一种抗锌胁迫的PuPLA2基因、PuPLA2蛋白、重组表达载体及其应用

摘要

本发明提供一种抗锌胁迫的PuPLA2基因、PuPLA2蛋白、引物对、重组表达载体及其应用，涉及生物技术领域，本发明所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗锌胁迫的PuPLA2基因是从大青杨中分离得到的。如本发明具体实施例的实验所示，利用本发明提供的PuPLA2基因构建转基因植株，使PuPLA2基因在转基因植株中过表达，从在锌胁迫条件下的转基因植株根系发达、根系长、干重高，地上部分的株高较高。本发明首次在植物中发现了能够提高抗锌胁迫的PLA2基因，可促进根系在锌胁迫条件下生长。

权利要求

1.PuPLA2基因、PuPLA2蛋白或重组表达载体在提高植物抗锌胁迫能力中的应用；

所述PuPLA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述PuPLA2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述重组载体包括PuPLA2基因；所述重组表达载体还包括基础表达载体；

所述植物为大青杨。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用权利要求1所述PuPLA2基因、权利要求

1所述PuPLA2蛋白或权利要求1所述重组表达载体构建转基因植株，使转基因植株的PuPLA2基因过表达。

说明书

一种抗锌胁迫的PuPLA2基因、PuPLA2蛋白、重组表达载体及其

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗锌胁迫的PuPLA2基因、PuPLA2蛋白、引物对、重组表达载体及其应用。

背景技术

[0002] 锌污染是锌和其化合物在土壤中过量所引起的人类生存环境污染。目前，中国的主要污染源是铅、锌矿开采、冶炼、镀锌、机械制造、造纸工业废水、城市生活垃圾、农业肥料水产养殖垃圾等。这些污染源会直接使土壤失去活性和土壤中的微生物作用减弱，使植物生长受到抑制，同时植物体中也富集锌，通过食物链导致食用这种植物的人和动物受害。用含锌污水灌溉农田对农作物，特别是小麦影响更大，这会导致小麦叶片发黄、植株矮小和小麦的出苗率参差不齐。但是在过去几十年的经济快速发展中，人类没有注意到环境保护的重要性，导致生活和工业活动释放出的大量的锌到空气、水和土壤中最终破坏了我们的环境，而污染附近的人类由于长期呼吸锌尘污杂的空气、饮用锌污染的水和食用土地锌污染的农作物，必然会锌中毒，对人体或动物的危害性很严重。

[0003] 土壤中过量的锌被植物吸收后会导致植物的细胞受到破坏，最终导致植物的生长受到限制。植物中最先接触重金属锌的部位是根部，土壤中大量的锌被根部吸收后会导致根部超积累过量的Zn2+，最后导致植物的根系变短变粗，侧根发育受到阻碍，特别是根尖部位的细胞分裂和伸长都受到抑制。当过量Zn2+在地上部分大量积累的时候会导致地上部分其他营养元素不足而导致地上部分生长受阻、叶绿素合成受阻导致叶片黄化，同时光合、呼吸作用降低，植株矮化和生物量下降。最终导致整个植株的生物量下降更严重的化会导致植物死亡。先前的研究中发现在用过量的锌处理蔬菜的时候测得的株高和锌浓度呈现出负相关性。长时间过量锌胁迫植物的时候会导致植物的叶片产生褐色斑点和幼嫩的叶片发黄萎蔫，严重的会导致植物死亡。除此之外，高锌对植物生理生化也有很大的影响。

[0004] PLA2是一个调节植物生长和压力胁迫相关的一个基因。拟南芥中AtPLAIVA抑制突变体通过抑制了生长素生长代谢途径降低了次生根的生长，说明了AtPLAIVA基因在根部的生长过程中扮演着重要的角色。Holk报道PLA酶解产生的游离脂肪酸(FFA)是生长素合成中的第二信使，能够促进根的伸长和细胞分裂。但是PLA基因大多数是在动物中有报道，有关其在植物中的研究少之甚少。

发明内容

[0005] 本发明为了克服现有锌胁迫对植物生长影响的缺陷，提供了一种抗锌胁迫的PuPLA2基因、PuPLA2蛋白、引物对、重组表达载体及其应用，利用PuPLA2基因转基因植物中的过表达，可使锌胁迫下的植株根系发达、根系长度增加、干重增加，并且缓解锌胁迫对株高的影响。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种抗锌胁迫的PuPLA2基因，所述PuPLA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0008] 本发明还提供了一种上述技术方案所述PuPLA2基因编码的PuPLA2蛋白，所述PuPLA2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0009] 本发明还提供了一种重组表达载体，包括前述技术方案所述的抗锌胁迫的PuPLA2基因。

[0010] 优选的，还包括基础表达载体。

[0011] 本发明还提供了前述技术方案所述PuPLA2基因、前述技术方案所述PuPLA2蛋白或上述技术方案所述重组表达载体在提高植物抗锌胁迫能力中的应用。

[0012] 优选的，利用前述技术方案所述PuPLA2基因、前述技术方案所述PuPLA2蛋白或上述技术方案所述重组表达载体构建转基因植株，使转基因植株的PuPLA2基因过表达。

[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果：

[0014] 本发明提供了一种核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗锌胁迫的PuPLA2基因，是从大青杨中分离得到的。如本发明具体实施例的实验所示，利用本发明提供的PuPLA2基因构建过表达载体，使PuPLA2基因在大青杨中过表达，在锌胁迫条件下的转基因植株根系发达、根系长、干重高，地上部分的株高较高。本发明首次在植物中发现了能够提高抗锌胁迫的PLA2基因，有效地提高了转基因植株对高锌胁迫下的耐受性，可促进根系在锌胁迫条件下生长。

附图说明

[0015] 图1为本发明中大青杨PuPLA2基因PCR产物的胶回收电泳图，其中M为DL2000 DNA Marker，1为PCR产物；

[0016] 图2为本发明中大青杨PuPLA2基因构建到pBI12过表达载体的PCR图，其中M为DL2000 DNA Marker，1-5为PuPLA2基因；

[0017] 图3为本发明中PuPLA2基因过表达株系的获得；

[0018] 图4为本发明中PuPLA2基因过表达株系DNA水平上的检测；

[0019] 图5为本发明中PuPLA2基因过表达株系RNA水平定量分析；

[0020] 图6为本发明中PuPLA2基因转基因与野生型大青杨在高锌胁迫下的根部生长观察。

具体实施方式

[0021] 本发明提供了一种抗锌胁迫的PuPLA2基因，所述PuPLA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述PuPLA2基因分离自大青杨中，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列全长序列1257bp。

[0022] 在本发明中，本发明所述PuPLA2基因可以采用以下引物对扩增得到，其中，上游引物的核酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0023] 上游引物PuPLA-3F：gcgagctcatggggaatggaagttcg；

[0024] 下游引物PuPLA-3R：gcggatcctcaaccagaagttctgg。

[0025] 在本发明中，利用上述引物对扩增所述PuPLA2基因的PCR扩增程序优选为：95℃预变性3min；98℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸48s，循环数为35；最后72℃延伸7min。

[0026] 在本发明中，利用上述引物对扩增所述PuPLA2基因的PCR扩增体系优选为：10×KOD Buffer 10.0μL，dNTP Mixture(2.5mM)4.0μL，上下游引物(10μM)各0.6μL，KOD酶0.4μL，DNA样本1.0μL，dd H2O补充至20μL。

[0027] 本发明还提供了一种上述技术方案所述PuPLA2基因编码的PuPLA2蛋白，所述PuPLA2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列共418个碱基。

[0028] 本发明还提供了一种重组表达载体，包括前述技术方案所述的抗锌胁迫的PuPLA2基因。在本发明中，所述重组表达载体优选的还包括基础表达载体。在本发明中，所述基础表达载体优选为pBI121。具体的，将所述PuPLA2基因插入基础表达载体的多克隆位点中，得到重组表达载体。

[0029] 本发明还提供了前述技术方案所述PuPLA2基因、前述技术方案所述PuPLA2蛋白或上述技术方案所述重组表达载体在提高植物抗锌胁迫能力中的应用。

[0030] 在本发明中，优选的利用前述技术方案所述PuPLA2基因、前述技术方案所述PuPLA2蛋白或上述技术方案所述重组表达载体构建转基因植株，使转基因植株的PuPLA2基因过表达。在本发明中，所述转基因植株的品种可以是杨树。

[0031] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0032] 实施例1

[0033] 1大青杨PuPLA2基因的获得如下：

[0034] 1.1目的基因序列的获得

[0035] 在目的基因序列两端设计引物如表1。

[0036] 表1 本发明用于目的基因克隆的引物序列

[0037]

[0038]

[0039] 利用CTAB法提取大青杨(Populus ussurensis kom.)总RNA，并且反转录成cDNA。以此cDNA为模板，使用KOD酶体系进行目的基因的克隆，反应条件为：95℃预变性3min；98℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸48s，循环数为35；最后72℃延伸7min，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR体系如表2。

[0040] 表2 本发明用于目的基因克隆PCR反应体系

[0041]

[0042] 1.2目的基因连接T载体测序

[0043] 对目的片段产物进行胶回收，将回收产物连接到T载体，热激法大肠杆菌转化后进行蓝白斑筛选，将挑取10个白色菌落进行扩大培养PCR检测，提取阳性质粒后进行测序。经检测，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，将该基因片段命名为PuPLA2，由1257bp个碱基组成。其编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。

[0044] 1.3实验结果

[0045] 1.3.1 PuPLA2基因的克隆

[0046] 根据毛果杨中PuPLA2序列，设计引物，在大青杨中进行PCR，实验结果跑电泳后PCR产物条带大小与毛果杨中条带大小相同，PuPLA2基因长度为1257bp，初步说明PCR结果正确，进行下一步实验，将PCR的产物进行纯化，并连接到T载体上，将重组质粒转化大肠杆菌，涂布于加Amp的筛选平板上。将阳性菌落随机挑出几个，用菌液PCR检验如有条带如图1。

[0047] 2.PuPLA2转基因大青杨的获得

[0048] 2.1过表达载体的构建

[0049] 根据毛果杨PLA2的序列设计引物一对引物：

[0050] PuPLA2-2F(SEQ ID NO.3)：5’-gcgagctcatggggaatggaagttcg-3’(划线部位为增加的SacI酶切位点)；

[0051] PuPLA2-2R(SEQ ID NO.4)：5’-gcggatcctcaaccagaagttctgg-3’(划线部位为增加的BamHI酶切位点)。

[0052] 以上一步骤构建的重组质粒为模板进行PCR。

[0053] (1)PCR反应体系，如表3所示：

[0054] 表3 本发明中用于目的基因克隆的PCR反应体系

[0055]

[0056] (2)反应程序

[0057] 94℃预变性5min，95℃30s，60℃30s，72℃2.5min，40个循环，最后72℃延伸7min。之后双酶切、连接到pBI21-GFP载体，并转入大肠杆菌。构建完成测序成功的菌液提取质粒一起用液氮法转化农杆菌EHA105用Kan筛选，分别用引物PCR检测提取质粒测序，将构建成功的菌液用于转基因备用。

[0058] 表3 本发明用于载体构建的PCR反应体系

[0059]

[0060]

[0061] 2.2农杆菌介导的大青杨转基因株系的获得

[0062] (1)分别将构建好的过表达载体pBI121-PuPLA2-GFP转化到EHA105农杆菌细胞中，28℃培养2天。挑取单克隆农杆菌到5ml 50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB液体培养基中，28℃
180rpm摇30mL过夜。

[0063] (2)选取高度在7-9cm继代培养大约一个月健康的的大青杨苗，从上往下第3和4片叶子取下作为原材料，尽可能将叶片的叶柄处完整的剪下，用镊子夹着叶尖处放入WPM分化液体培养基中备用(放在液体中的时间不要超过1h，不要用镊子碰到叶柄处)。

[0064] (3)当农杆菌的OD600值为0.7-1.0时候，在无菌操作台中将菌液分装之后在4000rpm室温离心5min。用等体积的WPM分化液体培养基重悬菌体备用。从WPM液体分化培养基中将叶片轻轻取出几片放在平板中(平板中需提前倒入一些WPM液体分化培养基，防止叶片变干)，用刀轻轻切断叶柄的头部，留下大约0.5-1.5cm的叶柄。注意：保证伤口平整，下刀要利落，快准狠。同样的方式将两侧用刀切开成三角形，叶脉轻划几下立马放入重悬的菌液中浸泡20-30min(中间摇晃几次)，侵染后用灭菌的吸水纸将叶片表面的菌液吸的半干，放入WPM分化固体培养基中共培养两天。

[0065] (4)脱菌，两天后用300mL的大瓶装100mL的无菌WPM分化液体培养基洗3次，每次洗3min期间重新换瓶换水，之后用300mL的大瓶装100mL的加头孢的WPM分化液体培养基(头孢-1
终终浓度200mg L )洗8次每次6min，期间重新换瓶换水，中间需要注意的是洗的时候需要用水平转圈摇晃，用手慢速摇，尽量不要伤害叶片但是速度也不能太小会洗不干净。完毕后用灭菌吸水纸将叶片表面的水吸的半干，放入WPM固体分化培养基中(终浓度200mg L-1头孢+50mg L-1Kan抗生素)进行暗培养。刚开始7d换一次培养基，换完三次后可间隔15d换一次培养基。

[0066] (5)等到叶柄处膨大长出愈伤，继续暗培养，出芽的时候可以放入光照下进行培养。将来源于同一块愈伤组织的植株视为一个独立转化系。长成植株以后换成1/2MS生根培养基(终浓度200mg L-1头孢+4.0mg L-1潮霉素抗生素)进行生根筛选，然后在DNA和RNA水平上进行转基因检测。

[0067] 2.3转基因大青杨的PCR检测

[0068] 分别以野生型(WT)和过表达杨树为材料，CTAB法提取大青杨基因组DNA。以pBI121-GFP为阳性对照，以WT的总DNA为阴性对照，对筛选的过表达植株进行PCR检测。检测用引物如下：

[0069] PuPLA2-3F：5'-TGGGGAATGGAAGTTCGAGTG-3'(SEQ ID NO.3)；

[0070] PuPLA2-3R：5'-TCTCGTTGGGGTCTTTGCTC-3'(SEQ ID NO.4)。

[0071] 以转基因和野生型大青杨的cDNA为模板，PuACTIN基因为内参，进行各株系表达量分析。

[0072] 2.4结果与分析

[0073] 2.4.1 PuPLA2基因的载体构建

[0074] 将PuPLA2基因测序正确的菌落提取质粒。经过双酶切之后，PCR产物连接到pBI121-GFP载体上面，转入大肠杆菌中进行PCR检测。送去测序，序列正确后提取质粒转入农杆菌EHA105中，挑单克隆进行PCR检测，将有条带的菌液提取质粒(如图2)送测序，将序列正确的菌液储存-80℃用于后续转基因。

[0075] 2.4.2 PuPLA2基因转基因株系的获得

[0076] 将PuPLA2重组质粒的农杆菌转化到生长状态良好继代培养三周的野生型大青杨。约40d后，大青杨的叶柄处伤口逐渐出现抗性愈伤，将抗性愈伤继续置于WPM分化筛选培养基上继续培养，待各个转基因株系刚分化出芽时转入1/2WPM分化筛选培养基。一个月后转入1/10WPM分化筛选培养基，等到苗长到3-4片叶子时放入1/2MS生根培养，获得过表达转基因植株(图3)。

[0077] 2.4.3 PuPLA2转基因大青杨的的分子检测

[0078] 在PuPLA2过表达转基因株系中挑选植株提取DNA和RNA，分别在基因组水平和转录水平上对转基因进行检测。DNA水平上PCR，片段长度是PuPLA2基因加上GFP基因的长度是在1899bp。

[0079] 提取移栽的PuPLA2过表达株系PLA2-OE2和PLA2-OE3的RNA反转录成cDNA，进行PuPLA2基因的表达量分析，结果见图5。由图可见，这两个过表达株系的PuPLA2基因的表达量均高于野生型对照。

[0080] 3.转基因大青杨在高锌胁迫下的表型观察

[0081] 将获得的PuPLA2过表达和抑制表达转基因株系扩繁，将生长状态一致的野生型、PuPLA2过表达和抑制表达大青杨转基因株系在正常培养基中生长一周之后进行高锌胁迫(1.2mM ZnSO4)两周，观察表型。

[0082] 将生长一致继代培养一周的野生型、PuHSFA4a过表达和抑制表达大青杨组培苗进行1.2mM ZnSO4胁迫两周。测其整个根部的鲜重和株高，每株系进行3次独立的实验，并且每次实验进行生物学重复30次。

[0083] 3.5结果与分析

[0084] 转基因大青杨的抗锌能力鉴定

[0085] 对于PuPLA2基因功能的研究，将继代培养一周生长状态一致的PuPLA2过表达抑制表达转基因株系和野生型大青杨组培苗进行各种非生物胁迫：1.2mM ZnSO4胁迫两周，将所有的PuPLA2过表达株系都进行了这些胁迫，采取了有表型而且表达量最高的两个株系展现出来如图(图6)：未经胁迫处理条件下，在PuPLA2转基因株系和野生型大青杨在地上部分的生长状态差别不显著。而在根部的生长方面PuPLA2转基因株系生长的比WT好。在高锌胁迫下，转基因和WT的生长状态都受到抑制，但是PuPLA2过表达转基因株系(PLA2-OE2和PLA2-OE3)根系的生长比野生型根系发达，根长比较长，干重比较大同时PLA2-OE2和PLA2-OE2的地上部分株高明显高于WT(如图6)。结果表明：在PuPLA2过表达后影响大青杨根部的生长，会促进根的生长。

[0086] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。