一株枯草芽孢杆菌及在番茄匍柄霉叶斑病防治中的应用

摘要

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及在番茄匍柄霉叶斑病防治中的应用。本发明提供了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.16776。本发明提供的枯草芽孢杆菌ZF161是一株番茄土壤根际微生物，对人、畜、农作物安全，对环境友好。该菌株对番茄匍柄霉叶斑病具有强拮抗作用。利用该菌株对番茄匍柄霉叶斑病进行生物防治，是一种高效稳定的番茄匍柄霉叶斑病生物防治方式，其利用了该菌株在番茄植株上易于作用且对番茄匍柄霉叶斑病菌具有强拮抗作用的特点，能更好地满足农业生产中防治番茄匍柄霉叶斑病的要求。

权利要求

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.16776。

2.微生物制剂，其特征在于：所述微生物制剂含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161。

3.菌悬液，其特征在于：所述菌悬液为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161的菌悬液，其中所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161的含量为

1.0×107～1.0×109cfu/mL。

4.根据权利要求3所述的菌悬液，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161的含量为1.0×108cfu/mL。

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161或权利要求2所述的微生物制剂或权利要求3或4所述的菌悬液在如下任一中的应用：(A1)防治番茄匍柄霉叶斑病；

(A2)制备用于防治番茄匍柄霉叶斑病的产品。

6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161或权利要求2所述的微生物制剂或权利要求3或4所述的菌悬液在如下任一中的应用：(B1)抑制番茄匍柄霉叶斑病菌；

(B2)制备用于抑制番茄匍柄霉叶斑病菌的产品。

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161或权利要求2所述的微生物制剂或权利要求3或4所述的菌悬液在如下任一中的应用：(C1)防治由番茄匍柄霉叶斑病菌所致疾病；

(C2)制备用于防治由番茄匍柄霉叶斑病菌所致疾病的产品。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述番茄匍柄霉叶斑病菌为茄匍柄霉(Stemphylium solani Weber)。

9.一种防治番茄匍柄霉叶斑病的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161或权利要求2所述微生物制剂或权利要求3或4所述菌悬液施于番茄植株上。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中是将所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161或所述微生物制剂或所述菌悬液喷施于番茄植株上。

11.权利要求1所述的所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161在制备权利要求2所述的微生物制剂或权利要求3或4所述的菌悬液中的应用。

说明书

一株枯草芽孢杆菌及在番茄匍柄霉叶斑病防治中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物病害生物防治技术领域，特别涉及一株枯草芽孢杆菌及在番茄匍柄霉叶斑病防治中的应用。

背景技术

[0002] 番茄匍柄霉叶斑病可由茄匍柄霉(Stemphylium solani Weber)和番茄匍柄霉(Stemphylium lycopersici(Enjoji)Yamamoto)引起，主要是由茄匍柄霉侵染引起的一种严重的病害，造成番茄叶片、茎蔓和果实大面积坏死，导致番茄减产。目前，针对番茄匍柄霉叶斑病主要采用化学防治方法。然而，由于番茄匍柄霉叶斑病的抗药性以及化学防治对环境污染严重等问题，开展番茄匍柄霉叶斑病的生物防治研究具有重大意义。

[0003] 目前，虽然化学杀菌剂在植物病害防治方面仍占主导地位，但是芽孢杆菌类生防菌剂因其高效、针对性强、无毒无污染等优势逐渐受到重视，是最具发展潜能的新型生防菌株。

发明内容

[0004] 为改进现有防治技术的不足，本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌及其应用，该枯草芽孢杆菌对番茄匍柄霉叶斑病具有显著的拮抗作用。

[0005] 第一方面，本发明要求保护一株枯草芽孢杆菌。

[0006] 本发明所要求保护的枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161，其于2018年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16776。

[0007] 第二方面，本发明要求保护一种微生物制剂。

[0008] 本发明所要求保护的微生物制剂含有所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161。

[0009] 进一步地，所述微生物制剂可为生防制剂。

[0010] 更进一步地，所述生防制剂可由所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161和助剂配制而成。所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161在所述生防制剂中的有效含量可为1.0×107～1.0×109cfu/mL，如1.0×108cfu/mL。

[0011] 第三方面，本发明要求保护一种菌悬液。

[0012] 本发明所要求保护的菌悬液为所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161的7
菌悬液，其中所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161的含量为1.0×10 ～1.0×
109cfu/mL。

[0013] 进一步地，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161的含量为1.0×108cfu/mL。

[0014] 第三方面，本发明要求保护所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161或所述微生物制剂或所述菌悬液在如下任一中的应用：

[0015] (A1)防治番茄匍柄霉叶斑病；

[0016] (A2)制备用于防治番茄匍柄霉叶斑病的产品。

[0017] 第四方面，本发明要求保护所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161或所述微生物制剂或所述菌悬液在如下任一中的应用：

[0018] (B1)抑制番茄匍柄霉叶斑病病原菌；

[0019] (B2)制备用于抑制番茄匍柄霉叶斑病病原菌的产品。

[0020] 第五方面，本发明要求保护所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161或所述微生物制剂或所述菌悬液在如下任一中的应用：

[0021] (C1)防治由番茄匍柄霉叶斑病菌所致疾病；

[0022] (C2)制备用于防治由番茄匍柄霉叶斑病菌所致疾病的产品。

[0023] 在上述第四和第五方面中，所述番茄匍柄霉叶斑病菌为茄匍柄霉(Stemphylium solani Weber)。

[0024] 第六方面，本发明要求保护一种防治番茄匍柄霉叶斑病的方法。

[0025] 本发明所提供的防治番茄匍柄霉叶斑病的方法，可包括如下步骤：将所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161或所述微生物制剂或所述菌悬液施于(如喷施)番茄植株上，使所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161在番茄叶片上定植，进而抑制番茄匍柄霉叶斑病。

[0026] 芽孢代谢相对静止，抗逆能力强，能够长期保存，利于开发为菌剂。所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161的芽孢可以采用如下方法而获得：利用LB培养基，在28℃温度下培养所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161 2天，大量产生枯草芽孢杆菌的芽孢。保存温度为22～28℃，如21～27℃。

[0027] 第七方面，本发明要求保护所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161在制备所述微生物制剂或所述菌悬液中的应用。

[0028] 本发明的有益效果是：

[0029] (1)本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161是一株番茄土壤根际微生物，对人、畜、农作物安全，对环境友好。

[0030] (2)本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161对番茄匍柄霉叶斑病具有强拮抗作用。本发明利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161对番茄匍柄霉叶斑病进行生物防治，是一种高效稳定的番茄匍柄霉叶斑病生物防治方式，其利用了所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161在番茄植株上易于作用且对番茄匍柄霉叶斑病菌具有强拮抗作用的特点，能更好地满足农业生产中防治番茄匍柄霉叶斑病的要求。

[0031] 保藏说明

[0032] 菌株名称：枯草芽孢杆菌

[0033] 拉丁名：Bacillus subtilis

[0034] 参椐的生物材料(株)：ZF161

[0035] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0036] 保藏机构简称：CGMCC

[0037] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

[0038] 保藏日期：2018年11月26日

[0039] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No.16776

附图说明

[0040] 图1为枯草芽孢杆菌ZF161在LB固体培养基上的生长菌落形态。

[0041] 图2为枯草芽孢杆菌ZF161的16S rDNA片段及gyrB基因片段的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1为1417bp(16S rDNA片段)；泳道2为1417bp(16S rDNA片段)；泳道3为991bp(gyrB基因片段)；泳道4为991bp(gyrB基因片段)；泳道M为分子量标准(5000bp)。

[0042] 图3为枯草芽孢杆菌ZF161的16S rDNA系统发育树。

[0043] 图4为枯草芽孢杆菌ZF161的gyrB基因系统发育树。

[0044] 图5为番茄匍柄霉叶斑病菌和枯草芽孢杆菌ZF161平板对峙培养结果。从左到右依次为枯草芽孢杆菌ZF161对病原菌的抑制效果、空白对照和药剂对照(50％异菌脲可湿性粉剂)。

具体实施方式

[0045] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0047] 下述实施例涉及到的各种培养基都是本领域常用的标准培养基，例如：

[0048] LB液体培养基：胰蛋白胨1％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，氯化钠1％(w/v)，pH7.0。

[0049] LB固体培养基(简称LB培养基)是在上述LB液体培养基的基础上添加了琼脂1.5％-2％(w/v)，即为胰蛋白胨1％(w/v)，酵母提取物0.5％(w/v)，氯化钠1％(w/v)，琼脂
1.8％(w/v)，pH7.0。

[0050] 实施例1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161的分离筛选及鉴定[0051] 从北京大兴区多年连续种植番茄的大棚采集的根际土壤分离菌株。挑取单菌落于LB液体培养基中培养，得到菌悬液；用平板对峙法从步骤(1)选取的菌落中筛选出对番茄匍柄霉叶斑病菌(茄匍柄霉(Stemphylium solani Weber))具有抑菌作用的菌株(表1)。最终获得一株菌编号为ZF161的菌株。

[0052] 表1筛选拮抗细菌菌株对茄匍柄霉菌的抑制作用

[0053]处理 浓度 菌落直径(mm) 抑菌率(％)
8
IVF19 10cfu/mL 23.00±0.41 70.51±0.93ab
IVF43 108cfu/mL 31.67±0.47 59.40±1.60d
A-5 108cfu/mL 31.00±2.27 60.26±5.67d
ZF161 108cfu/mL 19.00±1.08 75.64±2.60a
8
18051709-2-1 10cfu/mL 28.67±1.70 43.16±4.27cd
18051709-2-2 108cfu/mL 24.67±0.47 68.38±1.25bc
18051709-2-3 108cfu/mL 27.67±0.94 64.53±2.73bcd
50％异菌脲可湿性粉剂 3g/L 30.33±0.47 61.11±1.57d
空白培养基   78.00±0.41  

[0054] 注：不同小写字母表示在0.05水平上有显著差异。

[0055] 菌株ZF161形态特征：ZF161为革兰氏阳性菌，呈长杆状。

[0056] 菌株ZF161在LB平板上，28℃培养24h，形成菌落呈圆形，乳白色，边缘不整齐，不透明，表面有褶皱。图1为菌株ZF161的菌落形态。

[0057] 菌株ZF161的生理生化特征：水解淀粉，氧化酶阳性。

[0058] 菌株ZF161的16S rDNA的扩增方法为：挑取单菌落，置于装有LB液体培养基的摇菌管中培养后进行DNA提取，以DNA为模板进行PCR扩增。

[0059] PCR扩增体系为20μL：DNA模板1μL，Mix 10μL，上下游引物各1μL，ddH2O补足剩余体积。扩增条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min。

[0060] PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像参见图2所示。经系列分析扩增所得的16S rDNA序列长度为1417bp(SEQ ID No.1)。将所述16S rDNA序列进行测序并进行BLAST比对分析，结果显示所述16S rDNA与Bacillus subtilis的相似度最高，达到了100％。

[0061] 菌株ZF161的gyrB基因的扩增方法为：挑取单菌落，置于装有LB液体培养基的摇菌管中培养后进行DNA提取，以DNA为模板进行PCR扩增。

[0062] PCR扩增体系为20μL：DNA模板1μL，Mix 10μL，上下游引物各1μL，ddH2O补足剩余体积。扩增条件：94℃5min；94℃30s，62℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

[0063] PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像参见图2所示。经系列分析扩增所得的gyrB基因序列长度为991bp(SEQ ID No.2)。将所述gyrB基因序列进行测序并进行BLAST比对分析，结果显示所述gyrB基因与Bacillus subtilis的相似度最高，达到了98％。

[0064] 将所述16S rDNA序列在NCBI数据库整理比对后，构建系统进化树。参见图3所示，本发明的菌株(图3中标记为ZF161)与B.subtilis的进化距离最短，是B.subtilis的近似种。

[0065] 将所述gyrB基因序列在NCBI数据库整理比对后，构建系统进化树。参见图4所示，本发明的菌株(图4中标记为ZF161)与B.subtilis的进化距离最短，是B.subtilis的近似种。

[0066] 结合形态特征和分子生物学鉴定，最终确定本发明的菌株ZF161为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

[0067] 菌株ZF161已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2018年11月26日。保藏号为CGMCC No.16776。菌株名称：枯草芽孢杆菌；拉丁名：Bacillus subtilis；参椐的生物材料(株)：ZF161。

[0068] 实施例2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161菌悬液的制备

[0069] 将纯化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161，单菌落接种在LB液体培养基中，在28℃下180r/min条件下培养2天，大量产生枯草芽孢杆菌的芽孢。所得菌悬液含所述枯草芽孢杆菌的有效含量为107～109cfu/mL。

[0070] 实施例3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161对番茄匍柄霉叶斑病菌的抑制作用的简单鉴定

[0071] 将番茄匍柄霉叶斑病菌(茄匍柄霉(Stemphylium solani Weber)，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所菜病综防组提供)接到PDA平板中央培育24h后，将本发明实施例1的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161菌悬液呈四角状对称接入PDA平板，距离中心2.5cm，设置3个重复及空白对照，28℃下，培养7d后，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。

[0072] 抑制率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌柄直径)]×100％[0073] 结果见表2和图5，在空白培养基下，番茄匍柄霉叶斑病菌生长快速，生长7天的菌落直径为78mm，而加入ZF161菌悬液的PDA培养基上，番茄匍柄霉叶斑病菌生长缓慢，菌落直径为19mm，因此计算抑菌率为75.6％。

[0074] 表2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161对番茄匍柄霉叶斑病菌的抑菌率[0075]

[0076] 注：50％异菌脲可湿性粉剂为对照药剂。不同小写字母表示在0.05水平上有显著差异。

[0077] 实施例4、在番茄离体叶片上测试枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161在番茄匍柄霉叶斑病生物防治中的应用效果

[0078] 测试为离体叶片试验，取45叶番茄叶片，处理、清水对照分别为15叶置于底部含水的保湿盒中。将实施例2中培养得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161菌悬液(约108cfu/mL)通过喷雾法喷到番茄叶片上(喷施标准为植株上是水雾，不会形成液滴流下)，待叶片表面晾干后，再通过喷雾法将番茄匍柄霉叶斑病菌(茄匍柄霉(Stemphylium solani Weber))菌悬液(浓度1×108cfu/ml)接到番茄叶片上。接菌后将保湿盒封上，置于28℃的培养箱中。待清水对照组(以清水替代ZF161菌悬液)叶片充分发病后，统计病情指数，计算防效。

[0079] 病害调查采用番茄匍柄霉叶斑病分级标准：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；3极：病斑面积占整个叶面积的6％～25％；5级：病斑面积占整个叶面积的26％～50％；7级：病斑面积占整个叶面积的51％～75％；9级：病斑面积占整个叶面积的
76％以上。

[0080] 病情指数＝∑(各级值×各级病叶数)/(调查总叶数×最高级值)×100。

[0081] 防效(％)＝(对照组病情指数–处理组病情指数)/对照组病情指数×100。

[0082] 结果如表3所示。利用本发明实施例2培养得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161菌悬液(约108cfu/mL)处理的番茄匍柄霉叶斑病菌，发病率病情指数为30.86，而清水对照下病情指数为94.07，实施例2培养得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161菌悬液(约108cfu/mL)的平均防效为69.83％

[0083] 表3枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161对番茄匍柄霉叶斑病的防效(离体叶片)

[0084]

[0085] 注：50％异菌脲可湿性粉剂为对照药剂。

[0086] 实施例5、在番茄植株上测试枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161在番茄匍柄霉叶斑病生物防治中的应用效果

[0087] 该测试为温室盆栽试验，尽量排除外界干扰条件。温室位于中国农业科学院蔬菜花卉研究所。番茄品种为齐达利，对番茄匍柄霉叶斑病易感。处理和对照分别为30株番茄。当番茄长至5组辅叶，将实施例2中培养得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161菌
8
悬液(约10cfu/mL)通过喷雾法喷到番茄植株上，24h后，再通过喷雾法将番茄匍柄霉叶斑病菌(茄匍柄霉(Stemphylium solani Weber))菌悬液(浓度1×108cfu/ml)接种到番茄植株上。对照为清水。接菌后将番茄苗放入相对湿度95％，温度26～28℃保湿柜中保湿培养
48h，之后转入正常育苗温室培养。待清水对照组(以清水替代ZF161菌悬液)植株充分发病后，统计病情指数，计算防效。

[0088] 病害调查采用番茄匍柄霉叶斑病分级标准同实施例4。

[0089] 病情指数＝∑(各级值×各级病叶数)/(调查总叶数×最高级值)×100。

[0090] 防效(％)＝(对照组病情指数–处理组病情指数)/对照组病情指数×100。

[0091] 结果如表4所示。利用本发明实施例2中培养得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161菌悬液(约108cfu/mL)处理的番茄匍柄霉叶斑病发病率病情指数为16.93，而清水对照下病情指数为45.44，实施例2中培养得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161菌悬液(约108cfu/mL)的平均防效为63.27％

[0092] 表4枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZF161对番茄匍柄霉叶斑病的防效(植株)[0093]

[0094] 注：50％异菌脲可湿性粉剂为对照药剂。不同小写字母表示在0.05水平上有显著差异。

[0095] 本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。