎分化产生球茎和球茎生根效果好的IAA和6-BA进行组合，IAA浓度为0.1mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、7.5mg/L、10.0mg/L，6-BA浓度为0.1mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、7.5mg/L、10.0mg/L；培养温度为23℃，光暗周期为14h/10h，光照强度为1500lx，培养时间55d，每处理3重复，每重复15个外植体，统计指标为原球茎分化产生球茎系数和原球茎分化产生球茎的平均生根数及均根重，均根重＝球茎总根重/总根数。

[0053] 1.6数据分析

[0054] 试验数据用SAS8.01进行方差分析。

[0055] 2结果与分析

[0056] 2.1生长素对原球茎增殖分化的影响

[0057] 2.1.1生长素对原球茎分枝状伸长增殖分化的影响如表1所示，对原球茎分枝状伸长增殖效果显著的生长素为NAA，在NAA2.0mg/L时达到最大值增殖系4.15。

[0058] 表1生长素对原球茎分枝状伸长增殖分化的影响

[0059]

[0060] 2.1.2生长素对原球茎分化产生球茎的影响如表2所示，对原球茎分化产生球茎效果较好的的生长素为IAA，在IAA 6.0mg/L时达到最大分化系数0.75。

[0061] 表2生长素对原球茎分化产生球茎的影响

[0062]

[0063] 2.1.3生长素对原球茎分化产生球茎生根的影响如表3所示，对原球茎分化产生球茎生根效果较好的生长素为IAA，在IAA6.0mg/L时达到最大生根数1.67条/球茎。

[0064] 表3生长素对原球茎分化产生球茎生根的影响

[0065]

[0066] 2.2分裂素对原球茎增殖分化的影响

[0067] 2.2.1分裂素对原球茎分枝状伸长增殖分化的影响如表4所示，利于原球茎分枝状伸长增殖的分裂素为ZT，在ZT 2.0mg/L时达到最大增殖系数2.08。

[0068] 表4分裂素对原球茎分枝状伸长增殖分化的影响

[0069]

[0070]

[0071] 2.2.2分裂素对原球茎分化产生球茎的影响如表5所示，对原球茎分化产生球茎效果显著的分裂素为6-BA，在6-BA6.0mg/L时达到最大分化系数0.56。

[0072] 表5分裂素对原球茎分化产生球茎的影响

[0073]

[0074] 2.2.3分裂素对原球茎分化产生球茎生根的影响如表6所示，对原球茎分化产生球茎生根效果较好的分裂素为6-BA，在6-BA6.0mg/L时达到最大值1.81条/球茎。

[0075] 表6分裂素对原球茎分化产生球茎生根的影响

[0076]

[0077] 2.3 NAA和ZT组合对原球茎分枝状伸长增殖分化的影响

[0078] NAA和ZT组合对原球茎分枝状伸长增殖分化的影响如表7所示，NAA为1.0mg/L时原球茎分枝状伸长增殖分化系数随ZT浓度增大呈先增后减的趋势，在NAA 1.0mg/L+ZT1.0mg/L时原球茎分枝状伸长增殖效果较好，如图1所示，增殖系数达到8.67。

[0079] 表7 NAA和ZT组合对原球茎分枝状伸长增殖分化的影响

[0080]

[0081] 2.4 IAA和6-BA组合对原球茎分化产生球茎和球茎生根及根重的影响

[0082] 2.4.1 IAA和6-BA组合对原球茎分化产生球茎的影响如表8所示，IAA为2.5mg/L时原球茎分化产生球茎的系数随6-BA浓度增大呈先增后减的趋势，在IAA 2.5mg/L+6-BA2.5mg/L时原球茎分化为球茎效果较好，分化系数达到5.14，如图2所示。

[0083] 表8 IAA和6-BA组合对原球茎分化产生球茎的影响

[0084]

[0085] 2.4.2 IAA和6-BA组合对原球茎分化产生球茎生根的影响如表9所示，IAA为2.5mg/L时有利于原球茎分化产生的球茎生根，生根数随6-BA浓度增大而降低，在IAA 
2.5mg/L+6-BA 0.1mg/L时球茎生根数最多，达到6.26条/球茎，如图3所示。

[0086] 表9 IAA和6-BA组合对原球茎分化产生球茎生根的影响(条/球茎)

[0087]

[0088] 2.4.3 IAA和6-BA组合对原球茎分化产生球茎根重的影响如表10所示，IAA为2.5mg/L时有利于根系生长，根重随6-BA浓度增大而降低，在IAA2.5mg/L+6-BA0.1mg/L时球茎产生的根重量最大，达到9.90mg/条。

[0089] 表10 IAA和6-BA组合对原球茎分化产生的球茎根重的影响(mg/条)

[0090]

[0091] 3讨论

[0092] 3.1山兰原球茎增殖系数高，是一种比较理想的增殖材料，但直接从土壤中获得的原球茎作为初代接种材料存在消毒困难和存活率低的问题，而1年生球茎表面光滑，容易消毒且生命力旺盛，因此以1年生球茎为初代接种材料较为合适，以1年生球茎分化出的无菌原球茎作为继代增殖材料。

[0093] 3.2在组培条件下，受激素调控，原球茎以愈伤状和分枝状伸长两种方式增殖，分枝状伸长增殖方式便于生产操作，是原球茎途径种苗快繁的主要增殖方式。

[0094] 3.3在单因素试验时，对原球茎分化为球茎和球茎生根效果最好的激素浓度，在组合条件下并未表现出最佳分化效果，而是在较低的浓度组合时分化效果最好，这可能是高的激素浓度存在拮抗的作用的原因。

[0095] 3.4由于根卷曲生长，长度不易测定，但根的直径大致相同，因此以根的数量和根的均重两个指标来衡量生根效果。

[0096] 3.5自然条件下，山兰原球茎分枝状增殖生长缓慢且只分化出1个球茎，自然繁殖效率低；在组培条件下，受激素调控，原球茎生长速度快，分枝状伸长增殖系数达到8.67，原球茎分化产生球茎系数达到5.14，即1个原球茎经过继代增殖和分化培养后可产生约45棵根茎叶完整的健壮种苗。

[0097] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。