抑制胃癌的药物组合物及其应用

摘要

本发明提供一种抑制胃癌的药物组合物及其应用，本发明将砷化合物与DNA损伤修复和RAG1表达的调节作为其细胞毒作用的机制联系起来。砷与拓扑异构酶抑制剂的组合有望成为治疗胃癌的新方案。

权利要求

1.一种抑制胃癌细胞的药物组合物,其特征在于，包括:砷剂与拓扑异构酶抑制剂的组合，其中砷剂为NaAsO2，NaAsO2的浓度范围是：6~24 μM，拓扑异构酶抑制剂为伊立替康，伊立替康的浓度范围12.5μm 100μm。

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2.NaAsO2和拓扑异构酶抑制剂在制备抑制胃癌的药物中的应用，NaAsO2的浓度范围是：

6 24 μM，拓扑异构酶抑制剂为伊立替康，伊立替康的浓度范围是：12.5μm 100μm。

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说明书

抑制胃癌的药物组合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抑制胃癌的药物组合物，属于药物领域。

背景技术

[0002] 胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别居全球恶性肿瘤第四位、第二位。我国是消化道肿瘤的高发国家，中国国家癌症中心发布的中国癌症数据统计显示，2000‑2011年间我国胃癌发病率及死亡率虽均呈下降趋势，但胃癌在我国男性和女性最常见肿瘤中仍分居第二、三位。由于胃癌患者初诊时大约50％为中晚期，仅部分患者可接受手术治疗。进展期胃癌易发生转移，晚期胃癌患者预后极差。

[0003] 根据美国NCCN胃癌治疗指南推荐，转移或局部进展期胃癌的一线治疗主要包括氟脲嘧啶、多烯紫杉醇、顺铂(DCF方案)或含表柔比星的ECF方案或其改良方案。对于一线治疗后失败的患者，NCCN指南推荐使用伊立替康、多烯紫杉醇、紫杉醇、雷莫卢单抗等单药治疗，或者雷莫卢单抗联合紫杉醇、伊立替康联合氟脲嘧啶治疗。多项Ⅱ期和Ⅲ期临床研究表明，转移性或局部晚期胃癌的二线治疗能够提高患者的总生存期，但是目前二线治疗的中位无进展生存期仅为2.2‑4.4月，总生存期也仅约为8.4‑12.7月，而且化疗不良反应突出，如：心脏毒性、肺脏毒性、肝肾毒性以及骨髓抑制等副作用，而限制药物的使用剂量或停药，这给胃癌患者的治疗带来了更大的挑战。因此，寻找到针对晚期胃癌有效且安全的药物或新的治疗方案，特别是找到其作用的靶点或疗效预后因子并阐明其作用机制，显得格外迫切和重要。

[0004] 含砷类中药雄黄和砒霜在我国传统医学中有悠久的历史，近年来在治疗肿瘤方面取得了令人瞩目的进展。“以毒攻毒”旨在以药物之“毒”去攻癌瘤之“毒”。三氧化二砷(As2O3，ATO)是砒霜的主要成分，被成功应用于治疗急性早幼粒细胞白血病。自美国食品与药物管理局(FDA)批准ATO为临床用药以来，在ATO用于实体肿瘤的治疗方面许多研究者做出了积极的探索。相关临床实验包括单药治疗：尿路上皮癌、肾细胞癌、生殖细胞肿瘤、肝细胞肝癌、胰腺癌，或砷剂联合化疗或放疗治疗乳腺癌，结肠直肠癌，生殖细胞肿瘤、头颈部肿瘤、胶质瘤。从目前的临床试验结果来看，单药ATO治疗实体瘤临床疗效不明显。另一方面，ATO与放疗或其他治疗药物之间存在协同作用，提示可将砷剂作为放化疗增敏剂，或许能给晚期癌症患者带来更多获益。

[0005] 一种可以口服的含砷中药雄黄近年来也越来越受到人们关注。雄黄的主要成分为As4S4，是硫元素和砷元素的八元络合物，毒性较氧化砷明显减低，更具临床应用前景。国内外学者就雄黄对于实体瘤细胞的作用也进行了初步的探索，发现硫化砷对乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞生长有抑制作用。

[0006] DNA拓扑异构酶是广泛存在于生物体内的一类必需酶，通过调节超螺旋、连锁、去连锁以及核酸解离作用，影响DNA拓扑结构，其主要分为拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)与拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)。DNA拓扑异构酶作为重要的细胞核内酶，在生物体内发挥至关重要的作用。多种肿瘤细胞如结肠癌、宫颈癌、卵巢癌等的拓扑异构酶含量大大高于正常组织，且在S期肿瘤细胞中活性大幅提高，以其作为靶酶设计的抗肿瘤药物，可选择性抑制增殖期肿瘤细胞DNA复制，不仅活性高，而且选择性好，对于癌症化疗具有重要的意义。喜树碱类衍生物伊立替康(Irinotecan，IRN)及其代谢产物SN38是DNA拓扑异构酶I抑制剂，依托泊苷和抗生素类抗肿瘤药多柔比星、表柔比星则对DNA拓扑异构酶II有抑制作用。

[0007] NFAT作为细胞信号转导通路中的一类重要的转录因子参与细胞功能的调节。该家族由不同基因编码的5个成员组成，包括：NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4和NFAT5，其中前四个是其经典成员。NFAT家族经典成员的活化主要是通过细胞内钙/钙调神经磷酸酶的刺激启动，它脱磷酸后发生核转位并与DNA的特定序列结合，同时通过与其它转录因子的协同作用，调节目的基因的特定表达。近年来，越来越多的研究数据显示，NFAT蛋白调节的基因不仅与免疫系统相关，而且在血管生成、骨内稳态、神经元轴突发展及人类肿瘤的发生、发展密切相关，NFAT的异常活化与肿瘤的发生密切相关。Peuker K等人报道，肠上皮细胞中CN以NFAT依赖的方式促进肿瘤干细胞生长增殖以及小鼠肠癌的进展，NFAT核易位与结肠癌患者死亡率增加相关。在小鼠模型中敲除NFATc3之后，肿瘤的体积和增殖能力较对照小鼠明显减低。

[0008] 重组激活基因1(Recombination Activating 1，RAG 1)是由RAG1基因编码的蛋白，该基因编码的蛋白可激活免疫球蛋白的V‑D‑J重排过程。RAG1蛋白能识别DNA底物，与RAG2构成异源四聚体的RAG复合物，可稳定的结合在VDJ两侧的保守重组信号序列(RSS)，对DNA进行攻击，将DNA切断为两条重组基因片段和两条编码序列，引起DNA damage的发生，随后通过非同源末端重组的方式互相结合，完成RSS的删除和最终的V(D)J序列重排，使T细胞和B细胞产生抗原多样化的特异性抗体。RAG1基因的缺陷会导致严重的免疫性疾病，例如：重症联合免疫缺陷(SCID)、Omenn综合征等等。此外，重组过程中会产生染色体转位、缺失或嵌入，与淋巴瘤的发生有密切相关。细胞内RAG蛋白持续升高，会造成DNA大量损伤。DSB在DNA复制和细胞分裂过程中会造成遗传物质的大量丢失或重排，是众多DNA损伤中危害性最大的致死事件。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供一种药物组合物，以抑制胃癌。

[0010] 本发明采用了如下技术方案：

[0011] 本发明提供一种新的抑制胃癌细胞的药物组合物,其特征在于，包括：砷剂与拓扑异构酶抑制剂的组合，其中砷剂为As4S4或NaAsO2。

[0012] 进一步，本发明的药物组合物,还具有这样的特征：As4S4的浓度范围是：1～3μM，NaAsO2的浓度范围是：6～24μM。

[0013] 进一步，本发明的药物组合物,还具有这样的特征：拓扑异构酶抑制剂包含伊立替康、依托泊苷、表柔比星、多柔比星和SN38。

[0014] 进一步，本发明的药物组合物,还具有这样的特征：伊立替康的浓度范围12.5μm～100μm。

[0015] 进一步，本发明的药物组合物,还具有这样的特征：依托泊苷的浓度范围12.5μm～100μm。

[0016] 进一步，本发明的药物组合物,还具有这样的特征：多柔比星的浓度范围0.2μm～6.4μm。

[0017] 进一步，本发明的药物组合物,还具有这样的特征：表柔比星的浓度范围0.2μm～6.4μm。

[0018] 进一步，本发明的药物组合物,还具有这样的特征：SN38的浓度范围0.125μm～4μm。

[0019] 本发明还提供As4S4、NaAsO2和伊立替康在制备抑制胃癌的药物中的应用。

[0020] 进一步，As4S4和伊立替康在制备抑制胃癌的药物中的应用,还具有这样的特征：As4S4的浓度范围：1～3μm，NaAsO2的浓度范围是：6～24μM。

[0021] 进一步，As4S4和伊立替康在制备抑制胃癌的药物中的应用,还具有这样的特征：伊立替康的浓度范围是：12.5μm～100μm。

[0022] 本发明还提供NFATc3在制备杀伤胃癌的试剂中的应用。

[0023] 本发明还提供NFATc3在制备RAG1的启动子区转录抑制试剂中的应用。

[0024] 本发明还提供As4S4和NaAsO2在制备增强拓扑异构酶抑制剂的细胞毒性的试剂中的应用。

[0025] 发明的有益效果

[0026] 本发明将砷化合物与DNA损伤修复和RAG1表达的调节作为其细胞毒作用的机制联系起来。砷与拓扑异构酶抑制剂的组合有望成为治疗胃癌的新方案。

附图说明

[0027] 图1是As4S4和伊立替康(IRN)联合，对胃癌细胞的抑制作用的结果图；

[0028] 图2是NaAsO2和伊立替康联合，对胃癌细胞的抑制作用的结果图；

[0029] 图3是As4S4和依托泊苷(Etop)联合，对胃癌细胞的抑制作用的结果图；

[0030] 图4是As4S4和多柔比星(Dox)联合，对胃癌细胞的抑制作用的结果图；

[0031] 图5是As4S4和表柔比星(Epir)联合，对胃癌细胞的抑制作用的结果图；

[0032] 图6是As4S4和SN38联合，对胃癌细胞的抑制作用的结果图；

[0033] 图7是As4S4联合伊立替康对细胞的抑制作用检测中MTT检测细胞存活情况的结果；

[0034] 图8是As4S4联合伊立替康对细胞的抑制作用检测中Cell titer检测细胞内ATP活性的结果；

[0035] 图9是NaAsO2和伊立替康联合对细胞的抑制作用检测中MTT检测细胞存活情况的结果；

[0036] 图10是流式细胞术检测细胞凋亡的结果图；

[0037] 图11是流式细胞术检测细胞凋亡后凋亡细胞的统计结果；

[0038] 图12是Western Blot检测As4S4加伊立替康后NFATc3及RAG1变化，以及凋亡指标PARP变化的结果。

[0039] 图13是Western Blot检测NaAsO2加伊立替康后NFATc3及RAG1变化，以及凋亡指标PARP变化的结果。

具体实施方式

[0040] 以下结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的说明。

[0041] 本文中所使用的名词砷剂，是As4S4和NaAsO2的统称。AS指As4S4。

[0042] [实验方法]

[0043] 一、砷剂和伊立替康联合应用的实验：

[0044] 1.胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至4
6×10/ml。

[0045] 2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，用排枪接种至96孔板，每孔加入70μl。将接种好的细胞培养板放入5％CO2，37℃培养箱中过夜培养。

[0046] 3.过夜待细胞贴壁后，向各孔加药，加药方法：在EP管中用培养基配置出不同浓度的拓扑异构酶抑制剂(IRN、Etop、Dox、Epir、SN38)，As4S4联合伊立替康组，As4S4终浓度分别为0μM、1μM、2μM、3μM，伊立替康终浓度为0、12.5、25、50、100、200μM。

[0047] NaAsO2联合伊立替康组，NaAsO2终浓度分别为0μM、6μM、12μM、24μM，伊立替康终浓度为0、12.5、25、50、100、200μM。

[0048] As4S4联合Etop组，As4S4终浓度为3uM，Etop终浓度为0、12.5、25、50、100、200μM。

[0049] As4S4联合Dox组，As4S4终浓度为3uM，Dox终浓度为0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4μM。

[0050] As4S4联合Epir组，As4S4终浓度为3uM，Epir终浓度为0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4μM。

[0051] As4S4联合SN38组，As4S4终浓度为3uM，SN38终浓度为0、0.125、0.25、0.5、1、2、4μM。

[0052] 4.5％CO2，37℃培养箱培养24小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

[0053] 5.每孔加入10μl CCK8溶液，继续培养3h。

[0054] 6.在酶联免疫检测仪OD450nm处测量各孔的吸光值。

[0055] 7.设置调零孔，孔内加培养基和CCK8。设置对照孔，孔内加细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液和CCK8。

[0056] 8.计算细胞存活率＝(加药组平均OD值‑空白组平均OD值)/(对照组平均OD值‑空白组平均OD值)。

[0057] 结果如图1、图2、图3和图4所示。图1中标记AS指As4S4。

[0058] 二、Cell titer检测细胞内ATP活性实验：

[0059] 1.胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至4
6×10/ml。

[0060] 2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，用排枪接种至96孔板，每孔加入70μl(边缘孔用无菌PBS填充)。将接种好的细胞培养板放入5％CO2，37℃培养箱中过夜培养。

[0061] 3.过夜待细胞贴壁后，向各孔加药，加药方法：在EP管中用培养基配置出不同浓度的药物每孔加入30μl培养基，使得每组药物终浓度分别为：con:IRN 0μM+AS 0μM、IRN:IRN 25μM+AS 0μM、AS：IRN 0μM+AS 3μM、AS+IRN：IRN 25μM+AS 3μM。

[0062] 4.5％CO2，37℃培养箱培养24小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

[0063] 5.在室温下平衡板及其内容物约30分钟。

[0064] 6.每孔加入100μl的Cell Titer‑ 试剂(CellTiter‑ Luminescent Cell Viability Assay，promega,G7572)。

[0065] 7.在摇床上混合内容物2分钟以诱导细胞裂解。

[0066] 8.使板在室温下孵育10分钟以稳定发光信号。

[0067] 9.同时设置调零孔(培养基、Cell Titer‑ )以获得背景发光的值。

[0068] 10.将每组混合物用排枪转移至不透明壁白板中，组间孔与孔间隔4排空白孔以避免发光相互影响。

[0069] 11.记录发光。

[0070] 此实验可间接反应细胞数目，结果见图5。

[0071] 由图2和图3可以共同验证。在3μM As4S4和25μM伊立替康联合应用的情况下，胃癌细胞的成活下降到不足5％。

[0072] 三、流式细胞术检测细胞凋亡,实验步骤:

[0073] 1.胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5
1×10/ml。

[0074] 2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，用1ml移液器接种至12孔板中，轻轻的左右前后水平摇晃几次，使细胞均匀分散在孔中，将接种好的细胞培养板放入5％CO2，37℃培养箱中过夜培养。

[0075] 3.过夜待细胞贴壁后，向各孔加药，使得每组药物终浓度分别为：con:IRN 0μM+AS 0μM、IRN:IRN 25μM+AS 0μM、AS：IRN 0μM+AS 3μM、AS+IRN：IRN 25μM+AS 3μM。

[0076] 4.5％CO2，37℃培养箱培养24小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

[0077] 5.将上清转移至EP管中并标记清楚，用胰酶消化各孔细胞，用EP管中上清终止消化(原孔上清终止相应孔消化的细胞)离心收集细胞。

[0078] 6.弃掉上清，用PBS清洗细胞一次。

[0079] 7.用FITC‑AnnexinV标记凋亡细胞。

[0080] 8.流式细胞仪上机检测细胞凋亡。

[0081] 如图6和图7所示，在3μM As4S4和25μM伊立替康联合应用的情况下，细胞凋亡比例达到75％。

[0082] 四、WB检测As4S4和NaAsO2分别加伊立替康后NFATc3及RAG1变化，以及凋亡指标PARP变化，实验方法如下：

[0083] 1.细胞处理：

[0084] 1)胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5
1×10/ml。

[0085] 2)将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，用1ml移液器接种至12孔板中，轻轻的左右前后水平摇晃几次，使细胞均匀分散在孔中，将接种好的细胞培养板放入5％CO2，37℃培养箱中过夜培养。

[0086] 3)过夜待细胞贴壁后，向各孔加药，使得As4S4的每组药物终浓度分别为：con:IRN 0μM+AS 0μM、IRN:IRN 25μM+AS 0μM、AS：IRN 0μM+AS 3μM、AS+IRN：IRN 25μM+AS 3μM。

[0087] NaAsO2的每组药物终浓度分别为：con:IRN 0μM+NaAsO20μM、IRN:IRN 25μM+NaAsO20μM、NaAsO2：IRN 0μM+NaAsO224μM、NaAsO2+IRN：IRN 25μM+NaAsO224μM。

[0088] 4)5％CO2，37℃培养箱培养24小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

[0089] 2.样品收集

[0090] 1)将上清转移至EP管中并标记清楚，用胰酶消化各孔细胞，用EP管中上清终止消化(原孔上清终止相应孔消化的细胞)离心收集细胞。

[0091] 2)弃掉上清，用PBS清洗细胞一次。

[0092] 3)每管加入适量RIPA裂解液(+cocktail、+p‑cocktail),冰上裂解10min.[0093] 4)超声仪超声裂解物(冰水浴)，打断DNA使蛋白充分释放，超声至裂解物澄清不粘稠。

[0094] 5)12000rpm，4℃离心10min，小心吸取适量体积中间层裂解产物，加入4xSample buffer，100℃金属浴煮样10min，样品置于冰上稳定10min，涡旋‑离心混匀样品。

[0095] 3.上样与电泳：把蛋白样品直接上样到NuPAGE Novex 10％Bis‑Tris胶加样孔内。恒压160V，50min(或者根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即停止电泳)。

[0096] 4.转膜：选用PVDF膜，使用Bio‑Rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电压为30V，转膜时间为30‑60分钟(具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短)。

[0097] 5.封闭：转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的5％脱脂奶粉中，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。

[0098] 6.一抗孵育:参考一抗的说明书，按照适当比例用3％BSA稀释一抗，吸尽封闭液，加入1xPBST，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5‑10分钟。吸尽洗涤液后立即加入稀释好的一抗，4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜，回收一抗。加入1xPBST，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤
5‑10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5‑10分钟。共洗涤3次。

[0099] 7.二抗孵育：根据一抗选择合适二抗按照适当比例用5％脱脂奶粉稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

[0100] 8.蛋白检测：弃掉二抗，加入1xPBST，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5‑10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5‑10分钟。共洗涤3次。用Millipore ECL显影液浸湿膜蛋白表面，在Amersham Imager 600自动化学发光凝胶成像分析。结果如图8和图9所示。

[0101] 【实验结果】

[0102] 如图1和图2所示，伊立替康，即图中标注IRN的曲线，As4S4和伊立替康联合即图中标注IRN+AS的曲线。

[0103] As4S4可明显增强胃癌细胞对伊立替康的敏感性。

[0104] NaAsO224μM可明显增强胃癌细胞对伊立替康的敏感性。

[0105] 实验结果显示As4S4或NaAsO2和伊立替康联合使用时，合加组较单药组能杀死更多的肿瘤细胞。进一步研究发现：其他拓扑异构酶抑制剂，包括依托泊苷、表柔比星、多柔比星和SN38与砷联用时，与单独用药组比较合用组都能杀死更多的胃癌细胞，说明砷可以增强拓扑异构酶抑制剂这类药物的细胞毒作用。NFATc3是As4S4的靶标，抑制NFATc3后可明显抑制胃癌细胞的生长。砷以及NFATc3的敲低通过上调RAG1(一种免疫球蛋白V(D)J重组必需的内切核酸酶)的表达，从而导致胃癌细胞中双链DNA损伤(DSB)的增加。机制上，砷和伊立替康协同诱导NFATc3降解，导致DNA修复系统的失能和致命的DNA损伤，这反映在磷酸化的ATM/CHK2/CHK1/RPA32蛋白水平的降低和磷酸化H2AX蛋白水平的显着增加上。

[0106] 结论：我们的研究结果将砷化合物与DNA损伤修复和RAG1表达的调节作为其细胞毒作用的机制联系起来。砷与拓扑异构酶抑制剂的组合有望成为治疗胃癌的新方案。