一株以亚硝酸盐为氮源的耐盐反硝化细菌及其应用转让专利
申请号 : CN201910441584.9
文献号 : CN110184217B
文献日 : 2021-04-23
发明人 : 祝惠 , 王鑫壹 , 阎百兴 , 陈欣 , 于翔霏
申请人 : 中国科学院东北地理与农业生态研究所
摘要 :
一株以亚硝酸盐为氮源的耐盐反硝化细菌及其应用，本发明涉及环境微生物领域，尤其涉及以亚硝酸盐为氮源的耐盐反硝化细菌。本发明要解决现有反硝化细菌脱氮能力受到盐分抑制，无法对含盐废水中亚硝酸盐氮进行去除的技术问题。菌株为栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌Pannonibacter phragmitetus F1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年3月25日，保藏编号为CGMCC No.17432。该菌株可在含盐条件下脱氮，进行反硝化。本发明菌株用于去除水体中亚硝酸盐氮污染物。
权利要求 :
1.一株以亚硝酸盐为氮源的耐盐反硝化细菌，其特征在于：该菌株为栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌(Pannonibacter phragmitetus)F1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年3月25日，保藏编号为CGMCC No.17432。
2.权利要求1所述的耐盐反硝化细菌在含盐条件下反硝化脱氮的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述含盐条件为NaCl浓度≤10g/L。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述脱氮的反应条件pH为7～11，NaNO2初始浓度为0.4～1.6g/L。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述耐盐反硝化细菌的接种量为3～7％(v/v)。
说明书 :
一株以亚硝酸盐为氮源的耐盐反硝化细菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及环境微生物领域，尤其涉及以亚硝酸盐为氮源的耐盐反硝化细菌。
背景技术
[0002] 随着人类生活质量的提高，产生了大量的高氮废水，高氮污染成为当下亟待解决的重大问题。其中，存在水体中的亚硝酸盐氮具有高毒性，易造成水体恶化，对水生动物以
及人类正常生长造成影响，甚至危及生命。亚硝酸盐氮污染来源广泛，主要来源于生活污
水、工业废水和养殖废水等。生活污水中的氮素污染物通过微生物降解和氨化作用被转化
为氨，随后通过亚硝化细菌的氧化作用转化为亚硝酸盐，造成亚硝酸盐氮污染。在工业生产
过程中，亚硝酸盐作为生产原料容易残留污染环境，同时产生了大量的含氮废水和废渣，为
亚硝酸盐的形成提供了物质基础。在水产养殖过程中，鱼虾排泄物的积累、放养密度过高和
投饲残饵过多等诸多因素造成氮素污染物被大量积累，而不同形态的氮又可通过微生物的
作用转化成亚硝酸盐，导致养殖水体中亚硝酸盐氮逐年升高。因此，去除和防控水体中的亚
硝酸盐氮污染是亟待解决的重大问题。
及人类正常生长造成影响，甚至危及生命。亚硝酸盐氮污染来源广泛，主要来源于生活污
水、工业废水和养殖废水等。生活污水中的氮素污染物通过微生物降解和氨化作用被转化
为氨，随后通过亚硝化细菌的氧化作用转化为亚硝酸盐，造成亚硝酸盐氮污染。在工业生产
过程中，亚硝酸盐作为生产原料容易残留污染环境，同时产生了大量的含氮废水和废渣，为
亚硝酸盐的形成提供了物质基础。在水产养殖过程中，鱼虾排泄物的积累、放养密度过高和
投饲残饵过多等诸多因素造成氮素污染物被大量积累，而不同形态的氮又可通过微生物的
作用转化成亚硝酸盐，导致养殖水体中亚硝酸盐氮逐年升高。因此，去除和防控水体中的亚
硝酸盐氮污染是亟待解决的重大问题。
[0003] 去除废水中亚硝酸盐氮的方法包括物理方法、化学方法和生物方法，其中生物脱氮具有高效、经济、易操作和无二次污染等优点得到了广泛研究。亚硝酸盐氮的去除主要通
过微生物的硝化作用和反硝化作用来实现。然而，由于废水中污染物成分复杂多样以及处
理环境不同，增加了去除废水中亚硝酸盐氮的难度。例如，以海水代用形式被应用在人们的
日常生活、工业和养殖业中产生的含有大量亚硝酸盐氮的含盐废水。普通反硝化细菌脱氮
能力受到盐分抑制，无法对含盐废水中亚硝酸盐氮进行去除。
过微生物的硝化作用和反硝化作用来实现。然而，由于废水中污染物成分复杂多样以及处
理环境不同，增加了去除废水中亚硝酸盐氮的难度。例如，以海水代用形式被应用在人们的
日常生活、工业和养殖业中产生的含有大量亚硝酸盐氮的含盐废水。普通反硝化细菌脱氮
能力受到盐分抑制，无法对含盐废水中亚硝酸盐氮进行去除。
发明内容
[0004] 本发明要解决现有反硝化细菌脱氮能力受到盐分抑制，无法对含盐废水中亚硝酸盐氮进行去除的技术问题，而提供一株以亚硝酸盐为氮源的耐盐反硝化细菌及其应用。
[0005] 本发明一株以亚硝酸盐为氮源的耐盐反硝化细菌为栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌Pannonibacter phragmitetus F1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中
心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年3月25日，保藏编号为
CGMCC No.17432。
心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年3月25日，保藏编号为
CGMCC No.17432。
[0006] 该菌株栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌Pannonibacter phragmitetus F1通过16S rDNA序列比对分析，与栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌(Pannonibacter phragmitetus)的16S rDNA序
列的同源性为99.72％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定，本发明
的菌株F1属于Pannonibacter phragmitetus菌种。
列的同源性为99.72％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定，本发明
的菌株F1属于Pannonibacter phragmitetus菌种。
[0007] 本发明的耐盐反硝化细菌在含盐条件下脱氮的应用。
[0008] 进一步的，所述含盐条件为NaCl浓度≤10g/L。
[0009] 进一步的，所述含盐条件pH为7～11，NaNO2初始浓度为0.4～1.6g/L。
[0010] 进一步的，所述耐盐反硝化细菌的接种量为3～7％(v/v)。
[0011] 本发明的有益效果是：
[0012] 本发明筛选出一株栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌(Pannonibacter phragmitetus)，其具有高效去除亚硝酸盐氮的反硝化能力；进一步发现这种细菌具有一定的耐盐性，在含盐
条件中有效发挥其反硝化能力。利用这类具有耐盐反硝化能力的细菌的生理生化特性和代
谢机理，能够较好的解决在含盐条件下去除废水中亚硝酸盐氮存在的难题。
条件中有效发挥其反硝化能力。利用这类具有耐盐反硝化能力的细菌的生理生化特性和代
谢机理，能够较好的解决在含盐条件下去除废水中亚硝酸盐氮存在的难题。
[0013] 本发明提供的Pannonibacter phragmitetus F1是一株以亚硝酸盐为氮源的反硝‑ ‑
化细菌，当接种量为5％(v/v)时，其对NO2‑N、NO3‑N去除率较高，并在培养过程中伴有大量
气体生成，说明Pannonibacter phragmitetus F1具有高效的反硝化性能。此外，通过耐盐
性测定结果判定Pannonibacter phragmitetus F1具有一定的耐盐性，但盐度过高会导致
其生长速度缓慢。在0～10g/L NaCl盐度条件下，Pannonibacter phragmitetus F1具有高
‑ ‑
效的NO2 ‑N、NO3 ‑N去除能力，去除率分别在98％和91％以上。因此，本发明菌株
Pannonibacter phragmitetus F1在一定的含盐条件下处理高浓度亚硝酸盐废水具有很好
的实用价值和应用前景。
化细菌，当接种量为5％(v/v)时，其对NO2‑N、NO3‑N去除率较高，并在培养过程中伴有大量
气体生成，说明Pannonibacter phragmitetus F1具有高效的反硝化性能。此外，通过耐盐
性测定结果判定Pannonibacter phragmitetus F1具有一定的耐盐性，但盐度过高会导致
其生长速度缓慢。在0～10g/L NaCl盐度条件下，Pannonibacter phragmitetus F1具有高
‑ ‑
效的NO2 ‑N、NO3 ‑N去除能力，去除率分别在98％和91％以上。因此，本发明菌株
Pannonibacter phragmitetus F1在一定的含盐条件下处理高浓度亚硝酸盐废水具有很好
的实用价值和应用前景。
[0014] 本发明一株以亚硝酸盐为氮源的耐盐反硝化细菌为栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌Pannonibacter phragmitetus F1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中
心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年3月25日，保藏编号为
CGMCC No.17432。
心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年3月25日，保藏编号为
CGMCC No.17432。
[0015] 本发明菌株用于去除水体中亚硝酸盐氮污染物。
附图说明
[0016] 图1为本发明Pannonibacter phragmitetus F1培养过程中的气体生成现象照片；
[0017] 图2为本发明Pannonibacter phragmitetus F1基因组DNA的PCR扩增产物电泳图谱；图中，F1为本发明菌株Pannonibacter phragmitetus F1；
[0018] 图3为本发明Pannonibacter phragmitetus F1和相似菌株的16S rDNA基因序列构建的系统发育树谱图；
[0019] 图4为实施例一Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑‑N和NO3‑‑N的去除效果‑ ‑
图；其中a代表NO2‑N，b代表NO3‑N；
图；其中a代表NO2‑N，b代表NO3‑N；
[0020] 图5为实施例一不同盐度下Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑‑N和NO3‑‑N的‑ ‑
去除能力对比图；其中■代表NO2‑N，●代表NO3‑N。
去除能力对比图；其中■代表NO2‑N，●代表NO3‑N。
具体实施方式
[0021] 本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。
[0022] 具体实施方式一：本实施方式一株以亚硝酸盐为氮源的耐盐反硝化细菌为栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌Pannonibacter phragmitetus F1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委
员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年3月
25日，保藏编号为CGMCC No.17432。
员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年3月
25日，保藏编号为CGMCC No.17432。
[0023] 本实施方式栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌Pannonibacter phragmitetus F1菌落呈圆点状，极小，边缘整齐，表面光滑，有光泽。显微镜下观察菌体杆状，为革兰氏阴性菌。
[0024] 本实施方式Pannonibacter phragmitetus F1的生理生化特征，如表1所示：
[0025] 表1 Pannonibacter phragmitetus F1的生理生化特征
[0026]
[0027] +：生长或阳性；‑：未生长或阴性。
[0028] 具体实施方式二：本实施方式栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌Pannonibacter phragmitetus F1的筛选方法按以下步骤实现：
[0029] 步骤一：吸取2mL采自辽宁省大连市庄河市(北纬39°38′31″东经122°58′19″)海堤泥水样品放入250mL锥形瓶中，加入200mL的菌株反硝化培养基；采用封口膜将瓶口密封处
理，制造缺氧环境；在温度为30℃条件下恒温静置培养5～7日后得到富集培养液；
理，制造缺氧环境；在温度为30℃条件下恒温静置培养5～7日后得到富集培养液；
[0030] 步骤二：采用倍比稀释法将步骤一富集培养液进行梯度稀释，分别吸取各稀释度悬液0.5mL至菌株筛选平板培养基(已放置过夜，无杂菌生长)中，用玻璃三角涂布棒将富集
培养液涂布均匀，倒入第二层已灭菌的温度不高于40℃的筛选平板培养基中，制造缺氧环
境用于培养反硝化细菌；使用封口膜将平板四周密封；待第二层培养基凝固后将平板倒置，
放入温度为30℃的恒温培养箱中，培养至长出明显菌落；挑取分离出来的菌株，在双层菌株
筛选平板培养基上多次划线纯化，直至显微镜下观察显示无杂菌为止，然后接种至200mL的
反硝化培养基中，在温度为30℃的缺氧条件下恒温静置扩大培养；
培养液涂布均匀，倒入第二层已灭菌的温度不高于40℃的筛选平板培养基中，制造缺氧环
境用于培养反硝化细菌；使用封口膜将平板四周密封；待第二层培养基凝固后将平板倒置，
放入温度为30℃的恒温培养箱中，培养至长出明显菌落；挑取分离出来的菌株，在双层菌株
筛选平板培养基上多次划线纯化，直至显微镜下观察显示无杂菌为止，然后接种至200mL的
反硝化培养基中，在温度为30℃的缺氧条件下恒温静置扩大培养；
[0031] 步骤三：取步骤二扩大培养得到的菌液以5％接种量接种到200mL新鲜的菌株反硝化培养基中，在温度为30℃的缺氧条件下培养5日，观察培养基浑浊情况以及在培养过程中
‑ ‑
是否有气体生成；然后以菌株反硝化培养基中NO2 ‑N、NO3‑N的去除率作为指标进行筛选，
‑ ‑
选取培养后NO2 ‑N、NO3‑N去除率均较高(去除率84％以上)的菌液，经分离、纯化后，获得一
株具有高效脱氮功能的菌株，即完成以亚硝酸盐为氮源的耐盐反硝化细菌的筛选。
‑ ‑
是否有气体生成；然后以菌株反硝化培养基中NO2 ‑N、NO3‑N的去除率作为指标进行筛选，
‑ ‑
选取培养后NO2 ‑N、NO3‑N去除率均较高(去除率84％以上)的菌液，经分离、纯化后，获得一
株具有高效脱氮功能的菌株，即完成以亚硝酸盐为氮源的耐盐反硝化细菌的筛选。
[0032] 其中，所述菌株反硝化培养基(/L)由5g的CH3COONa、1g的K2HPO4、0.8g的NaNO2、0.03g的CaCl2、1g的NaCO3、0.06g的FeSO4·7H2O、0.2g的MgSO4·7H2O和1000mL去离子水组
成，pH自然，温度为121℃高压条件下灭菌30min制成；
成，pH自然，温度为121℃高压条件下灭菌30min制成；
[0033] 菌株筛选平板培养基(/L)是在所述菌株反硝化培养基的基础上每升添加20g琼脂组成，pH自然，温度为121℃高压条件下灭菌30min制成。
[0034] 对Pannonibacter phragmitetus F1进行鉴定
[0035] 16S rDNA测序及进化树制作：
[0036] 菌株F1基因组总DNA提取：按常规方法，经菌株培养，菌体收集，菌体裂解，DNA提取，沉淀，洗涤，抽(晾)干7个步骤，最终得到基因组总DNA，取5μL用1％琼脂糖凝胶电泳检
测。
测。
[0037] 菌株F1基因组DNA的PCR扩增：以总DNA为模板，扩增引物为一对通用引物；
[0038] 正向引物为27F：5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’；
[0039] 反向引物为1492R：5’‑GGTTACCTTGTTA CGACTT‑3’。
[0040] 以基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系如下：
[0041] PCR反应在25μL体系中进行。反应体系的组成为：模板DNA 0.5μL、dNTP(mix)1μL、Taq Buffer(with MgCl2)2.5μL、Taq酶0.2μL，引物F 0.5μL、引物R 0.5μL、加双蒸水至25μ
L。
L。
[0042] PCR扩增需要94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃修复延伸10min，4℃终止反应，将获得片段用于测序。
[0043] 该Pannonibacter phragmitetus F1的16S rDNA如序列表中SEQ ID NO：1所示。
[0044] PCR扩增产物取5μL用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0045] PCR扩增产物电泳图谱如图2所示。
[0046] 验证后切下胶条，用DNA凝胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)纯化PCR产物。
[0047] 系统进化树如图3所示，从图3可见菌株F1与栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌(Pannonibacter phragmitetus)的16S rDNA序列的同源性为99.72％。
[0048] 参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》，结合生理生化特征和16S rDNA测序，鉴定该菌株F1为栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌(Pannonibacter phragmitetus)，16S
rDNA序列的同源性为99.72％。命名菌株F1为：Pannonibacter phragmitetus F1，保藏日期
为2019年3月25日，保藏地址是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号
为CGMCC No：17432。
rDNA序列的同源性为99.72％。命名菌株F1为：Pannonibacter phragmitetus F1，保藏日期
为2019年3月25日，保藏地址是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号
为CGMCC No：17432。
[0049] 具体实施方式三：本实施方式栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌Pannonibacter phragmitetus F1耐盐性测定，具体如下：
[0050] 制不同盐度梯度的筛选平板培养基，即NaCl浓度分别为0g/L、30g/L、50g/L、70g/L和100g/L；将Pannonibacter phragmitetus F1划线接种至各盐度的培养基平板上，放入30
℃恒温培养箱中培养5d，以菌株是否生长作为该菌株是否耐相应盐度的依据；以未接种反
硝化细菌的培养基作为空白对照，每组平行3个。
℃恒温培养箱中培养5d，以菌株是否生长作为该菌株是否耐相应盐度的依据；以未接种反
硝化细菌的培养基作为空白对照，每组平行3个。
[0051] 表2为Pannonibacter phragmitetus F1在不同盐度梯度培养基中生长情况。经1d培养后，各盐度培养基均未出现菌落；经2d培养后，在含0g/L和30g/L NaCl的培养基上有明
显菌落生长，含50g/L NaCl的培养基上有微量菌落生长，含70g/L和100g/L NaCl的培养基
上无菌落生长；经3d培养后，含50g/L NaCl的培养基上出现明显菌落，含70g/L NaCl的培养
基上有微量菌落生长；经5d培养后，在含0g/L、30g/L、50g/L和70g/L NaCl的培养基上均有
菌落生长，含100g/L NaCl的培养基上未观察到菌落生长。证实Pannonibacter
phragmitetus F1具有一定的耐盐性，但盐度过高会导致其生长速度缓慢，甚至抑制生长。
显菌落生长，含50g/L NaCl的培养基上有微量菌落生长，含70g/L和100g/L NaCl的培养基
上无菌落生长；经3d培养后，含50g/L NaCl的培养基上出现明显菌落，含70g/L NaCl的培养
基上有微量菌落生长；经5d培养后，在含0g/L、30g/L、50g/L和70g/L NaCl的培养基上均有
菌落生长，含100g/L NaCl的培养基上未观察到菌落生长。证实Pannonibacter
phragmitetus F1具有一定的耐盐性，但盐度过高会导致其生长速度缓慢，甚至抑制生长。
[0052] 表2 Pannonibacter phragmitetus F1在不同盐度梯度培养基中生长情况
[0053]
[0054] ++：培养基表面出现明显菌落，说明Pannonibacter phragmitetus F1正常生长；
[0055] +：培养基表面出现微量菌落，说明Pannonibacter phragmitetus F1存在生长现象，但生长速度缓慢；
[0056] ‑：培养基表面未出现菌落，说明Pannonibacter phragmitetus F1未生长。
[0057] 具体实施方式四：本实施方式栖植物潘隆尼亚碱湖杆菌Pannonibacter phragmitetus F1反硝化性能测定，具体如下：
[0058] 制不同盐度梯度的反硝化培养基，即NaCl浓度分别为0g/L、10g/L、30g/L、50g/L、70g/L和100g/L；以5％接种量转移至已灭菌的各盐度培养基中，密封瓶口，于30℃恒温静置
‑ ‑
培养5d；测定培养基中NO2‑N和NO3 ‑N浓度，检测该菌株的反硝化性能。以未接种反硝化细
菌的培养基作为空白对照，每组平行3个。
‑ ‑
培养5d；测定培养基中NO2‑N和NO3 ‑N浓度，检测该菌株的反硝化性能。以未接种反硝化细
菌的培养基作为空白对照，每组平行3个。
[0059] 经5d培养后，Pannonibacter phragmitetus F1在各盐度条件下具有一定的NO2‑‑‑ ‑ ‑
N、NO3‑N去除能力，但盐度过高抑制菌株生长，从而降低其对NO2‑N、NO3‑N去除能力。在0～
‑ ‑
10g/L NaCl盐度条件下，Pannonibacter phragmitetus F1具有高效的NO2‑N、NO3‑N去除
能力较高，去除率分别在98％和91％以上。在30～100g/L NaCl盐度条件下，盐度过高抑制
‑ ‑
菌株生长，导致Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑N、NO3‑N去除能力显著降低。
N、NO3‑N去除能力，但盐度过高抑制菌株生长，从而降低其对NO2‑N、NO3‑N去除能力。在0～
‑ ‑
10g/L NaCl盐度条件下，Pannonibacter phragmitetus F1具有高效的NO2‑N、NO3‑N去除
能力较高，去除率分别在98％和91％以上。在30～100g/L NaCl盐度条件下，盐度过高抑制
‑ ‑
菌株生长，导致Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑N、NO3‑N去除能力显著降低。
[0060] 采用以下实施例验证本发明的有益效果：
[0061] 实施例一
[0062] 菌株的培养条件：
[0063] 将在保藏斜管培养基上保存的Pannonibacter phragmitetus F1用接种环刮取2环菌苔，接种入装有200mL已灭菌的反硝化培养基的250mL锥形瓶中，密封瓶口后静置于30
℃恒温培养箱培养5d，获得新鲜的富集菌液，将其作为种子液。实验时，按5％的接种量将种
子液接种于反硝化培养基或是废水中。
℃恒温培养箱培养5d，获得新鲜的富集菌液，将其作为种子液。实验时，按5％的接种量将种
子液接种于反硝化培养基或是废水中。
[0064] 菌株的反硝化性能实验：
[0065] 对Pannonibacter phragmitetus F1进行富集培养，密封瓶口，于30℃恒温静置培养，待培养基出现浑浊并产生气体后作为种子液；以5％接种量接种于装有200mL已灭菌的
反硝化培养基装入250mL锥形瓶中，置于30℃恒温密封静置培养5d；定时取定量的培养液，
‑ ‑
测定培养液中NO2‑N和NO3 ‑N，检测该菌株的反硝化性能。以未接种反硝化细菌的培养基作
‑ ‑
为空白对照，每组平行3个。结果如图4所示，在培养12h后，反硝化培养基中的NO3‑N和NO3 ‑
‑
N浓度明显升高，随后逐渐下降；在培养48h后，Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑N、
‑ ‑
NO3 ‑N的去除率分别为50.79％和37.76％；在培养96h后，培养液中NO3 ‑N浓度由最初的
‑
212.33±5.95mg/L降至9.67±1.03mg/L，此时NO3‑N的去除率达到最大值，为95.45％；在培
‑
养120h后，培养液中NO2 ‑N浓度由最初的579.50±23.13mg/L降至7.17±0.62mg/L，此时
‑
NO2‑N的去除率达到最大值，为98.76％。
反硝化培养基装入250mL锥形瓶中，置于30℃恒温密封静置培养5d；定时取定量的培养液，
‑ ‑
测定培养液中NO2‑N和NO3 ‑N，检测该菌株的反硝化性能。以未接种反硝化细菌的培养基作
‑ ‑
为空白对照，每组平行3个。结果如图4所示，在培养12h后，反硝化培养基中的NO3‑N和NO3 ‑
‑
N浓度明显升高，随后逐渐下降；在培养48h后，Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑N、
‑ ‑
NO3 ‑N的去除率分别为50.79％和37.76％；在培养96h后，培养液中NO3 ‑N浓度由最初的
‑
212.33±5.95mg/L降至9.67±1.03mg/L，此时NO3‑N的去除率达到最大值，为95.45％；在培
‑
养120h后，培养液中NO2 ‑N浓度由最初的579.50±23.13mg/L降至7.17±0.62mg/L，此时
‑
NO2‑N的去除率达到最大值，为98.76％。
[0066] 菌株的需氧性测定
[0067] 将已灭菌的装有筛选分离培养基的试管冷却至40℃左右时，用接种针取少量待测菌株菌落，对试管底部作垂直穿刺接种后，马上置于冷水中冷却凝固。待凝固后，将试管直
立放于30℃恒温培养箱中培养5d。以未接种反硝化细菌的培养基作为空白对照，每组平行3
个。经培养5d后观察，Pannonibacter phragmitetus F1在培养基中沿穿刺直线生长，可以
初步判断Pannonibacter phragmitetus F1为兼性厌氧菌。
立放于30℃恒温培养箱中培养5d。以未接种反硝化细菌的培养基作为空白对照，每组平行3
个。经培养5d后观察，Pannonibacter phragmitetus F1在培养基中沿穿刺直线生长，可以
初步判断Pannonibacter phragmitetus F1为兼性厌氧菌。
[0068] 盐度对菌株的反硝化性能的影响测试
[0069] 制不同盐度梯度的反硝化培养基，即NaCl浓度分别为0g/L、10g/L、30g/L、50g/L、70g/L和100g/L。Pannonibacter phragmitetus F1以5％(v/v)接种量转接至已灭菌的各盐
‑ ‑
度培养基中，密封瓶口，于30℃恒温静置培养5d。测定培养液中NO2 ‑N、NO3 ‑N浓度，检测
Pannonibacter phragmitetus F1的反硝化性能。以未接种反硝化细菌的培养基作为空白
‑ ‑
对照，每组平行3个。如图5所示，Pannonibacter phragmitetus F1对NO2 ‑N、NO3‑N的去除
能力受盐度影响显著明显。经5d培养后，含0g/L和10g/L NaCl的反硝化培养液中，
‑ ‑ ‑ ‑
Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑N、NO3‑N的去除能力显著，NO2‑N、NO3‑N去除率分
别在98％和91％以上，说明Pannonibacter phragmitetus F1在含10g/L NaCl条件下正常
‑ ‑
生长，NO2‑N、NO3‑N去除能力不受盐度影响。在含30g/L、50g/L和70g/L NaCl的培养液中，
‑ ‑
Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑N、NO3‑N的去除能力较差，其去除率均在9～35％
‑
范围，说明Pannonibacter phragmitetus F1在含50～70g/L NaCl条件下生长缓慢，NO2‑N、
‑
NO3 ‑N去除能力受盐度影响明显降低。在含100g/L NaCl的培养液中，Pannonibacter
‑ ‑
phragmitetus F1对NO2 ‑N和NO3 ‑N的去除率均在9％左右，说明Pannonibacter
‑ ‑
phragmitetus F1在含100g/L NaCl条件下生长受到抑制，NO2‑N、NO3‑N去除能力严重受到
影响。
‑ ‑
度培养基中，密封瓶口，于30℃恒温静置培养5d。测定培养液中NO2 ‑N、NO3 ‑N浓度，检测
Pannonibacter phragmitetus F1的反硝化性能。以未接种反硝化细菌的培养基作为空白
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对照，每组平行3个。如图5所示，Pannonibacter phragmitetus F1对NO2 ‑N、NO3‑N的去除
能力受盐度影响显著明显。经5d培养后，含0g/L和10g/L NaCl的反硝化培养液中，
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Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑N、NO3‑N的去除能力显著，NO2‑N、NO3‑N去除率分
别在98％和91％以上，说明Pannonibacter phragmitetus F1在含10g/L NaCl条件下正常
‑ ‑
生长，NO2‑N、NO3‑N去除能力不受盐度影响。在含30g/L、50g/L和70g/L NaCl的培养液中，
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Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑N、NO3‑N的去除能力较差，其去除率均在9～35％
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范围，说明Pannonibacter phragmitetus F1在含50～70g/L NaCl条件下生长缓慢，NO2‑N、
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NO3 ‑N去除能力受盐度影响明显降低。在含100g/L NaCl的培养液中，Pannonibacter
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phragmitetus F1对NO2 ‑N和NO3 ‑N的去除率均在9％左右，说明Pannonibacter
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phragmitetus F1在含100g/L NaCl条件下生长受到抑制，NO2‑N、NO3‑N去除能力严重受到
影响。
[0070] 菌株的最佳耐盐脱氮条件测试
[0071] 将200mL已灭菌的含10g/L NaCl反硝化培养基装入250mL锥形瓶中，30℃密封静置培养本发明菌株Pannonibacter phragmitetus F1，分别考察不同pH(3、5、7、9、10、11)
NaNO2初始浓度(0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、2.4g/L、3.2g/L)以及接种量(v/v)(1％、3％、5％、
‑ ‑
7％、10％)条件下Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑N、NO3 ‑N去除能力。结果表明，
在10g/L NaCl盐度条件下，Pannonibacter phragmitetus F1能适应广泛的中性及碱性环
‑
境，在pH为7～11范围内，Pannonibacter phragmitetus F1对NO2 ‑N除率均在99％以上；
‑
Pannonibacter phragmitetus F1在偏碱性环境下对NO3‑N去除率在48～83％范围内，在pH
‑
＝10时，NO3‑N去除率最高，为83.17％。Pannonibacter phragmitetus F1的最佳NaNO2初始
‑ ‑
浓度为0.4～1.6g/L，Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑N、NO3‑N的去除率分别达到
99％和82％以上。Pannonibacter phragmitetus F1的最适接种量为3～7％(v/v)，菌株F2
‑ ‑
对NO2‑N、NO3‑N的去除率分别达到99％和89％以上。
NaNO2初始浓度(0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、2.4g/L、3.2g/L)以及接种量(v/v)(1％、3％、5％、
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7％、10％)条件下Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑N、NO3 ‑N去除能力。结果表明，
在10g/L NaCl盐度条件下，Pannonibacter phragmitetus F1能适应广泛的中性及碱性环
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境，在pH为7～11范围内，Pannonibacter phragmitetus F1对NO2 ‑N除率均在99％以上；
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Pannonibacter phragmitetus F1在偏碱性环境下对NO3‑N去除率在48～83％范围内，在pH
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＝10时，NO3‑N去除率最高，为83.17％。Pannonibacter phragmitetus F1的最佳NaNO2初始
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浓度为0.4～1.6g/L，Pannonibacter phragmitetus F1对NO2‑N、NO3‑N的去除率分别达到
99％和82％以上。Pannonibacter phragmitetus F1的最适接种量为3～7％(v/v)，菌株F2
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对NO2‑N、NO3‑N的去除率分别达到99％和89％以上。