一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法

摘要

本发明公开了一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法，包括在：(1)获取原始NK细胞；(2)利用负载有青蒿素复合液的多孔导电微球与无血清培养液作为培养基；(3)将所述原始NK细胞加入所述培养基中，每天间歇性利用电极通入电流进行激活扩增培养；(4)细胞收集。总之，利用本发明的方法可在体外大规模扩增至1000倍以上、纯度大于98％，并且细胞活性高、杀伤力强的人胎盘源NK细胞。

权利要求

1.一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）获取原始NK细胞：将人胎盘进行清洗和除菌，胎盘组织消化，加入细胞分离液并离心，获取单个的原始NK细胞；

（2）制备培养基：将多孔导电微球与青蒿素复合液按照质量比为1:2‑4混合，在50‑60 ℃超声波处理1‑3 h，过滤，将负载有青蒿素复合液的多孔导电微球冷冻干燥；加入无血清培养液，在37 ℃下浸泡24‑36 h，更换无血清培养液，得到培养基；

5 5

（3）激活培养：将所述原始NK细胞加入所述培养基中至NK细胞浓度为3×10‑8×10 个/5

ml，置于37℃、5％CO2培养箱中培养3‑15 天，每隔2天换液一次，并调整细胞密度为4×10‑65

×10个/ml，每天间歇性利用电极通入电流进行激活扩增；

（4）细胞收集：培养结束后，一次过滤，得到液体部分和固体部分，向所述液体部分加入缓冲液，1000 g离心力，离心15 min，弃上清液，取第一批NK细胞；向所述固体部分加入洗脱液，反复冲洗，二次过滤，去除固体颗粒部分，1000 g离心力，离心15 min，弃上清液，取第二批NK细胞；将所述第一批NK细胞和第二批NK细胞混合，完成NK细胞收集；

电流进行激活扩增的具体方法为：

（1）第1‑2天，电流大小为0.5‑1.5 mA，电刺激的频率为36‑48次/天，电刺激工作频率为

25‑30 s/次；

（2）第3‑7天，电流大小为2‑4 mA，电刺激的频率为100‑120次/天，电刺激工作频率为

15‑20 s/次；

（3）第8‑15天，电流大小为5‑8 mA，电刺激的频率为150‑200次/天，电刺激工作频率为

5‑10 s/次；

多孔导电微球在所述培养基中的含量为8‑20 g/L；

所述多孔导电微球的制备方法包括以下步骤：

S1：以质量百分比计将占反应总体系20 %聚吡咯与25 %N‑甲基吡咯烷酮在180℃条件下加热溶解4‑6 h得到溶液A；将占总反应体系10 %液态二氧化碳和30 %去离子水在4‑10℃，8‑10 Mpa的条件下混合，得到溶液B；将所述溶液A加入到所述溶液B中，同时加入占总反应体系12 %乳化剂和3 %分散剂，在4‑10℃，8‑10 Mpa的环境条件下，以8000‑12000 rpm搅拌60‑120 min，得到含有实心导电微球的混合液体；

S2：将所述含有实心微球的混合液体升温至35‑50℃，减压至0.1‑0.3 Mpa，使液态二氧化碳升温气化，得到含有多孔导电微球的混合液体；

S3：对所述含有多孔导电微球的混合液体进行3‑5次高压静电脉冲，对所述多孔微球进行冲击破碎，过滤筛分出直径为150‑300 μm的多孔导电微球；

S4：将所述多孔导电微球置于真空容器中，抽至真空维持3‑6 h，恢复常压10 min，反复进行5‑8次，对多孔导电微球内部孔径进行扩撑，，利用无菌水反复冲洗，过滤，冷冻干燥；

S3中所述高压静电脉冲的工艺参数为：电压为55‑72 kV，推进速度为110 mm/h，脉宽为

12 ms，频率为350 Hz，液面距为10 mm；

所述青蒿素复合液按照重量百分比计包括：2.4‑3.6 %谷维素、4.6‑5.8 %谷胱甘肽、

0.5‑1.0 %功能乳化分散剂，余量为青蒿素提取液；

所述无血清培养液在DMEM无血清培养液的基础上添加了多源成分，所述多源成分包括：5‑8 g/L碳纳米管、1‑5 g/L活性胶原蛋白肽、25‑50 mg/L人转铁蛋白、60‑80 mg/L亚铁离子、120‑250 μg/L神经酰胺、1‑2 g/L磷脂、0.1‑1 mL/L脂溶性抗氧化剂、2‑4 μg/L抗β内啡肽、3‑5μg/L纤粘连蛋白、20‑60 mg/L维生素E、10‑80μM亚油酸、30‑55 μg/L表皮生长因子、60‑90 mg/L葡萄糖酸钙。

2.如权利要求1所述的一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法，其特征在于，所述多孔导电微球的粒径为150‑300 μm。

3.如权利要求1所述的一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法，其特征在于，所述一次过滤和二次过滤采用孔径为100 μm的滤网。

说明书

一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法。

背景技术

[0002] 目前，癌症已经成为全球第一死亡原因，在医学上，癌是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类。通常情况常规的治疗手段包括手术、放疗和化疗三种方式。近年来免疫细胞疗法作为第四种治疗肿瘤的新方式，临床上将NK细胞用于免疫治疗的例子在不断增多。免疫细胞能系统的杀灭肿瘤细胞，进而有效抑制肿瘤细胞的转移，并且副反应小。

[0003] NK细胞为免疫细胞中的一种，又称自然杀伤细胞，是人体内一种重要的天然免疫系统淋巴细胞。NK细胞的优势在于其不需抗原致敏和MHC限制就可以识别并杀伤肿瘤细胞，在机体抗肿瘤及早期抗病毒等免疫应答中起着重要作用。因此，NK细胞对肿瘤病人的治疗有很大的前景，但是NK细胞在体内所占的比例低、数量少，限制了NK细胞的应用，所以体外扩增NK细胞技术就开始发展。

[0004] 目前，体外扩增NK系统主要通过以下三种方法：一是采用免疫磁珠细胞分选，从外周血单个核细胞得到纯化的NK细胞，在体外加入因子扩增培养；二是采用饲养细胞的方法扩增原代NK细胞。三是单纯的细胞因子组合刺激NK细胞的扩增。第一种方法需要抽取患者大量的外周血(大于500ml)，才能够达到治疗所需要的细胞数量，并且往往只能扩增几十倍；第二种方法可以获得大量高纯度NK细胞，但容易引来外来细胞系污染。第三种利用因子刺激扩增培养NK细胞的方法安全性较好，临床应用价值高，但扩增倍数和纯度不高且不稳定。除此之外，常规二维培养空间利用率低，细胞所处环境均一性差，导致细胞扩增效率难以提升。因此，寻找一种扩增效率高、细胞纯度高且细胞活性高的人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法很有必要。

发明内容

[0005] 针对以上以上存在的技术问题，本发明提供一种扩增效率及细胞活性高的人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法。

[0006] 本发明的技术方案为：一种人胎盘源NK细胞的体外激活扩增方法，包括以下步骤：

[0007] (1)获取原始NK细胞：将人胎盘进行清洗和除菌，胎盘组织消化，加入细胞分离液并离心，获取单个的原始NK细胞；

[0008] (2)制备培养基：将多孔导电微球与青蒿素复合液按照质量比为1:2‑4混合，在50‑60℃超声波处理1‑3h，过滤，将负载有青蒿素复合液的多孔导电微球冷冻干燥；加入无血清培养液，在37℃下浸泡24‑36h，更换无血清培养液，得到培养基；

[0009] (3)激活培养：将原始NK细胞加入培养基中至NK细胞浓度为3×105‑8×105个/ml，5
置于37℃、5％CO2培养箱中培养3‑15天，每隔2天换液一次，并调整细胞密度为4×10‑6×
5
10个/ml，每天间歇性利用电极通入电流进行激活扩增；

[0010] (4)细胞收集：培养结束后，一次过滤，得到液体部分和固体部分，向液体部分加入缓冲液，1000g离心力，离心15min，弃上清液，取第一批NK细胞；向固体部分加入洗脱液，反复冲洗，二次过滤，去除固体颗粒部分，1000g离心力，离心15min，弃上清液，取第二批NK细胞；将第一批NK细胞和第二批NK细胞混合，完成NK细胞收集。

[0011] 进一步地，多孔导电微球的粒径为150‑300μm。

[0012] 进一步地，多孔导电微球在培养基中的含量为8‑20g/L。多孔导电微球的含量低于8g/L则孔洞不足以支持NK细胞繁殖扩增，而含量高于20g/L由于空间占比太大，反而会挤压NK细胞繁殖扩增的总空间，不利于扩增。

[0013] 进一步地，多孔导电微球的制备方法包括以下步骤：

[0014] S1：以质量百分比计将占反应总体系20％聚吡咯与25％N‑甲基吡咯烷酮在180℃条件下加热溶解4‑6h得到溶液A；将占总反应体系10％液态二氧化碳和30％去离子水在4‑10℃，8‑10Mpa的条件下混合，得到溶液B；将溶液A加入到溶液B中，同时加入占总反应体系
12％乳化剂和3％分散剂，在4‑10℃，8‑10Mpa的环境条件下，以8000‑12000rpm搅拌60‑
120min，得到含有实心导电微球的混合液体；由聚吡咯溶解在N‑甲基吡咯烷酮的溶液A作为油相，液态二氧化碳和去离子水的混合物溶液B作为水相，加入乳化剂和分散剂，高速搅拌乳化，将液态二氧化化碳与聚吡咯均质化形成实心微球。

[0015] S2：将含有实心微球的混合液体升温至35‑50℃，减压至0.1‑0.3Mpa，使液态二氧化碳升温气化，得到含有多孔导电微球的混合液体；减压升温后，体系中的二氧化碳会气化逸出，在实心微球内留下孔洞，形成的多孔导电微球对细胞没有毒性，使得NK细胞能够在多孔导电微球上高密度、高活性的生长。

[0016] S3：对含有多孔导电微球的混合液体进行3‑5次高压静电脉冲，对多孔微球进行冲击破碎，过滤筛分出直径为150‑300μm的多孔导电微球；由于混合液本身导电，利用高压静电脉冲对多孔导电微球进行多次冲击破碎时传导效果好，可避免电压集中，能大大的提高破碎的均匀度。

[0017] S4：将多孔导电微球置于真空容器中，抽至真空维持3‑6h，恢复常压10min，反复进行5‑8次，对多孔导电微球内部孔径进行扩撑，用于提高多孔导电微球的弹性和机械性能，便于容纳更多细胞，利用无菌水反复冲洗，过滤，冷冻干燥。

[0018] 进一步地，S3中高压静电脉冲的工艺参数为：电压为55‑72kV，推进速度为110mm/h，脉宽为12ms，频率为350Hz，液面距为10mm。

[0019] 进一步地，青蒿素复合液按照重量百分比计包括：2.4‑3.6％谷维素、4.6‑5.8％谷胱甘肽、0.5‑1.0％功能乳化分散剂，余量为青蒿素提取液。青蒿性寒，味苦、辛；归肝、胆经。清热；解暑；除蒸；截疟。主暑热；暑湿；湿温；阴虚发热；疟疾；黄疸。用于暑邪发热，阴虚发热，夜热早凉，骨蒸劳热，疟疾寒热，湿热黄疸。还具有抗肿瘤、抗真菌和调节免疫系统的作用。由于青蒿素属于脂溶性物质，可以直接进出细胞膜，在研究中发现，小剂量的青蒿素能够明显的刺激NK细胞增殖，还可以提供NK细胞的抗肿瘤活性。谷胱甘肽用于提高青蒿素的稳定性，谷维素用于滋养NK细胞。

[0020] 进一步地，无血清培养液在DMEM无血清培养液的基础上添加了多源成分，多源成分包括：5‑8g/L碳纳米管、1‑5g/L活性胶原蛋白肽、25‑50mg/L人转铁蛋白、60‑80mg/L亚铁离子、120‑250μg/L神经酰胺、1‑2g/L磷脂、0.1‑1mL/L脂溶性抗氧化剂、2‑4μg/L抗β内啡肽、3‑5μg/L纤粘连蛋白、20‑60mg/L维生素E、10‑80μM亚油酸、30‑55μg/L表皮生长因子、60‑
90mg/L葡萄糖酸钙。其中，碳纳米管为空心结构，不仅能够保证细胞连通性，还能起到均匀导电的作用，用于刺激NK细胞增殖。活性胶原蛋白肽用于提高细胞寿命、抑制细胞膜脂质过氧化、抵抗氧化自由基对DNA的攻击；抗β内啡肽能够刺激NK细胞发生应激反应，从而提高其扩增率。

[0021] 进一步地，电流进行激活扩增的具体方法为：

[0022] (1)第1‑2天，电流大小为0.5‑1.5mA，电刺激的频率为36‑48次/天，电刺激工作频率为25‑30s/次；

[0023] (2)第3‑7天，电流大小为2‑4mA，电刺激的频率为100‑120次/天，电刺激工作频率为15‑20s/次；

[0024] (3)第8‑15天，电流大小为5‑8mA，电刺激的频率为150‑200次/天，电刺激工作频率为5‑10s/次。

[0025] 随着NK细胞数量扩增，进而调整电流大小以及刺激频率，数量少时利用小电流，少频次长时刺激，数量逐渐增多时利用较大电流进行多频次短时刺激，通过改变电流刺激的参数保证NK细胞数量的稳定增长。

[0026] 进一步地，一次过滤和二次过滤采用孔径为100μm的滤网。用于分离过滤多孔导电微球和NK细胞。

[0027] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明利用负载有青蒿素复合液的多孔导电微球作为NK细胞扩增繁殖的载体，由于青蒿素属于脂溶性物质，可以直接进出细胞膜，小剂量的青蒿素能够明显的刺激NK细胞增殖，还可以提供NK细胞的抗肿瘤活性。多孔导电微球则利用作为水相的液态二氧化碳与作为油相的导电聚吡咯溶液乳化形成实心微球，液态二氧化碳同时作为制孔剂，对细胞无毒害，在减压升温后，二氧化碳逸出形成孔洞，再利用高压静电脉冲多次冲击破碎，形成符合规格大小的多孔导电微球。能够使得NK细胞能够在多孔导电微球上高密度、高活性的生长。本发明在NK细胞扩增培养期间，通过通过改变电流刺激的参数保证NK细胞数量的稳定增长。总之，利用本发明的方法可在体外大规模扩增数量多、细胞活性高、杀伤力强的人胎盘源NK细胞。

具体实施方式

[0028] 实施例1

[0029] (一)制备多孔导电微球

[0030] S1：以质量百分比计将占反应总体系20％聚吡咯与25％N‑甲基吡咯烷酮在180℃条件下加热溶解5h得到溶液A；将占总反应体系10％液态二氧化碳和30％去离子水在7℃，10Mpa的条件下混合，得到溶液B；将溶液A加入到溶液B中，同时加入占总反应体系12％乳化剂和3％分散剂，在7℃，10Mpa的环境条件下，以10000rpm搅拌120min，得到含有实心导电微球的混合液体；由聚吡咯溶解在N‑甲基吡咯烷酮的溶液A作为油相，液态二氧化碳和去离子水的混合物溶液B作为水相，加入乳化剂和分散剂，高速搅拌乳化，将液态二氧化化碳与聚吡咯均质化形成实心微球。

[0031] S2：将含有实心微球的混合液体升温至45℃，减压至0.1Mpa，使液态二氧化碳升温气化，得到含有多孔导电微球的混合液体；减压升温后，体系中的二氧化碳会气化逸出，在实心微球内留下孔洞，形成的多孔导电微球对细胞没有毒性，使得NK细胞能够在多孔导电微球上高密度、高活性的生长。

[0032] S3：对含有多孔导电微球的混合液体进行4次高压静电脉冲，对多孔微球进行冲击破碎，过滤筛分出直径为200μm的多孔导电微球；由于混合液本身导电，利用高压静电脉冲对多孔导电微球进行多次冲击破碎时传导效果好，可避免电压集中，能大大的提高破碎的均匀度。高压静电脉冲的工艺参数为：电压为65kV，推进速度为110mm/h，脉宽为12ms，频率为350Hz，液面距为10mm。

[0033] S4：将多孔导电微球置于真空容器中，抽至真空维持5h，恢复常压10min，反复进行5次，对多孔导电微球内部孔径进行扩撑，用于提高多孔导电微球的弹性和机械性能，便于容纳更多细胞，利用无菌水反复冲洗，过滤，冷冻干燥。最后得到的多孔导电微球的粒径在
150‑300μm之间。

[0034] (二)制备培养基

[0035] 将多孔导电微球与青蒿素复合液按照质量比为1:3混合。在50‑60℃超声波处理1‑3h，过滤，将负载有青蒿素复合液的多孔导电微球冷冻干燥；加入无血清培养液，使多孔导电微球在培养基中的含量控制14g/L，多孔导电微球的含量低于8g/L则孔洞不足以支持NK细胞繁殖扩增，而含量高于20g/L由于空间占比太大，反而会挤压NK细胞繁殖扩增的总空间，不利于扩增。在37℃下浸泡30h，更换无血清培养液，得到培养基；

[0036] 其中，青蒿素复合液按照重量百分比计包括：3.0％谷维素、5.2％谷胱甘肽、0.8％功能乳化分散剂(QN‑30082)，余量为青蒿素提取液。青蒿性寒，味苦、辛；归肝、胆经。清热；解暑；除蒸；截疟。主暑热；暑湿；湿温；阴虚发热；疟疾；黄疸。用于暑邪发热，阴虚发热，夜热早凉，骨蒸劳热，疟疾寒热，湿热黄疸。还具有抗肿瘤、抗真菌和调节免疫系统的作用。由于青蒿素属于脂溶性物质，可以直接进出细胞膜，在研究中发现，小剂量的青蒿素能够明显的刺激NK细胞增殖，还可以提供NK细胞的抗肿瘤活性。谷胱甘肽用于提高青蒿素的稳定性，谷维素用于滋养NK细胞。

[0037] 无血清培养液在DMEM无血清培养液的基础上添加了多源成分，多源成分包括：6g/L碳纳米管、3g/L活性胶原蛋白肽、35mg/L人转铁蛋白、70mg/L亚铁离子、185μg/L神经酰胺、1.5g/L磷脂、0.4mL/L脂溶性抗氧化剂、3μg/L抗β内啡肽、4μg/L纤粘连蛋白、40mg/L维生素E、45μM亚油酸、40μg/L表皮生长因子、80mg/L葡萄糖酸钙。其中，碳纳米管为空心结构，不仅能够保证细胞连通性，还能起到均匀导电的作用，用于刺激NK细胞增殖。活性胶原蛋白肽用于提高细胞寿命、抑制细胞膜脂质过氧化、抵抗氧化自由基对DNA的攻击；抗β内啡肽能够刺激NK细胞发生应激反应，从而提高其扩增率。

[0038] (三)获取原始NK细胞

[0039] 将人胎盘进行清洗和除菌，胎盘组织消化，加入细胞分离液并离心，获取单个的原始NK细胞。

[0040] (四)激活培养

[0041] 将原始NK细胞加入培养基中至NK细胞浓度为5×105个/ml，置于37℃、5％CO2培养5
箱中培养15天，每隔2天换液一次，并调整细胞密度为5×10个/ml，每天间歇性利用电极通入电流进行激活扩增；电流的大小恒定为4mA。

[0042] (五)细胞收集

[0043] 培养结束后，一次过滤，得到液体部分和固体部分，向液体部分加入缓冲液，1000g离心力，离心15min，弃上清液，取第一批NK细胞；向固体部分加入洗脱液，反复冲洗，二次过滤，去除固体颗粒部分，1000g离心力，离心15min，弃上清液，取第二批NK细胞；将第一批NK细胞和第二批NK细胞混合，完成NK细胞收集。一次过滤和二次过滤均采用孔径为100μm的滤网。用于分离过滤多孔导电微球和NK细胞。

[0044] 实施例2

[0045] 本实施例与实施例1基本相同，不同指出在于：

[0046] 电流进行激活扩增的具体方法为：

[0047] (1)第1‑2天，电流大小为1.0mA，电刺激的频率为42次/天，电刺激工作频率为28s/次；

[0048] (2)第3‑7天，电流大小为3mA，电刺激的频率为110次/天，电刺激工作频率为17s/次；

[0049] (3)第8‑15天，电流大小为6.5mA，电刺激的频率为175次/天，电刺激工作频率为7s/次。

[0050] 随着NK细胞数量扩增，进而调整电流大小以及刺激频率，数量少时利用小电流，少频次长时刺激，数量逐渐增多时利用较大电流进行多频次短时刺激，通过改变电流刺激的参数保证NK细胞数量的稳定增长。

[0051] 对比例1

[0052] 本实施例与实施例1基本相同，不同指出在于：

[0053] 多孔导电微球在培养基中的含量为30g/L。

[0054] 对比例2

[0055] 本实施例与实施例1基本相同，不同指出在于：

[0056] 多孔导电微球在培养基中的含量为5g/L。

[0057] 对比例3

[0058] 按照实施例1中的方法进行操作，不同的是，将多孔导电微球替换为Cytodex1微载体。

[0059] 对比例4

[0060] 按照实施例1中的方法进行操作，不同的是，多孔导电微球没有负载青蒿素复合液。

[0061] 实验例

[0062] 分别进行实施例1‑2和对比例1‑4的操作30次，计算NK细胞的扩增率、纯度以及对HT‑29、HepG2和T47D杀伤活性的平均值，并计算30次操作中各指标的变异系数(coefficient of variation，CV值，标准偏差与平均值之比)，结果如表1所示。

[0063] 表1实施例1‑2和对比例1‑4中NK细胞的测试结果

[0064]

[0065] 尽管已参照其具体实施方案描述和阐明了本发明，但本领域技术人员会认识到，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对其作出各种改变、修改和取代。因此，本发明意在仅受下列权利要求的范围限制且这些权利要求应在合理的程度上尽可能广义地解释。