一种用于早期贲门癌筛查ELISA试剂盒

摘要

本发明属于肿瘤医学技术领域，具体公开了一种用于早期贲门癌筛查ELISA试剂盒，该试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由EYA4、ABL1、CD38、P53、NOTCH1和DLC1组成。进一步地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液和洗涤液。本发明的ELISA试剂盒可以有效检测贲门癌，尤其是早期贲门癌，其检测灵敏度高达92.2%，特异性达到了79.6%，可用于贲门癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状高危人群贲门癌筛查和早期发现。

权利要求

1.肿瘤相关抗原EYA4、ABL1、CD38、P53、NOTCH1和DLC1的组合在制备用于贲门癌筛查的试剂盒中的应用。

2.一种用于早期贲门癌筛查ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由EYA4、ABL1、CD38、P53、NOTCH1和DLC1组成。

3.根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。

4.根据权利要求3所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体带有可检测的标记物。

5.根据权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。

6.根据权利要求3～5任一所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体为RecA蛋白。

7.根据权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清为P53阳性对照血清，所述阴性对照血清为P53阴性对照血清。

8. 根据权利要求7所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述P53阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的贲门癌患者血清，所述P53阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。

9.根据权利要求8所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板。

10.根据权利要求9所述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述自身抗体联合检测ELISA试剂盒的检测对象为人类血清。

说明书

一种用于早期贲门癌筛查ELISA试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种用于早期贲门癌筛查ELISA试剂盒。

背景技术

[0002] 随着社会的发展及生活环境的恶化，贲门癌已经成为严重威胁到人类生命健康安全的一类恶性肿瘤。贲门癌是指贲门解剖部位发生的癌症，国内通常认为其位于食管胃交界处下方2cm内。在我国河南省林州市是中国食管癌高发地区之一，研究发现在食管癌高发地区同时存在贲门癌的高发。这一现象提示在当地的生活环境中，可能存在较强的致癌因素，这些致癌因素长期作用于上消化道黏膜，通过一些相似的机制，既导致了食管癌高发，也导致了贲门癌的高发。

[0003] 传统上，“高发区、40岁以上、男性、吸烟、饮酒、家族史阳性的无症状人群”被笼统界定为“食管癌高危或高风险人群”，同时也是贲门癌早期筛查主要对象。目前,内镜检查和粘膜活检、组织病理学检查,特别是对高发区无症状居民普查和随访,仍然是发现早期贲门癌和癌前病变患者最有效的手段。但随着筛查范围扩大，这些方法暴露出一些问题，制约筛查进一步推广。如内镜筛查检出率和现患率、被检者的依从性、内镜筛查技术及组织病理诊断水平都有密切关系。现有技术中缺乏有效对高危人群预警和早期诊断的生物学指标与方法，这是造成临床上贲门癌患者就诊时间过晚,死亡率高的主要原因。

[0004] 贲门癌的发生发展是一个多因素、多阶段、缓慢的发展过程,郑州大学第一附属医院王立东教授领衔的研究团队在实验室研究和随访过程中发现，经内镜活检确定为贲门癌前病变的患者，这类人群的消化道黏膜可由不典型增生(癌前病变)再进一步转化为癌；但是也有部分人群可在进展到某一阶段时停止，不再向恶性进一步发展，甚至可从癌前病变转为正常上皮组织，这一现象提示贲门癌前病变具有双向发展的特性。同时贲门癌在发病过程中也存在有癌基因的激活和抑癌基因的失活,这些分子生物学的变化均促进了癌细胞的发生和发展。

[0005] 近年来的研究发现，癌细胞在形成和发展过程中会合成并释放出一组独特的自分泌性抗原,即肿瘤相关抗原(Tumor-associated Antigen,TAA)。这些TAA可在正常组织中产生，但在肿瘤细胞上表达明显增高。其中一些TAA已经应用于临床辅助诊断，如甲胎蛋白已作为肝癌诊断的一项生物学指标、癌胚抗原(CEA)已作为早期诊断消化系统肿瘤特异性标志物。然而尚无贲门癌特异相关抗原试剂盒应用于临床早期诊断。

[0006] 本研究团队在前期利用全基因组关联分析、全基因组测序和全基因组外显子测序等技术建立的基因组学数据库的基础上，应用自身抗体芯片技术筛选出6种TAA，这6种TAA分别为EYA4、ABL1、CD38、P53、NOTCH1、DLC1，而且这些TAA的自身抗体均与早期贲门癌和癌前病变有关。多个肿瘤相关抗原联合检测自身抗体的变化有利于对贲门癌无症状高危人群起到一定的预警作用。然而，针对贲门癌早期诊断的多种自身抗体联合检测方法以及相应试剂盒的应用还比较少见。因此，本研究提出一种可用于早期贲门癌诊断的ELISA试剂盒，可有效检测贲门癌，尤其是检测早期贲门癌。

发明内容

[0007] 针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种用于早期贲门癌早期筛查的ELISA试剂盒。

[0008] 为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

[0009] 肿瘤相关抗原EYA4、ABL1、CD38、P53、NOTCH1和DLC1的组合在制备用于贲门癌筛查的试剂盒中的应用。

[0010] 一种用于早期贲门癌筛查ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由EYA4、ABL1、CD38、P53、NOTCH1和DLC1组成。

[0011] 根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述ELISA试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。更加优选地，所述样品稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述第二抗体稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B组成，所述显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3,5,5’-四甲基联苯胺)，所述显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；所述终止液为2mol/L的硫酸；所述洗涤液为含0.05％吐温-20的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液(pH7.4)。

[0012] 根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体带有可检测的标记物。

[0013] 根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述标记物为辣根过氧化物酶。

[0014] 根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体为RecA蛋白。

[0015] 根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述阳性对照血清为P53阳性对照血清，所述阴性对照血清为P53阴性对照血清。

[0016] 根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述P53阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的贲门癌患者血清，所述P53阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。大量研究已明确表明P53抗原在贲门癌的发生发展过程中起十分重要的调节作用，并且P53抗体在贲门癌患者血清中具有较高的表达。本发明选择P53抗体阳性血清作为阳性对照，P53抗体阴性血清作为阴性对照，同一ELISA试剂盒的其他抗原抗体反应的强弱可以据此作为参照，达到质控的目的。

[0017] 根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述固相载体为酶标板。更加优选地，所述固相载体优选为48孔酶标板(共6行8列)；所述48孔酶标板按照精心设计的布局图(参见图1)包被EYA4、ABL1、CD38、P53、NOTCH1、DLC1这6种肿瘤相关抗原，其中每行包被有一种抗原，每种抗原包被于7个点样孔中。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入本发明ELISA试剂盒的48孔酶标板的一列，可达到同时检测出该血清样品中6种抗TAA抗体表达水平的目的。所述
48孔酶标板上设有空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔，所述空白对照孔中包被不含抗原的包被液，所述阳性对照孔和阴性对照孔中均包被P53抗原。

[0018] 根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述自身抗体联合检测ELISA试剂盒的检测对象为人类血清。

[0019] 与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

[0020] (1)本发明首次将EYA4、ABL1、CD38、P53、NOTCH1和DLC1这6种肿瘤相关抗原作为一个组合，联合检测人血清中上述6种TAA的抗体表达水平，可以有效检测贲门癌，尤其是早期贲门癌，其检测灵敏度高达92.2％(即早期贲门癌患者中应用这6个肿瘤相关抗原进行诊断时被正确的诊断为早期贲门癌的比率为92.2％)，特异性达到了79.6％(即非贲门癌患者用6种肿瘤相关抗原联合检测时，被确定为未患贲门癌者的比率为79.6％)，远高于现有临床内镜筛查贲门癌的检出率，因此，本发明的ELISA试剂盒具有较高的灵敏度和特异度，可用于贲门癌高发区无症状人群的大规模筛查，能够大大提高早期贲门癌的检出率，有利于无症状高危人群筛查和早期发现，从而大大降低了贲门癌患者的死亡率。

[0021] (2)本发明制备的ELISA试剂盒可同时检测血清样品中6种抗体的表达水平，与6种TAA抗体的单独检测相比，6种TAA抗体联合检测，检出成功率高，技术重现性好，耗材少，成本低，操作简单，使用方便、快捷，极大地提高了临床贲门癌的检测效率和诊断效率，能够在普通实验室推广使用。

附图说明

[0022] 图1为本发明ELISA试剂盒中48孔酶标板的抗原包被布局图(其中，抗原名称代表了该孔包被了此抗原，加入的是待测血清，用来检测待测血清中相应抗体的表达水平；“+”代表阳性对照孔，加入的是阳性对照血清；“-”代表阴性对照孔，加入的是阴性对照血清；“空白”代表空白对照孔，该孔加入不含血清的样本稀释液，其它操作均相同，该空白对照用于反应实验过程中的背景值)。

[0023] 图2为间接酶联免疫吸附实验原理图。

[0024] 图3为6种肿瘤相关抗原的自身抗体在贲门癌组血清中的分布图。

[0025] 图4为6种肿瘤相关抗原的自身抗体在对照组血清中的分布图。

[0026] 图5为6种肿瘤相关抗原的自身抗体在贲门癌组和对照组中的阳性率结果图。

[0027] 图6为6种肿瘤相关抗原的自身抗体检测早期贲门癌的ROC曲线。

具体实施方式

[0028] 以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。

[0029] 下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0030] 本发明根据间接酶联免疫法的原理制备了一种可用于早期贲门癌筛查和诊断的自身抗体联合检测ELISA试剂盒。间接酶联免疫法的原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相抗原-受检抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，然后测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量(参见图2)。

[0031] 实施例1：试剂盒的制备

[0032] 1、实验材料及试剂：

[0033] (1)6种肿瘤相关抗原蛋白(EYA4、ABL1、CD38、P53、NOTCH1、DLC1)，购买于武汉艾美捷科技有限公司；

[0034] (2)48孔酶标板：购自Corning公司；

[0035] (3)包被液：50mM碳酸盐缓冲液，pH＝9.6；

[0036] (4)封闭液：含2％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

[0037] (5)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

[0038] (6)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

[0039] (7)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；

[0040] (8)洗涤液：含0.2％吐温20的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；

[0041] (9)阳性对照血清：P53阳性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的贲门癌患者血清；

[0042] (10)阴性对照血清：P53阴性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清；

[0043] (11)显色液A：0.02％(W/V)TMB，配制：取甲基联苯胺(TMB)0.005g，溶解于25ml去离子水中；

[0044] (12)显色液B：0.006％(W/V)过氧化脲，配制：取柠檬酸4.665g、Na2HPO4 18.40g，充分溶解于400ml去离子水中，加0.75％过氧化氢脲素3.2ml，调整pH值至5.0-5.5，加去离子水定容至终体积500ml，混匀4℃保存；

[0045] (13)终止液：2mol/L的硫酸；

[0046] (14)酶标仪：Star Fax 2100(Awareness.美国)。

[0047] 2.制备抗原包被的酶标板：

[0048] (1)制备6种肿瘤相关抗原溶液：

[0049] 将6种肿瘤相关蛋白分别溶解于包被液中，充分混匀，配制成6种抗原溶液，其中EYA4溶液的浓度为0.125μg/ml，ABL1溶液的浓度为0.25μg/ml，CD38溶液的浓度为1.0μg/ml，NOTCH1溶液的浓度为1.0μg/ml，DLC1溶液的浓度为0.75μg/ml，P53溶液的浓度为0.35μg/ml。

[0050] (2)包被酶标板：

[0051] 将制备好的6种肿瘤相关抗原溶液按照图1所示的布局分别加入到48孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔；阳性对照孔和阴性对照孔中加入p53抗原溶液，空白对照孔加入包被液，37℃恒温培养箱孵育1h，4℃过夜后去除包被液，然后用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。

[0052] (3)封闭：

[0053] 向包被后的48孔酶标板的点样孔中加入封闭液(加样量为300μl/孔)，室温孵育2小时，然后除去封闭液。

[0054] (4)干燥，包装：

[0055] 将封闭处理后的48孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，得到抗原包被的48孔酶标板，4℃保存备用。

[0056] 3.本发明试剂盒的组成如下：

[0057] (1)步骤2制备的抗原包被的48孔酶标板；

[0058] (2)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

[0059] (3)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

[0060] (4)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；

[0061] (5)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为0.02％(W/V)TMB，显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀；

[0062] (6)终止液：2mol/L的硫酸；

[0063] (7)洗涤液：含0.2％吐温20的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；

[0064] (8)阳性对照血清：P53阳性对照血清；

[0065] (9)阴性对照血清：P53阴性对照血清。

[0066] 试剂(2)-(9)分别包装后与抗原包被的48孔酶标板构成试剂盒。

[0067] 实施例2：试剂盒的使用方法

[0068] 1.血清样本孵育：

[0069] 将待检测的血清样本用样品稀释液按1：500的比例进行稀释，然后将稀释后的血清样本加入已包被抗原的48孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。

[0070] 2.酶标二抗孵育：

[0071] 将辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白用第二抗体稀释液按1：40000的比例进行稀释，然后将稀释后的辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白加入48孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育50min，然后弃去点样孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次3min。

[0072] 3.显色及终止反应：

[0073] 将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入48孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃避光反应15min，然后向每个反应孔中再加入50μl终止液，终止反应，于20分钟内用酶标仪器读取OD450光密度值，并用空白对照孔调零。

[0074] 4.结果判定：

[0075] 以阴性对照孔所测OD值得平均数加两个标准差(Mean+2SD)为截断值(cut-off值)，反应孔中OD值读数大于等于截断值的判断为阳性，反应孔中OD值读数小于截断值的判断为阴性。

[0076] 实施例3：本发明试剂盒的诊断价值分析

[0077] 用本发明实施例1所述的试剂盒的检测早期贲门癌患者和正常人的血清样本，以评估和分析本发明试剂盒用于早期贲门癌筛查和诊断的价值。

[0078] 1.样本来源

[0079] 收集来自郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室份血清样本，其中正常人血清230份(对照组)，早期贲门癌患者血清230份(早期贲门癌组)。230例正常人血清来自该实验室合作医院体检中心的健康体检人群，无任何肿瘤相关的证据。230例正常人中，男性123例，女107例，平均年龄为58.7±9.2岁，年龄范围为35-82岁。230份早期贲门癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期+I期)贲门癌患者，均未接受放疗或化疗治疗。230例贲门癌患者中，男性131例，女性99例，平均年龄59.5±6.3岁，年龄范围48-80岁。

[0080] 2.血清制备

[0081] 抽取空腹静脉血5ml至离心管中，室温中静置30分钟，离心(2000转/min)，吸取上层血清分装，每管100μl，-80℃冰箱储存。

[0082] 3.实验方法

[0083] 采用本发明的实施例1制备的试剂盒和实施例2所述的试剂盒的使用方法对230例正常人群血清(对照组)和230例贲门癌患者血清(贲门癌组)中6种TAA自身抗体的含量进行检测。应用MedCalc软件绘制6种肿瘤相关抗原自身抗体在贲门癌组和对照组中的平均表达水平分布图(参见图3和图4)；以实施例2步骤4中的结果判断标准为标准，分别计算贲门癌组和对照组中6种肿瘤相关抗原自身抗体的阳性率(每组中检测出的阳性对象例数除以该组被检测对象总例数即为阳性率)，应用Excel软件绘制6种肿瘤相关抗原的自身抗体在早期贲门癌组和对照组中阳性率的柱形图(参见图5)；应用SPSS22.0软件进行统计学检验，采用两独立样本卡方检验方法比较贲门癌组和对照组抗体阳性率，检验水准α＝0.05，当P＜0.05时，结果具有统计学意义，然后采用筛检试验的评价方法评价自身抗体检测贲门癌的诊断价值(结果参见表1和图6)。

[0084] 4.结果分析

[0085] 图3为6种肿瘤相关抗原自身抗体在230例贲门癌组血清中的分布图，从该图中可以看出，这6种肿瘤相关抗原自身抗体在早期贲门癌组中平均表达水平比较高，平均OD值在0.4附近浮动。图4为6种肿瘤相关抗原自身抗体在230例对照组血清中的分布图，从该图中可以看出，这6种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组中平均表达水平比较低，平均OD值为0.2左右。由图3和图4可知，早期贲门癌组患者血清中6种TAA平均水平均明显高于对照组，提示着6种TAA自身抗体可以用于早期贲门癌的筛查。

[0086] 图5为6种肿瘤相关抗原自身抗体在贲门癌组和对照组中的阳性率结果，由图5可知，早期贲门癌组患者血清中这6种TAA自身抗体阳性率在38％至47％范围内，而在对照组中的阳性率仅为3％-7％。经统计学检验，这6种肿瘤相关抗原自身抗体在贲门癌组中的阳性率均高于对照组。由此证明这6种肿瘤相关抗原自身抗体可以作为早期贲门癌诊断检测指标，用于早期贲门癌的诊断。

[0087] 表1不同肿瘤相关抗原自身抗体组合联合检测结果

[0088]

[0089] 由表1可知，随着抗原组合数目的增加，早期贲门癌诊断的灵敏度也随之增加；当6种肿瘤相关抗原组合时，灵敏度高达92.2％，也就是说贲门癌患者中应用该方法能够正确的诊断为贲门癌的百分比为92.2％；虽然随着抗原数目的增加，检测特异度逐渐降低，但当6种肿瘤相关抗原组合时，其特异度仍然能够达到79.6％，这一结果表明非贲门癌患者采用
6种肿瘤相关抗原联合检测时，被正确的诊断为未患贲门癌的百分比为79.6％；因此，使用EYA4、ABL1、CD38、P53、NOTCH1和DLC1这6种肿瘤相关抗原组合进行早期贲门癌诊断，可以在保证诊断特异度的前提下大幅度的提高诊断的灵敏度。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1，其数值范围是0-1，约登指数越接近于1，其诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。随着抗原数目的增加，约登指数在不断增大且逐渐趋向于1，表明6种肿瘤相关抗原组合用于诊断和筛查早期贲门癌的方法具有较好的诊断价值。因此，采用EYA4、ABL1、CD38、P53、NOTCH1和DLC1这6种肿瘤相关抗原的自身抗原联合检测待测血清中相应自身抗体表达水平的方法，既能保持较高的特异度又能提高诊断的敏感度，对评估待测对象患贲门癌的风险具有很好的诊断和应用价值。

[0090] 由图6可知，随着抗原组合数目的增加，ROC曲线下面积由0.63升至0.85，说明使用这6种肿瘤相关抗原自身抗体联合检测ELISA试剂盒对于早期贲门癌具有较高的判定正确性和诊断价值，进一步证实了该试剂盒可以作为较理想的早期贲门癌的筛查方法和手段。

[0091] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。