一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法

摘要

本发明公开了一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，包括以下步骤：外植体的获取、农杆菌的活化、农杆菌侵染与共培养和诱导芽分化及生根。本发明以卷丹百合无菌小鳞片2~3mm薄层切片为转化材料，通过培养基改良和农杆菌菌液浓度及侵染时间的优化，建立了卷丹百合的高效遗传转化体系。卷丹百合瞬时转化效率为80%以上，稳定转化率为25.00%以上，转化效率高、不易染菌、不易产生嵌合体。本发明解决了以无菌小鳞片为外植体或单纯利用tTCL技术，获得卷丹遗传转化效率低的问题；同时克服了以卷丹愈伤组织为转化受体，由于愈伤组织对农杆菌过于敏感而最终无法获得转基因植株的缺陷，对农杆菌敏感型百合的遗传转化体系构建具有重要的指导意义和借鉴价值。

权利要求

1.一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将农杆菌在YEB固体培养基上划线后，放在26～30℃的温度条件下进行暗培养36 48 ~h后，挑取单菌落接入YEB液体培养基中，并于25～30℃，180 250rpm振荡培养24 36h后，再~ ~按体积比1:100加入YEB液体培养基活化，继续振荡培养约12h，至农杆菌菌液浓度OD600值介于0.6~0.8后，离心收集菌体并用改良MS重悬液重悬稀释至OD600值为0.4，得到活化好的农杆菌菌液，备用；

2）取无菌卷丹百合鳞茎的中层小鳞片，然后用解剖刀将所述中层小鳞片横切成2 3 mm~的薄层切片，作为外植体；

3）将步骤2）所述薄层切片放入步骤1）活化好的农杆菌菌液中浸染10～15min，使所述薄层切片与农杆菌充分接触后，并用无菌滤纸吸干薄层切片表面多余的菌液后， 再转入改良MS共培养基中，在18～24℃的暗培养条件下培养3～4d，然后将其放入芽分化培养基中，每15d继代一次，待不定芽长至2 3cm后，再将其转入生根诱导培养基中诱导生根；

~

所述改良MS重悬液培养基为MS培养基-（KH2PO4、NH4NO3、KNO3和CaCl2) + AS 100 μmol·L-1；

所述改良MS共培养基为MS培养基-（KH2PO4、NH4NO3、KNO3和CaCl2)+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+AS 100 μmol·L-1；

所述芽分化培养基为MS培养基+100 mg·L-1 Vc +6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+Kan 100 mg·L-1+Hyg 75 mg·L-1+Cef 400 600 mg·L-1+6 8 g/L琼脂+20 30 g/L蔗糖；

~ ~ ~

培养温度为23±1 ℃、光照强度为3000 lx、光照时间16 h/8 h；

所述生根诱导培养基为MS培养基+ Kan 100 mg·L-1+Hyg 75 mg·L-1+Cef 400 600 ~mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1+6 8 g/L琼脂+20 30 g/L蔗糖；培养温度为23±1 ℃、光照强度~ ~为3000 lx、光照时间16 h/8 h。

2.根据权利要求1所述构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，其特征在于，所述浸染时农杆菌菌液的OD600值为0.4，侵染时间为15 min。

说明书

一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法

技术领域

[0001] 本发明属于百合遗传育种技术领域，具体涉及一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法。

背景技术

[0002] 卷丹(Lilium lancifolium Thunb.)属亚洲系百合，其植株挺立，花型奇特，色橙红且着有黑色斑点，因此又名虎皮百合，斑百合。卷丹百合可食用，也可药用，其鳞茎洁白肥大，富含蛋白质、氨基酸、淀粉、膳食纤维、生物碱和矿物质等多种营养元素，长期食用有降血糖、清肺止咳和清心安神等功效，因此被加工为百合粉、百合干、百合罐头等在市场上进行售卖。卷丹百合生长势强健、适应性强，可抗病毒和镰刀菌，不仅可应用于园林美化环境，也是盆栽的良好材料。同时，卷丹栽培历史悠久，是一种非常少见的三倍体野生百合，在我国各省份均有种植，日本、朝鲜半岛等区域亦有分布。在卷丹百合主产区，主要采用无性繁殖方式，常因病毒聚集而引起种性退化和品质下降，影响了卷丹百合产业的良性发展。因此，培育具有抗病抗逆能力的卷丹百合有着重要的科学意义。卷丹百合为自然存在的3倍体，其花粉通常不育。过去，百合的品种改良主要通过传统育种方法，随着现代分子生物学的发展，利用转基因技术不仅可以克服传统育种中的自交不亲和性，而且通过定向修饰目的性状，缩短了育种周期，然而目前卷丹百合的遗传转化方法尚不清楚。

[0003] 在百合的遗传转化中，常见的受体材料有鳞片、愈伤组织、无菌小鳞片、叶片等。选用室外生长的百合鳞茎的鳞片作为受体的优点是可直接进行侵染，缩短了实验时间，但其弊端是污染率偏高。愈伤组织一般通过鳞片、花丝或花梗等诱导获得，其优点是转化效率高和易扩繁，但其弊端是在分化过程中易出现嵌合体。无菌小鳞茎一般通过直接分化获得，其不定芽分化率高，在再生过程中不易产生嵌合体，但其转化效率低。

[0004] 植物细胞薄层培养技术(thin cell layers，TCL)起源并迅速发展，目前已成功应用于观赏植物的组培快繁中。TCL系统原意是从外植体上撕下厚3～6层细胞(包括表皮细胞、形成层细胞及薄壁细胞)，如今薄层培养也指将外植体横切为厚约1～5mm薄片的培养，即tTCL(transverse TCL)。其对植物生长发育调控机制与分子机制等研究有深远意义。迄今已成功用于烟草、水稻、龙胆、菊花、兰花和月季等植物中，发明专利CN201310469178.6公开以鳞片和顶芽为外植体，且采用tTCL的切割培养方式实现了兰州百合的遗传转化，相比传统块状接种方式，在诱导时间上缩短4～5天，诱导系数提高14～17倍，但可能是由于卷丹百合基因型及其对农杆菌的敏感性的限制，采用上述方法得到卷丹百合的转化体的效率低或很难得到转化体。因此，构建适用于卷丹百合的高效遗传转化体系，为后期卷丹百合分子育种和品种改良提供新的理论依据。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供了一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，解决现有的百合农杆菌转化方法存在转化效率低、易染菌、易产生嵌合体的问题，尤其对于一部分愈伤组织农杆菌敏感型的百合的高效遗传转化体系构建提供技术支撑。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，包括以下步骤：

[0007] 1)将农杆菌在YEB固体培养基上划线后，放在26～30℃的温度条件下进行暗培养36～48h后，挑取单菌落接入YEB液体培养基中，并于25～30℃，180～250rpm振荡培养24～
36h后，再按体积比1:100加入YEB液体培养基活化，继续振荡培养约12h，至农杆菌菌液浓度OD600值介于0.6～0.8后，离心收集菌体并用改良MS重悬液重悬稀释至OD600值介于0.2～
0.4，得到活化好的农杆菌菌液，备用；

[0008] 2)取无菌卷丹百合鳞茎的中层小鳞片，然后用解剖刀将所述中层小鳞片横切成2～3mm的薄层切片，作为外植体；

[0009] 3)将步骤2)所述薄层切片放入步骤1)活化好的农杆菌菌液中浸染5～15min，使所述薄层切片与农杆菌充分接触后，并用无菌滤纸吸干薄层切片表面多余的菌液后，再转入改良MS共培养基中，在18～24℃的暗培养条件下培养3～4d，然后将其放入芽分化培养基中，每15d继代一次，待不定芽长至2～3cm后，再将其转入生根诱导培养基中诱导生根。

[0010] 共培养时间太长，植物的正常生长受到农杆菌产生的有害物质抑制；时间太短，农杆菌对植物细胞相互作用不充分，共培养3～4d最佳。

[0011] 作为优选的，所述改良MS重悬液培养基为MS培养基-(KH2PO4、NH4NO3、KNO3和CaCl2)+AS 100μmol·L-1；所述改良MS共培养基为MS培养基-(KH2PO4、NH4NO3、KNO3和CaCl2)+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1+AS 100μmol·L-1。MS培养基中KH2PO4、NH4NO3、KNO3和CaCl2对农杆菌有一定的抑制作用，这样，以薄层切片为外植体，不仅有利于农杆菌对外植体的侵染，同时，由于无菌小鳞片薄层切片细胞不经过脱分化过程，不容易对农杆菌的增殖而发生细胞死亡，从而提高了卷丹百合的转化效率。相比卷丹百合愈伤组织细胞为脱分化的薄壁细胞，容易表现出对农杆菌增殖的敏感性而发生死亡。

[0012] 作为优选的，所述芽分化培养基为MS培养基+100mg·L-1Vc+6-BA 1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+Kan 100mg·L-1+Hyg 75mg·L-1+Cef400～600mg·L-1+6～8g/L琼脂+20～30g/L蔗糖；培养温度为23±1℃、光照强度为3000lx、光照时间16h/8h。Vc是强的还原剂，可以有效的防止薄层切片的伤口发生褐化，同时保护卷丹百合细胞不受农杆菌侵害而发生致死，并能有效促进芽的增殖分化，从而提高了卷丹百合的转化效率。

[0013] 作为优选的，所述生根诱导培养基为MS培养基+Kan 100mg·L-1+Hyg 75mg·L-1+Cef400～600mg·L-1+NAA 2.0mg·L-1+6～8g/L琼脂+20～30g/L蔗糖；培养温度为23±1℃、光照强度为3000lx、光照时间16h/8h。

[0014] 作为优选的，所述侵染时农杆菌菌液的OD600值为0.4，侵染时间为15min。这是由于在农杆菌侵染阶段，侵染浓度(OD600)和时间与受体材料对农杆菌的敏感性、农杆菌的侵染能力以及后期对农杆菌繁殖的控制息息相关。因此，受体材料和外植体不同其具有显著的差异性。本发明侵染时间太短，OD600值过低，农杆菌对受体材料作用不充分，导致转化效果差，达不到试验目的；侵染时间太长，OD600值过高，受体材料易受农杆菌毒害，增加污染率，同时易出现褐化死亡现象。

[0015] 相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

[0016] 1、本发明以卷丹百合无菌小鳞片2～3mm薄层切片为转化材料，选择去除部分无机盐的改良MS悬浮液、改良MS共培养基和复配有Vc的芽分化培养基，通过优化农杆菌菌液浓度和侵染时间，建立了以卷丹百合无菌薄层切片为外植体的高效遗传转化体系。本发明为今后卷丹百合的遗传改良提供重要的技术保障，为提高卷丹百合的单产产量和产品品质，以及对其它百合的新品种培育具有重要的指导意义和借鉴价值。

[0017] 2、本发明首次建立了以卷丹百合无菌小鳞片2-3mm薄层切片为外植体的组培再生体系。首先通过抗生素敏感性测试，获得了适合卷丹百合遗传转化和抗性筛选的适宜抗生素及其对应浓度，为卷丹百合转基因方法的建立奠定技术基础。通过Vc与改良培养基的协同作用实现卷丹百合瞬时转化效率为81％以上，稳定转化率为25.00％以上，转化效率高、不易染菌、不易产生嵌合体，解决了以无菌小鳞片为外植体或单纯利用tTCL(薄层切片)技术，获得卷丹遗传转化效率低的问题；克服了卷丹百合遗传转化时，以愈伤组织为转化受体，由于愈伤组织对农杆菌过于敏感而最终无法获得转基因植株的缺陷，为一部分农杆菌敏感型百合如‘Casa Blanca’和‘Red Ruby’的高效遗传转化体系建立，提供了新思路和途径。

附图说明

[0018] 图1为pLGNe质粒图谱示意图；

[0019] 图2为卷丹百合转化植株的获得过程；

[0020] 1图为刚接种的薄层切片；2图为20d后有嫩绿色不定芽出现；3图为35d左右出现大量丛生芽；4图为65d左右丛生芽基部开始膨大；5图为生根培养；

[0021] 图3为薄层切片瞬时转化的GUS染色对比图；

[0022] 从左到右依次是转基因卷丹百合和野生型卷丹百合；

[0023] 图4为转化组培苗的GUS染色对比图；

[0024] 从左到右依次是转基因卷丹百合和野生型卷丹百合。

具体实施方式

[0025] 下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。实施例中所述原料如无特殊说明，即为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。以下实施例所用农杆菌菌种为EHA105为含GUS报告基因的质粒pLGNe(图1)。

[0026] 本发明所涉及的培养基：

[0027] MS培养基组分：每升培养基含NH4NO31650mg，KNO31900mg，CaCl2·2H2O 440mg，MgSO4·7H2O 370mg，KH2PO4170mg，KI 0.83mg，H2BO36.2mg，MnSO4·4H2022.3mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2MoO4·5H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，FeSO4·7H2O 
27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，肌醇100mg，烟酸0.5mg，甘氨酸2mg，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg，盐酸硫胺素(维生素B1)0.4mg。

[0028] YEB培养基组分：牛肉浸膏5.0g·L-1+酵母粉1.0g·L-1+蛋白胨5.0g·L-1+蔗糖-1 -1 -1 -15.0g·L +MgSO40.493g·L +Kan 50mg·L +Rif40mg·L ，pH＝7.0(固体培养基添加琼脂
6g·L-1)

[0029] MS重悬液：MS+AS 100μmol·L-1

[0030] 改良MS重悬液：MS-(KH2PO4，NH4NO3，KNO3和CaCl2)+AS 100μmol·L-1[0031] MS共培养基：MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1+AS 100μmol·L-1[0032] 改良MS共培养基：MS-(KH2PO4，NH4NO3，KNO3和CaCl2)+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1+AS 100μmol·L-1

[0033] 一、以薄层切片为外植体的卷丹百合再生体系构建

[0034] 1.1芽分化培养基的筛选

[0035] 取卷丹百合无菌小鳞片，用解剖刀将其横切成2～3mm的薄层切片，然后将薄层切-1片放入不同的芽分化培养基A1～A6：以MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA(0.5mg·L 、
1.0mg·L-1、1.5mg·L-1)和NAA(0.2mg·L-1、0.5mg·L-1)中培养，切片接种13-15d后，表面出现小突起，20-25d后，有嫩绿色的不定芽出现，40d后统计试验结果。结果如表1所示。

[0036] 表1

[0037]

[0038] 从表1可以看出，薄层切片在各个处理培养基中均发生明显褐化，其平均褐化率为31.25％。培养基A3对切片的诱导率最低，只有55.00％，平均每接种鳞片芽数为2.43；培养-1 -1
基A6(MS+6-BA 1.5mg·L +NAA 0.5mg·L )为最佳芽分化培养基，诱导率达75.00％，平均每接种鳞片不定芽数达4.88。进一步分析发现，当6-BA浓度增高(>0.5mg·L-1)时，0.5mg·L-1NAA更有利于不定芽的诱导形成。

[0039] 1.2生根培养基的筛选

[0040] 将步骤1.1得到的不定芽接种于6种不同激素配比的诱导培养基B1～B6：以MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA(0、0.5、1.0mg·L-1)和NAA(1.0、2.0mg·L-1))中诱导生根，30d后统计实验结果，结果如表2所示。

[0041] 表2

[0042]

[0043] 从表2可以看出，培养基B5生根诱导率最低，仅为13.33％。培养基B3和B6中有大量根和根原基发生，且根颜色洁白，诱导率均为90％以上，但是培养基B6诱导的根系更加粗壮，因此选择B6(MS+NAA 2.0mg·L-1)作为生根最佳诱导培养基。

[0044] 1.3卷丹百合的抗生素敏感性测试分析

[0045] 取卷丹百合无菌小鳞片，用解剖刀将其横切成2～3mm的薄层切片，然后将薄层切片接种于含3种不同浓度抗生素(头孢霉素Cef、卡纳霉素Kan和潮霉素Hyg)的MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1培养基中，40d后观察不定芽再生情况，结果如表3所示。

[0046] 表3

[0047]

[0048] 从表3可以看出，随着抗生素浓度的增加导致再生芽数减少，不定芽再生率降低。抗生素浓度较低时，薄层切片发芽正常，当Kan和Hyg浓度分别为100mg·L-1和75mg·L-1时，发芽量显著降低并呈萎缩趋势。而当Kan和Hyg浓度分别增至125mg·L-1和100mg·L-1时，无芽和根发生。可见，在遗传转化中，100mg·L-1Kan和75mg·L-1Hyg可以有效抑制未转化受体的不定芽分化。抑菌剂Cef为400mg·L-1时，薄层切片正常出芽；而600mg·L-1时大部分薄层-1 -1 -1
切片能正常发芽。因此，选择100mg·L Kan或75mg·L Hyg结合400～600mg·L Cef筛选转化植株。

[0049] 1.4Vc对不定芽诱导的影响

[0050] 取卷丹百合无菌小鳞片，用解剖刀将所述小鳞片横切成2～3mm的薄层切片，然后将薄层切片置于添加不同浓度维生素C(Vc)的A6培养基中进行培养，40d后统计数据。结果如表4所示。

[0051] 表4

[0052]

[0053] 从表4可以看出，与对照组相比，Vc能显著降低褐变效果，且对不定芽分化有促进-1效果。含100mg·L Vc的培养基对切片褐变的控制能力最强，褐变率仅为3.33％，诱导率达
96.67％，不定芽数最多，平均每接种切片不定芽数为5.47。

[0054] 二、一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法

[0055] 实施例1

[0056] 1、农杆菌菌液的活化

[0057] 取-80℃保存的EHA105(含pLGNe质粒)工程菌菌株，用划线法接种于含Kan 50mg·L-1和Rif40mg·L-1的YEB固体培养基；在恒温培养箱28℃培养36-48h后，用移液枪挑取单菌落菌株，接种于YEB液体培养基中，于28℃、转速180-250rpm，振荡培养24h后，再将其按体积比1:100加入YEB液体培养基活化，继续振荡培养约12h，至农杆菌菌液浓度OD600值介于0.6-0.8。然后将菌液用无菌的50ml离心管分装，并用封口膜封好，于5000rpm离心10min后倒掉上清液，用改良重悬液别将菌体EHA105重悬稀释至OD600＝0.2。

[0058] 2、外植体的获得

[0059] 取无菌卷丹百合鳞茎的中层小鳞片，然后用解剖刀将所述中层小鳞片横切成2～3mm的薄层切片，作为外植体；

[0060] 3、将薄层切片放入活化好的农杆菌EHA105菌液中分别浸染5min，使所述薄层切片与农杆菌充分接触后，并用无菌滤纸吸干薄层切片表面多余的菌液后，再转入改良共培养基中，在18～24℃的暗培养条件下培养1～3d，然后将其放入芽分化培养基(MS培养基+-1 -1 -1 -1 -1100mg·L Vc+6-BA 1.5mg·L +NAA 0.5mg·L +Kan 100mg·L +Hyg 75mg·L +Cef 400～600mg·L-1+6～8g/L琼脂+20～30g/L蔗糖)中，培养温度为23±1℃、光照强度为3000lx、光照时间16h/8h，每15d继代一次，待不定芽长至2～3cm后，再将其转入生根诱导培养基中诱导生根(MS培养基+Kan 100mg·L-1+Hyg 75mg·L-1+Cef400～600mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+
6～8g/L琼脂+20～30g/L蔗糖)培养温度为23±1℃、光照强度为3000lx、光照时间16h/8h。
如图2所示，薄层切片接种13～15d后，表面出现小突起，20～25d后，有嫩绿色的不定芽出现，35d左右出现大量丛生芽，65d左右丛生芽基部开始膨大，在生根培养基中诱导产生根，形成新的组培苗。

[0061] 实施例2～6和对比例1～6的操作步骤除侵染浓度、侵染时间和培养基不同外，其它同实施例1，具体见表5。

[0062] 将实施例1～6和对比例1～6在共培养结束后，并在芽分化培养基放置7～10d，以未转化同步材料为对照，取各组的薄层切片于GUS染色液中37℃反应3h后，依次用50％、70％和95％乙醇对材料进行脱色，统计并拍照记录GUS基因在卷丹百合中的染色情况。结果如图3所示。统计瞬时表达率，结果如表5所示。

[0063] 表5

[0064]

[0065] 将实施例1～6和对比例1～6在共培养结束后，以未转化同步材料为对照，取各组的组培苗于GUS染色液中37℃反应3h后，依次用50％、70％和95％乙醇对材料进行脱色，统计并拍照记录GUS基因在卷丹百合中的染色情况。结果如图4所示。统计转化GUS的稳定表达率，结果如表6所示。

[0066] 表6

[0067]

[0068]

[0069] 从表5和表6可以看出，相同侵染时间条件下，农杆菌菌液浓度OD600值为0.4的转化效率普遍高于OD600为0.2的转化效率，且当OD600值为0.4，侵染10～15min时转化效果最好。与对比例相比，在相同侵染条件下，本发明对常规的MS重悬液和MS共培养基进行改良后，瞬时转化效率由53.33％升高至81.82％，稳定转化率由16.13％升高至25.00％，明显提高了卷丹百合薄层切片的转化效率。

[0070] 对比例7

[0071] 以无菌小鳞片为外植体，其它操作步骤同实施例6。

[0072] 结果表明，转化受体材料容易出现污染，平均污染率为15.83％，最高污染率为23.75％；卷丹百合的瞬时转化率平均为9.13％，最高为22％。这可能是由于一方面，无菌小鳞片两边内卷，形成凹槽，农杆菌侵染后不易清洗；另一方面，无菌小鳞片相比于薄层切片而言，不利于农杆菌的入侵。

[0073] 对比例8

[0074] 以卷丹愈伤组织为转化受体，其它操作步骤同实施例6。

[0075] 结果无法获得卷丹百合的转化幼苗，这可能是由于卷丹百合愈伤组织对农杆菌过于敏感，以愈伤组织薄壁细胞为转化受体时，由于改良培养基中去除了部分无机盐成分(对农杆菌具有抑制作用)，农杆菌的增殖导致脱分化的薄壁细胞在抗性筛选过程中易发生致死，而无法形成不定芽，最终不能获得转基因植株。

[0076] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。