先天性脊柱畸形的诊断标记

摘要

先天性脊柱畸形的诊断标记。本发明公开了用以诊断CVM的生物标记，所述生物标记是MYH3基因突变。本发明经过二代测序发现，CVM患者基因组中MYH3基因c.1400位点由A变成了C，且经过功能验证证明上述突变是CVM的致病突变，因此上述基因突变可以成为诊断CVM的生物标记。

权利要求

1.检测突变位点基因型的试剂在制备诊断先天性脊柱畸形的产品中的应用，其特征在于，所述突变是指人MYH3基因c.1400位发生错义突变，由A变成C；所述试剂包括包含突变位点在内的核酸序列的引物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、或等位基因特异性PCR-HRM方法检测突变位点基因型所需的试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

说明书

先天性脊柱畸形的诊断标记

技术领域

[0001] 本发明属于医学诊断领域，涉及一种先天性脊柱畸形的诊断标记，具体涉及MYH3基因c.1400位突变作为先天性脊柱畸形的诊断标记的应用。

背景技术

[0002] 先天性脊柱畸形(Congenital Vertebral Malformations，CVM)代表一组严重的先天性缺陷，临床可表现为先天性脊柱侧凸(CS)，脊柱后凸，Klippel Feil综合征和其他复杂综合征。脊柱畸形分为三种类型，包括形成障碍(半椎体、蝴蝶椎和楔形椎)，分节不良(椎体融合，阻滞椎和未分节椎体)和混合畸形。CVM患病率约为1/2000。其他器官或系统畸形，如中枢神经缺陷，胃肠道缺陷，泌尿生殖系统缺陷和心血管系统缺陷，也可发生在CVM患者身上。CVM是胚胎发育过程中轴旁中胚层发育异常的结果。据报道，几个基因(TBX6、NOTCH2、DLL39)与CVM有关。申请人之前已经证明TBX6遗传模型可以解释大约10％的CS病例，这些患者具有独特的临床特征，因此定义了新的CS表型(TBX6相关的先天性脊柱侧凸，TACS)。然而，仍有大量CVM患者的病因不明确。

[0003] 胚胎肌球蛋白重链基因(Embryonic myosin heavy chain，MYH3)编码胚胎肌球蛋白的重链。它主要在孕周6至24周表达，在妊娠37周时完全被消除。已知，MYH3是远端关节挛缩综合征(distal arthrogryposis syndrome,DA)的致病基因，远端关节挛缩综合征包括DA1(OMIM：108120)，DA2A(Freeman-Sheldon综合征，OMIM：193700)和DA2B(Sheldon-Hall综合征，OMIM：601680)。最近，MYH3也显示与常染色体显性multiple pterygium综合征(DA8，OMIM：178110)和呈显性或隐性模式的Spondylocarpotarsal synostosis综合征(SCT，OMIM：272460)相关。脊柱畸形是DA8和SCT最常见的临床特征之一。

[0004] 在本申请中，申请人研究了具有致病性MYH3变体的CVM患者的基因型和表型特征以及候选MYH3变体的致病性。

发明内容

[0005] 本发明收集了患有CVM的病人样本进行二代测序，发现一家族中二代成员的MYH3基因c.1400位点存在c.1400A>C突变。经过功能验证发现该突变可导致TBX6基因表达上调。现有技术报道，TBX6基因表达上调是导致CVM发生的一个关键因素，因此根据本研究的结果，可以获的以下结论：MYH3基因c.1400位点突变是CVM的致病突变，可通过检测MYH3基因c.1400位点基因型来实现CVM诊断目的。

[0006] 根据本发明的第一方面，本发明提供了一种用于诊断CVM的生物标记，生物标记是指MYH3基因上的突变。

[0007] 进一步，所述突变是指MYH3基因c.1400位发生错义突变，由A变成C。

[0008] 进一步，所述生物标记来源于含有基因组的组织、细胞或者体液。适合的体液样品可包括血液(包括全血、血浆、血清、或它们的组合)、尿、痰、泪液、脑脊液、淋巴液、唾液、汗液、精液、阴道分泌物等。本领域已知收集体液样品的方法。

[0009] 优选地，所述生物标记来源于血液。

[0010] 根据本发明的第二方面，本发明提供了检测前面所述的突变位点基因型的试剂在制备诊断CVM的产品中的应用。

[0011] 可用于检测突变位点基因型的方法包括但不限于，Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-HRM。

[0012] 进一步，所述试剂包括Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、或等位基因特异性PCR-HRM方法检测突变位点基因型所需的试剂。

[0013] 所述试剂包括特异性扩增前面所述的突变位点在内的核酸序列的引物。

[0014] 根据本发明的第三方面，本发明提供了一种用诊断CVM的产品。所述产品包括检测前面所述的突变位点基因型的试剂。

[0015] 进一步，所述试剂包括Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、或等位基因特异性PCR-HRM方法检测突变位点基因型所需的试剂。

[0016] 进一步，所述试剂包括特异性扩增突变位点在内的核酸序列的引物。

[0017] 在本发明的具体实施例中，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

[0018] 虽然未在说明书中详尽记载哪些具体试剂可用于本发明，但是本领域技术人员应当知道，凡是能够有效检测突变位点基因型的方法中使用到的试剂均能用于本发明以精确的检测出前面所述的突变位点的基因型。

[0019] 本发明所述的产品可以但不限于，试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台等。

[0020] 本发明所述的试剂盒除了可以包括检测前面所述的突变位点基因型的试剂以外，还可以包括DNA提取常用试剂，如苯酚、氯仿、异戊醇或乙醇等。

[0021] 本发明所述的试剂盒除了可以包括检测前面所述的突变位点的试剂以外，还可以包括PCR反应体系试剂，如荧光染料、Tap酶、dNTP。

[0022] 本发明还提供了一种诊断CVM的方法，所述方法包括以下步骤：

[0023] (1)收集含有基因组样品；

[0024] (2)检测样品基因组中前面所述的突变位点的基因型；

[0025] (3)若MYH3基因c.1400位发生错义突变，由A变成C，则判断该受试者患有CVM。

[0026] 本发明提供的生物标记作为诊断CVM的生物标记的优越性在于：突变是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高药物疗效的敏感性和特异性。

[0027] 本发明的优势在于鉴定出可以有效诊断CVM的生物标记，使得临床上实现CVM的精确诊断，降低误诊率。

附图说明

[0028] 图1显示存在MYH3基因c.841G>A突变个体的临床表型特征，其中，A：面部先天性畸形；B：屈曲指；C：脊椎融合和侧凸；

[0029] 图2显示存在MYH3基因c.1400A>C突变个体的临床表型特征；

[0030] 图3显示MYH3基因突变对相关蛋白表达的影响，其中，A、G：免疫印迹图；B、C、D、E、F、H：柱状统计图。

具体实施方式

[0031] 下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围内。

[0032] 通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。

[0033] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0035] 术语解释：

[0036] 本文术语“核酸”，也可称为多核苷酸，是指任意长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或是可以通过DNA或RNA聚合酶掺入到聚合物中的任意底物(substrate)。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在，可以在聚合物的组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进行进一步的修饰，诸如通过与标记组分缀合而修饰。其它类型的修饰包括，例如，“帽”，用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸，中间核苷酸修饰，诸如例如具有不带电的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)的那些和具有带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有悬垂结构部分的那些，所述悬垂结构部分诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化的金属等)的那些，含有烷化剂的那些，具有修饰的连接(例如，α异头核酸等)的那些，以及未修饰形式的多核苷酸。此外，在糖中通常存在的任一羟基可以被取代，例如，被磷酸酯基(phosphonate groups)、磷酸盐基(phosphate groups)取代，由标准的保护基团保护，或被活化以制备与另外的核苷酸的另外的键，或可以缀合到固体支持物上。5′和3′末端OH可以被磷酸化或者用具有1至20个碳原子的胺或有机加帽基团结构部分取代。其它羟基也可以被衍生成标准的保护基团。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式，包括，例如，2′-O-甲基-2′-O-烯丙基，2′-氟-或2′-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构糖，诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物及无碱基核苷类似物，诸如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被备选的连接基团所取代。这些备选连接基团包括，但不限于这样的实施方案：其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、″(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲酰化物(formacetal)”)取代，其中每个R或R′独立地为H或取代的或未取代的烷基(1-20个C)，所述烷基任选含有醚(--O--)键、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中的所有键不必都是相同的。

[0037] 本文术语“引物”是指能够与核酸杂交并且允许互补核酸的聚合(通常通过提供一个游离的3′-OH基团)的单链多核苷酸核酸。

[0038] 本文术语“基因”是指一种DNA序列，其通过其模板或信使RNA编码特定的肽、多肽或蛋白质特有的氨基酸序列。术语“基因”还指编码RNA产物的DNA序列。如本文中参照基因组DNA所用，基因包括插入区、非编码区以及调控区，并且可以包括5′和3′末端。

[0039] 本文术语“扩增”是指产生一个或多个拷贝的参比核酸序列或其互补序列的过程。扩增可以是线性的或指数的(例如，聚合酶链式反应(PCR))。“拷贝”不必意味着相对于模板序列的完美的序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物，如脱氧肌苷，在扩增过程中发生的故意的序列改变(诸如，通过包含可与模板杂交但是不与模板完全互补的序列的引物而引入的序列改变)和/或序列错误。

[0040] 本文术语“诊断”用在本文中是指分子或病理学状态、疾病或病况的鉴定或分类。“诊断”还可以是指特定亚型的分类。

[0041] 实施例1筛选与CVM相关的基因突变

[0042] (1)参与者招募

[0043] 作为系统解析脊柱侧凸及相关合并症(Deciphering Disorders Involving Scoliosis and Comorbidities，http://discostudy.org/)研究的一部分，来自北京协和医院(PUMCH)的105个CVM家族，包括99个三人组和6个家庭以及多个CVM患者参加了这项研究。通过放射成像和收集的包括医疗记录和影像的临床数据确定了确认CVM。每个人签署了知情同意书。北京协和医院伦理委员会批准了这项研究。

[0044] (2)外显子组测序和数据分析

[0045] 所有招募的家族都进行了外显子组测序。从外周血提取DNA，并对所有受试者进行了外显子组测序。从DNA样品制备Illumina配对末端文库并进行外显子组捕获，然后在Illumina HiSeq 4000平台上测序。如前所述，使用内部开发的分析管道(Peking Union Medical College Pipeline，PUMP)调用和过滤变体。

[0046] 在本研究中，从外显子组数据中提取了所有MYH3变异体，并进行了基于家族的遗传分析。

[0047] (3)变体解释和优先顺序

[0048] 对于所有MYH3变体，首先过滤掉常见的多态性(基于外显子聚集联合[ExAC]数据库的次要等位基因频率[MAF]>0.1％)和深内含子变体。在家族中显性或隐性遗传模式的假设下，选择了新生变体，复合杂合变体和纯合变体。

[0049] (4)结果

[0050] 在家族A和B中分别鉴定了两种新生错义变体(c.841G>A和c.1400A>C)。在另一项关于脊柱侧凸患者的ES诊断产量的研究中，这两种变体被列为可能的致病变异。

[0051] 在家族A中，变体(c.841G>A，p.Glu281Lys)位于外显子10(MYH3蛋白的头部结构域)中，并且未在ExAC数据库中报道。SIFT，Polyphen2和MutationTaster预测都是致病性的。GERP评分为5.11，CADD评分为36。先证者表现为胸椎椎体融合(T6-T7)，颈部短而身材矮小，但无肋骨或中枢神经异常。其他畸形包括面部畸形(下睑睑裂，长鼻梁，宽人中，腭裂)和四肢异常(左手手足)(表1和图1)。

[0052] 在B家族中，变体(c.1400A>C，p.Glu467Ala)位于外显子14(MYH3蛋白的头部结构域)中，并且在ExAC数据库中也未报道。SIFT，Polyphen2和MutationTaster预测都是致病性的。GERP评分为4.66，CADD评分为23.7。先证者表现为多椎体融合(T3-T6和T8-T11)和身材矮小，但没有其他明显的异常(表1和图2)。

[0053] 表1 MYH3变体和家族临床特征

[0054]

[0055]

[0056] 实施例2致病基因突变的功能验证

[0057] 为了进一步研究MYH3变体的发病机理，使用MYH3-EGFP融合质粒将变体c.841G>A和c.1400A>C转染到HEK-293T细胞中，通过蛋白质印迹分析转染细胞的MYH3表达。

[0058] 1、pcDNA3.1-MYH3突变-EGFP质粒构建

[0059] 该工作由北京海创科业生物科技公司帮助完成，大致步骤如下：

[0060] (1)分别设计引物扩增MYH3突变序列和EGFP，引物及序列信息如下：

[0061] 扩增MYH3突变序列的引物如下：

[0062] MYH3-A1400C-F:

[0063] 5’-GCAGGCTTTGcAATCTTTGAGTATAACAGCCTGGAGC-3’(SEQ ID NO.1)，

[0064] MYH3-A1400C-R:

[0065] 5’-AAGATTgCAAAGCCTGCAATGTCCAAAACACC-3’(SEQ ID NO.2)。

[0066] 扩增EGFP序列的引物如下：

[0067] EGFP-F:

[0068] 5’-GAGTGAAGAGCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGG-3’(SEQ ID NO.3)，

[0069] EGFP-R:

[0070] 5’-AACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGT-3’(SEQ ID NO.4)。

[0071] (2)PCR条件及体系如下：

[0072] MYH3PCR条件如表2和表3所示。

[0073] 表2 MYH3PCR反应体系

[0074] 试剂 体积10X KOD Buffer 5μl
DNTP 5μl
MgSO4 3μl
KOD-Plus-Neo 1μl
PCS2-MYH3质粒 1μl
MYH3-G841A-F 1.5μl
MYH3-G841A-R 1.5μl
ddH2O 32μl
总计 50μl

[0075] 表3 MYH3PCR反应条件

[0076]

[0077] EGFP PCR条件如表4和表5所示。

[0078] 表4 EGFP PCR反应体系

[0079]

[0080]

[0081] 表5 EGFP PCR反应条件

[0082]

[0083] 按照1％琼脂糖凝胶分别回收上述PCR产物

[0084] (3)NheI/NotI双酶切pcDNA3.1(+)载体

[0085] 酶切体系如6所示。

[0086] 表6酶切体系

[0087]

[0088]

[0089] 37℃酶切0.5h后回收酶切产物。

[0090] (4)重组反应并转化

[0091] 重组体系如表7所示。

[0092] 表7重组体系

[0093]试剂 体积
pcDNA3.1(+)酶切产物 1μl
MYH3 PCR纯化产物 1μl
EGFP PCR纯化产物 1μl
2x重组Buffer 5μl
ddH2O 2μl
总计 10μl

[0094] 混匀后50℃重组反应30min

[0095] 反应结束后立即将重组反应液冰浴5min。

[0096] (5)转化

[0097] 在重组好的产物中加入50μl ToP10感受态细胞，混匀42℃热激60s，冰水浴120s，将转化好的混合物均匀的涂在含有氨苄抗性的LB平板中37℃过夜培养。

[0098] (6)阳性克隆筛选与鉴定

[0099] 挑取单克隆进行PCR鉴定反应，鉴定引物：

[0100] pEGFP-N-5’：5’-TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG-3’(SEQ ID NO.5)，

[0101] MYH3-CX-1R：5’-AGGCAGCCAGGTCCATCCCGAAGTC-3’(SEQ ID NO.6)。

[0102] c.1400A>C阳性克隆测序显示pcDNA3.1-MYH3突变-EGFP质粒构建成功。

[0103] 2、蛋白质印迹分析

[0104] 使用Lipofectamine 3000说明书(Termo-Fisher)将MYH3质粒转染到人胚肾(HEK)293T细胞中。将HEK-293T细胞在6孔板上孵育两天。通过标准方法对全细胞提取物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。使用数字图像扫描仪捕获条带强度，并使用图像J(Wayne Rasband，National Institutes of Health)进行定量。用于蛋白质印迹的一抗：GFP(Solarbio，RG001030)，Phospho-Smad3(Cell Signaling，cs 9520，1：1000)，Smad3(Cell Signaling 
9523，1：1000)，Phospho-Erk p44/42MAPK(细胞信号传导)，cs 9101，1：1000)，Phospho-p38(细胞信号传导，cs 9211，1：1000)，GAPDH(Cell Signaling，cs 2118，1：1000)，TBX6(Abcam，ab38883，1：1000)。每个细胞实验重复三次。将定量条带标准化为管家基因水平(GAPDH)。

[0105] 3、统计

[0106] 使用SPSS Statistics V22.0软件进行统计分析。使用卡方检验，Fisher精确检验和Student's t检验测试定量变量的差异。P≤0.05被认为具有统计学意义。

[0107] 4、结果

[0108] 结果如图3所示，与野生型(WT)相比，突变质粒不影响MYH3的表达。由于致病性MYH3突变可以降低TGF-β/BMP信号通路中的Smad3磷酸化，而TGF-β/BMP信号传导对于非洲爪蟾Tbx6表达的启动和维持是必需的，因此研究了变体c.841G>A和c.1400A>C对TGF-β/BMP信号传导和TBX6表达的影响。野生型MYH3促进了转染的HEK-293T细胞中的Smad3磷酸化。然而，c.841G>A和c.1400A>C变体降低了MYH3的刺激作用(分别为P＝0.001和P＝0.000016)，与野生型相比，这两种变体显著促进了TBX6表达(P＝0.002和P＝0.018)。因此，本研究认定这两种有害的新生错义变体通过上调TBX6表达而引起CVM。

[0109] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。