一种DNA片段及其在构建表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒中的应用

摘要

本发明公开了一种DNA片段及其在构建表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒中的应用。本发明在H9N2流感病毒毒株的NS1基因后面插入mCherry荧光基因，其中，完整NS基因以NS1基因、mCHerry荧光基因和NEP基因依次连接而成，该基因与NEP基因中间用可以被蛋白酶识别并切割的PTV‑1 2A序列相连，从而构成荧光蛋白标记的NS融合基因，其核苷酸如SEQ ID NO:1所示。本发明构建的重组流感病毒为可产生表达红色荧光蛋白的活病毒，其在病毒传代的过程中较为稳定，不影响病毒自身的功能，且生长曲线与滴度与野生病毒株相似，可将其用于后续研究，对抗流感病毒药物的研发、筛选和生产具有重要意义。

权利要求

1.一种DNA片段在构建重组禽流感病毒中的应用，其特征在于：所述的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的禽流感病毒为H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株。

2.一种重组质粒在构建重组禽流感病毒中的应用，其特征在于：所述的重组质粒为将权利要求1中所述的DNA片段插入到双向表达载体pHW2000的Aar I的酶切位点上获得；

所述的禽流感病毒为H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株。

3.权利要求2所述的重组质粒在构建重组禽流感病毒中的应用，其特征在于，所述的重组质粒通过如下方法构建得到：将权利要求1中所述的DNA片段用Aar I限制性内切酶进行酶切，然后将其用连接酶连接到用BsmB I限制性内切酶切后的双向表达载体pHW2000上，得到重组表达质粒pHW-NS1-mCherry-NEP。

4.一种表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建7个基因的重组表达质粒：

将PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因分别用BsmB I限制性内切酶酶切，然后分别用连接酶连接到用BsmB I限制性内切酶切后的双向表达载体pHW2000上，得到重组表达质粒pHW-V-PB2、pHW-V-PB1、pHW-V-PA、pHW-V-HA、pHW-V-NP、pHW-V-NA和pHW-V-M；

(2)构建NS1蛋白携带mCherry荧光基因的重组流感病毒

将权利要求3中所述的重组表达质粒pHW-NS1-mCherry-NEP、pHW-V-PB2、pHW-V-PB1、pHW-V-PA、pHW-V-HA、pHW-V-NP、pHW-V-NA和pHW-V-M共同转染到293T细胞中，于37℃条件下培养转染4～6小时后，更换为含TPCK胰酶和BSA的Opti-MEM培养基，继续培养，收集上清液，然后将上清液接种鸡胚，得到表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒；

步骤(1)中所述的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因为从H9N2流感病毒中扩增得到的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因；

所述的H9N2流感病毒为H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株。

5.根据权利要求4所述的表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒的构建方法，其特征在于：还包括将步骤(2)中得到的重组流感病毒进行鉴定的步骤；

所述的鉴定的方法为PCR方法、间接免疫荧光和Western-Blot中的至少一种；

所述的采用PCR方法进行鉴定的引物如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

6.一种表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒，其特征在于：通过权利要求4～5任一项所述的方法制备得到。

7.权利要求1中所述的DNA片段，权利要求2～3任一项中所述的重组质粒或权利要求6所述的表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒在研究流感病毒机理机制或筛选抗流感病毒药物中的应用。

说明书

一种DNA片段及其在构建表达红色荧光蛋白基因的重组流感

病毒中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种DNA片段及其在构建表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒中的应用。

背景技术

[0002] 流感病毒属于正粘病毒科的单股负链RNA病毒，分为A(甲)、B(乙)、C(丙)三型。其中A型病毒的天然宿主是野生水禽，可以感染多种禽类和哺乳动物，是导致人类流感和禽流感流行的病原。禽流感自1978年首次报道以来，已经引发世界范围内多次大流行导致人和家禽大规模的死亡，严重威胁养禽业和公共卫生安全。此外，根据最近的研究，季节性流感影响了约20％的世界人口，并导致每年250,000至500,000人死亡。

[0003] 病毒的蛋白经过荧光蛋白标记后，拯救的重组病毒会携带荧光基因，从而能够在活细胞或者活体中被观察到。近年来，已有多种病毒，例如乙肝病毒、腺病毒以及流感病毒等成功经过荧光标记后，用于科学研究。齐鲁医药学院成功构建一株表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人肠道病毒EV71型重组病毒，用于借助酶标仪建立中草药或中草药单体抗病毒的高通量筛选技术。遵义医学院附属医院将流感病毒的NP蛋白与绿色荧光蛋白(EGFP)融合，可以通过RNA干扰抑制流感病毒NP基因，并在细胞及病毒中进行功能鉴定。多项研究表明利用荧光基因标记病毒蛋白，既可以研究病毒在活体细胞内的生命机制，也可以为抗病毒药物筛选提供帮助。

[0004] 流感非结构蛋白NS1和NS2是由流感基因片段8编码而成。NS1蛋白是A型流感病毒的非结构蛋白，具有细胞核定位信号及核外转运信号，可以通过影响多聚mRNAs的核外转运过程来调节宿主基因的表达。NS2蛋白近年来被证实为A型流感病毒的结构蛋白，又被称作细胞核外转运蛋白(nuclear export protein，NEP)。NS2作为一个多功能的病毒蛋白，参与流感病毒vRNP的核输出等过程。但到目前为止，尚未有在流感非结构蛋白NS1蛋白插入荧光标记基因(mCherry)使病毒表达红色荧光的相关报道。

发明内容

[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种DNA片段。

[0006] 本发明的另一目的在于提供所述DNA片段在构建重组质粒或重组病毒中的应用。

[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0008] 含有所述的DNA片段的重组质粒或重组病毒。

[0009] 一种重组质粒，为将所述的DNA片段(NS融合基因)插入到双向表达载体pHW2000的Aar I的酶切位点上获得。

[0010] 所述的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：将所述的DNA片段(NS融合基因)用Aar I限制性内切酶进行酶切，然后将其用连接酶连接到用BsmB I限制性内切酶切后的双向表达载体pHW2000上，得到重组表达质粒pHW-NS1-mCherry-NEP。

[0011] 所述的连接酶优选为T4连接酶。

[0012] 所述的重组质粒在构建重组禽流感病毒中的应用。

[0013] 所述的禽流感病毒为H9N2流感病毒；优选为H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株。

[0014] 一种表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒的构建方法，包括如下步骤：

[0015] (1)构建7个基因的重组表达质粒：

[0016] 将PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因分别用BsmB I限制性内切酶酶切，然后分别用连接酶连接到用BsmB I限制性内切酶切后的双向表达载体pHW2000上，得到重组表达质粒pHW-V-PB2、pHW-V-PB1、pHW-V-PA、pHW-V-HA、pHW-V-NP、pHW-V-NA和pHW-V-M；

[0017] (2)构建NS1蛋白携带mCherry荧光基因的重组流感病毒

[0018] 将所述的重组表达质粒pHW-NS1-mCherry-NEP、pHW-V-PB2、pHW-V-PB1、pHW-V-PA、pHW-V-HA、pHW-V-NP、pHW-V-NA和pHW-V-M共同转染到293T细胞中，于37℃条件下培养转染4～6小时后，更换为含TPCK胰酶和BSA(牛血清白蛋白)的Opti-MEM培养基，继续培养，收集上清液，然后将上清液接种鸡胚，得到表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒。

[0019] 步骤(1)中所述的连接酶优选为T4连接酶。

[0020] 步骤(1)中所述的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因优选为从H9N2流感病毒中扩增得到；其中，

[0021] 扩增PB2基因的引物序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；

[0022] 扩增PB1基因的引物序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；

[0023] 扩增PA基因的引物序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；

[0024] 扩增HA基因的引物序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；

[0025] 扩增NP基因的引物序列如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；

[0026] 扩增NA基因的引物序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:22所示；

[0027] 扩增M基因的引物序列如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示。

[0028] 所述的H9N2流感病毒优选为H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008株。

[0029] 步骤(2)中所述的继续培养的时间优选为48h。

[0030] 步骤(2)中所述的细胞培养所用的培养基为DMEM培养基；优选为GIBCO DMEM培养基。

[0031] 所述的表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒的构建方法，还包括将步骤(2)中得到的重组流感病毒进行鉴定的步骤。

[0032] 所述的鉴定的方法为PCR方法、间接免疫荧光(IFA)和Western-Blot中的至少一种；其中，PCR的鉴定引物如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

[0033] 一种表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒，通过上述任一项所述的方法制备得到。

[0034] 所述的DNA片段、重组质粒或表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒在研究流感病毒机理机制(非疾病的诊断和治疗)或筛选抗流感病毒药物中的应用。

[0035] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0036] 1、本发明拯救出NS1蛋白携带并表达红色荧光蛋白mCherry基因的稳定遗传的H9N2亚型禽流感病毒。在H9N2流感病毒V毒毒株的NS1基因后面插入mCherry荧光基因，其中，完整NS基因以NS1基因、mCHerry荧光基因和NEP基因依次连接而成，该基因与NEP基因中间用可以被蛋白酶识别并切割的PTV-12A序列相连，从而构成荧光蛋白标记的NS基因组。在翻译过程中，NS1蛋白与mCherry荧光基因连接，通过蛋白酶将NEP蛋白切割分离。这样的结构设计保持了NS基因的功能完整性，不影响病毒翻译后的蛋白加工修饰，也不影响子代病毒颗粒组装。该融合病毒基因表达质粒与流感病毒其他七质粒转染进293T细胞后，可以产生表达红色荧光蛋白的活病毒，并可用于后续应用。

[0037] 2、本发明重组病毒能够高效表达mCherry基因，经验证携带荧光基因的病毒在病毒传代的过程中较为稳定，不影响病毒自身的功能，生长曲线与滴度与野生病毒株相似。

[0038] 3、本发明在流感非结构蛋白NS1蛋白插入荧光标记基因(mCherry)，可以使病毒表达红色荧光。所构建的荧光标记病毒株可用进一步研究流感病毒的生命机制，同时为筛选有效的抗流感病毒药物提供了一种快速的检验方法，对新型抗流感病毒药物的研发、筛选和生产具有重要的意义。

附图说明

[0039] 图1是NS全长基因构建示意图。

[0040] 图2是P1～P4代次的VK627-mCherry重组病毒的NS全长基因和mCherry基因PCR鉴定结果；其中，A为NS全长基因PCR鉴定结果，B为mCherry基因PCR鉴定结果图。

[0041] 图3是VK627-mCherry重组病毒感染MDCK细胞的荧光和间接免疫荧光(IFA)结果图。

[0042] 图4是VK627-mCherry重组病毒Western-Blot检测的结果图。

[0043] 图5是VK627-mCherry重组病毒生长曲线的测定图。

[0044] 图6是VK627-mCherry重组病毒不同MOI感染MDCK细胞荧光结果图。

[0045] 图7是利巴韦林药物对VK627-mCherry重组病毒的作用图。

具体实施方式

[0046] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。其中，研究用的流感病毒为A/chicken/Guangdong/V/2008(H9N2)(参考文献获得：Li X,Qi W,He J,Ning Z,Hu Y,Tian J,Jiao P,Xu C,Chen J,Richt J,Ma W,Liao M.2012.Molecular basis of efficient replication and pathogenicity of H9N2avian influenza viruses in mice.Plos One 7:e40118.)、双向表达载体pHW2000购买于淼灵生物(P1784)、
293T细胞系( CRL-11268TM)和MDCK细胞( CCL-34TM)购买于ATCC细胞库。

[0047] 实施例1、携带mCherry基因的H9N2重组病毒的拯救

[0048] 1.1携带mCherry基因的NS基因全长感染性克隆的构建

[0049] 提取亲本病毒株(流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008(H9N2)，简称VK627)的总RNA，设计引物分别扩增编码NS1蛋白以及NEP蛋白的基因序列(不含终止密码子)，在NS1基因后面插入mCherry荧光基因，该基因与NEP基因中间使用能被蛋白酶识别切割的PTV-1 2A序列连接，具体构建见图1；其中以引物Aar I-V-NS1-F和V-NS1-mCherry-R扩增出编码NS1蛋白的序列(NS1基因序列)；mCherry-2A序列由金维智公司人工合成；最后以引物NEP-F和Aar I-V-2A-NEP-R扩增出NEP蛋白的基因序列(NEP基因序列)，并在上下游分别插入Aar I的酶切位点。引物序列(5'-3')如下：

[0050] Aar I-V-NS1-F:GCGACACCTGCTACAGGGGAGCAAAAGCAGGGTGACAAA(SEQ ID NO:3)；

[0051] V-NS1-mCherry-R:CTCGCCCTTGCTCACCATTCCACCGGATCCCTTTGGAGAGAGTGG AGGTC(SEQ ID NO:4)；

[0052] NEP-F：ATGGATTCCAACACTGTGTCAAGCTTCCAGGACATACTGATGAGGATGTC(SEQ ID NO:5)；

[0053] Aar I-V-2A-NEP-R：GCGACACCTGCTACATATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQ ID NO:6)。

[0054] mCherry-2A基因序列(SEQ ID NO:2)：

[0055] GGATCCGGTGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGAAACGGATCCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCC。

[0056] 将纯化后并测序结果正确的三个PCR片段：NS1基因序列、mCherry-2A、NEP基因序列进行融合PCR，扩增出全长的NS融合基因。mCherry荧光基因插入NS基因融合PCR反应体系如下：

[0057]

[0058] 其中，融合PCR引物序列(5'-3')如下：

[0059] Aar I-V-F：GCGACACCTGCTACAGGGGAGCAAAAGCAGGG TGACAAA(SEQ ID NO:7)；

[0060] Aar I-V-R：GCGACACCTGCTACATATTAGTAGAAACAAGG GTGTTTT(SEQ ID NO:8)。

[0061] 将融合后的PCR产物用Aar I限制性内切酶酶切，反应体系如下：

[0062]

[0063] 37℃水浴处理2h以上，纯化回收备用。

[0064] NS融合基因序列(SEQ ID NO:1)：

[0065] agcaaaagcagggtgacaaagacataatggattccaacactgtgtcaagcttccaggtagactgctttctttggcatgtccgcaaacgatttgcagaccaagaactgggtgatgccccatttctagaccggctccgccgggatcagaagtccctgagaggaagaggcagcactcttggtctggacattagaaccgcaactcgtgaaggaaagcatatagtggagcagattctgaaggaagaatcagatgaggcatttaaaatgactattgcttcagtgccagttccacgctacttaactgacatgactcttgaagaaatgtcaagagattggttaatgctcattcccaaacagaaagtgacagggtccctttgcattagaatggaccaagcaacagtggataaaaccatcacattaaaagcaaacttcagtgtgattttcaatcgactggaagctctaatactacttagagcttttacagacgaaggagcaatagtgggcgaaatctcaccattaccttctctCccGggacatactgatgaggatgtcaaaaatgcaattggggtcctcatcg gaggatttgaatggaatgataacacagttcgagtctctgaaaatctacagagattcgcttggagaagcagcgatgaggatgggagacctccactctctccaaagGGATCCGGTGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGAAACGGATCCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCatggattccaacactgtgtcaagcttccaggacatactgatgaggatgtcaaaaatgcaattggggtcctcatcggaggatttgaatggaatgataacacagttcgagtctctgaaaatctacagagattcgcttggagaagcagcgatgaggatgggagacctccactctctccaaagtagaaactggaaatggagggaacaattgagccagaaattcgaagaaataagatggttgattgaagaagtgcgacgtagattaaagattacagagaatagctttgagcaaataacatttatgcaagccttacaactactgcttgaagtggagcaagagataagaactttctcgtttcagcttatttaatgataaaaaacacccttgtttctact。

[0066] 双向表达载体pHW2000用BsmB I限制性内切酶切，反应体系如下：

[0067]

[0068] 55℃水浴处理2h以上，纯化回收备用。

[0069] 将酶切后的PCR产物与双向表达载体pHW2000混合后，用T4连接酶连接，体系如下：

[0070]

[0071]

[0072] 将连接产物置于16℃反应1h后，取5μL的连接产物加入50μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热应激处理45s，集菌后接种于AMP(氨苄霉素)抗性的LB固体培养基平皿上，倒置37℃培养12～16h。挑取平皿上的单菌落于500μL AMP抗性的LB液体中，37℃摇床中培养4h。通过菌液PCR扩增筛选阳性菌。菌液PCR反应体系如下：

[0073]2×Premix rTaq 10μL
上游引物(20pmol) 7μL
下游引物(20pmol) 0.5μL
去离子水 0.5μL
菌液 2μL
总体积 20μL

[0074] 其中，菌液PCR鉴定引物序列(5'-3')如下：

[0075] pHW2000-F：GAATTCGAGCTCGGTACC(SEQ ID NO:9)；

[0076] pHW2000-R：GCGATGGTGGCGTTTTTG(SEQ ID NO:10)。

[0077] 将测序结果正确的阳性菌液接种于扩大培养后，使用OMEGA公司Endo-free Plasmid Mini Kit I试剂盒抽提质粒，将抽提好的质粒置于-20℃保存备用。将重组质粒命名为pHW-NS1-mCherry-NEP。

[0078] 1.2H9N2病毒剩余七个基因感染性克隆的构建

[0079] 使用先前提取的亲本病毒株(流感病毒A/chicken/Guangdong/V/2008(H9N2))的总RNA，设计引物分别扩增PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因，并在上下游分别插入BsmB I的酶切位点。引物序列(5'-3')如下：

[0080] PB2-F：TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTC(SEQ ID NO:11)；

[0081] PB2-R：ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT(SEQ ID NO:12)；

[0082] PB1-F：TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCA(SEQ ID NO:13)；

[0083] PB1-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT(SEQ ID NO:14)；

[0084] PA-F：TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTAC(SEQ ID NO:15)；

[0085] PA-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT(SEQ ID NO:16)；

[0086] HA-F：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG(SEQ ID NO:17)；

[0087] HA-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT(SEQ ID NO:18)；

[0088] NP-F：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTA(SEQ ID NO:19)；

[0089] NP-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT(SEQ ID NO:20)；

[0090] NA-F：TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT(SEQ ID NO:21)；

[0091] NA-R：ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT(SEQ ID NO:22)；

[0092] M-F：TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG(SEQ ID NO:23)；

[0093] M-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT(SEQ ID NO:24)。

[0094] PCR反应体系如下：

[0095] 2×PrimeSTAR 25μL上游引物(20pmol) 1μL
下游引物(20pmol) 1μL
去离子水 20μL
cDNA 3μL
总体积 50μL

[0096] 将扩增出的七个PCR产物用BsmB I限制性内切酶切，反应体系如下：

[0097]BsmB I限制性内切酶(NEB R0580S) 1μL
10×Buffer 5μL
目的片段 1μg
去离子水补至 50μL

[0098] 55℃水浴处理2h以上，纯化回收备用。

[0099] 将酶切后的PCR产物分别与双向表达载体pHW2000混合后，用T4连接酶连接，体系如下：

[0100]

[0101] 将连接产物置于16℃反应1h后，取5μL的连接产物加入50μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热应激处理45s，集菌后接种于AMP(氨苄霉素)抗性的LB固体培养基平皿上，倒置37℃培养12～16h。挑取平皿上的单菌落于500μL AMP抗性的LB液体中，37℃摇床中培养4h。通过菌液PCR扩增筛选阳性菌。菌液PCR反应体系如下：

[0102]2×Premix rTaq 10μL
上游引物(20pmol) 7μL
下游引物(20pmol) 0.5μL
去离子水 0.5μL
菌液 2μL
总体积 20μL

[0103] 其中，菌液PCR鉴定引物序列(5'-3')如下：

[0104] pHW2000-F：GAATTCGAGCTCGGTACC(SEQ ID NO:9)；

[0105] pHW2000-R：GCGATGGTGGCGTTTTTG(SEQ ID NO:10)。

[0106] 将测序结果正确的阳性菌液接种于扩大培养后，使用OMEGA公司Endo-free Plasmid Mini Kit I试剂盒抽提质粒，将抽提好的质粒置于-20℃保存备用。重组质粒分别命名为：-pHW-V-PB2、pHW-V-PB1、pHW-V-PA、pHW-V-HA、pHW-V-NP、pHW-V-NA和pHW-V-M。

[0107] 1.3重组病毒的拯救

[0108] 按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书将提取的pHW-NS1-mCherry-NEP质粒和A/chicken/Guangdong/V/2008(H9N2)病毒中的七质粒：pHW-V-PB2，pHW-V-PB1，pHW-V-PA，pHW-V-HA，pHW-V-NP，pHW-V-NA和pHW-V-M转染至生长密度为90％的293T细胞培养板中(12孔板)，转染剂量为2.4μg，每个片段300ng。37℃培养箱培养4h后，每孔更换为含有终浓度为1μg/mL的TPCK处理的胰酶，终浓度为0.2％(w/v)的BSA(牛血清白蛋白)的Opti-MEM培养基(每孔加入1mL)，继续放置37℃培养箱培养48h后观察细胞病变，转染细胞出现肿胀变圆，细胞核缩小，细胞间隙变大并伴随一些脱落时收集细胞和上清，反复冻融后接种于10日龄SPF鸡胚(大华农公司)，72h后进行血凝实验，收集有血凝价的病毒，将重组病毒命名为VK627-mCherry；连续传4代，按顺序将获得的病毒代次命名为P1～P4。

[0109] 实施例2：VK627-mCherry重组病毒的鉴定及应用

[0110] 2.1重组病毒NS全长基因以及荧光基因mCherry的鉴定

[0111] 用飞捷生物公司的总RNA极速抽提试剂盒分别提取P1～P4代的重组病毒VK627-mCherry的总RNA，使用MLV反转录酶(Takara code No.2641A)反转得到cDNA，具体反转录反应体系如下：

[0112]RTase M-MLV(RNase H-)(200U/μL) 1μL
5×M-MLV-Buffer 12μL
dNTP Mixture(10mmol) 12μL
RNase Inhibitor(40U/μL) 2μL
Uni12primer(10pmol) 3μL
RNA模板 30μL
总体积 60μL

[0113] 设计NS全长鉴定引物(SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26)和mCherry荧光基因的鉴定引物(SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28)，PCR反应体系如下：

[0114]2×Premix Ex-Taq 25μL
上游引物(20pmol) 1μL
下游引物(20pmol) 1μL
去离子水 20μL
cDNA 3μL
总体积 50μL

[0115] 其中鉴定引物序列(5'-3')如下：

[0116] V-NS-F：GGAGCAGATTCTGAAGGAA(SEQ ID NO:25)；

[0117] V-NS-R：AGTAGAAACAAGGGTGTTTTT(SEQ ID NO:26)；

[0118] mCherry-F：ATGGTGAGCAAGGGCGA(SEQ ID NO:27)；

[0119] mCherry-R：CTTGTACAGCTCGTCCA(SEQ ID NO:28)。

[0120] 经过PCR鉴定，结果证实NS全长基因(图2A)和mCherry荧光基因(图2B)目的片段大小均正常，确认产生重组病毒VK627-mCherry。

[0121] 2.2重组病毒荧光和间接免疫荧光(IFA)检测

[0122] 将H16-L10-4R5细胞(购买于ATCC细胞库 HB-65TM)在75cm2的细胞培养瓶中培养，48h后收取细胞上清离心后作为流感NP抗体使用。

[0123] 将重组病毒VK627-mCherry以1MOI接种于生长密度为90％的MDCK细胞中，37℃培养2h后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗2遍并更换为含0.2％(w/v)BSA和1μg/mL TPCK处理的胰酶的GIBCO DMEM培养基(每孔加入1mL)，在5％(v/v)CO2、37℃环境中继续培养24h。24h后用
4％室温多聚甲醛固定30min，PBS洗涤三遍后，分别加入流感病毒NP抗体，37℃条件下反应
2h。弃掉NP抗体后，用PBS洗涤三遍，加入1:200倍稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG荧光二抗，37℃避光条件下反应30min。用PBS洗涤后在荧光显微镜下观察结果并拍照。以亲本病毒株(VK627)作为对照。结果如图3所示：VK627-mCherry重组病毒感染MDCK细胞后能观察到红色荧光，V毒亲本毒株观察不到荧光；NP蛋白可以正常表达。以上结果证明VK627-mCherry重组病毒成功表达红色荧光蛋白同时不影响流感病毒自身蛋白的表达。

[0124] 2.3VK627-mCherry重组病毒western blot检测

[0125] 为了进一步验证重组病毒表达mCherry基因的能力，将实施例1拯救的VK627-mCherry重组病毒及其亲本病毒以1MOI的剂量感染生长密度为90％的MDCK细胞，37℃条件下孵育1h后，更换为含0.2％(w/v)BSA和1μg/mL TPCK处理的胰酶的DMEM培养基，感染24h后弃掉上清，用含蛋白酶抑制剂1:100稀释的Western-Blot裂解液冰上裂解感染的细胞，用Western blot方法检测mCherry蛋白、流感NP蛋白和内参GAPDH蛋白的表达情况，以亲本病毒株作为对照。Western blot检测中分别使用10％的分离胶和5％的浓缩胶，方法如下：

[0126] H2O 1.9mL30％丙烯酰胺 17mL
1.5M Tris-HCl(pH8.8) 1.3mL
10％SDS 50μL
10％过硫酸铵 50μL
TMEMD 3μL
分离胶(组分) 20mL(10％)

[0127]

[0128]

[0129] Western blot检测结果如图4所示，VK627-mCherry重组病毒感染MDCK细胞后NS1蛋白与mCherry荧光蛋白以融合蛋白的形式表达，NP蛋白也可以正常表达。

[0130] 2.4VK627-mCherry重组病毒生长曲线的测定

[0131] 将实施例1拯救的VK627-mCherry重组病毒和亲本病毒株(VK627)以0.001MOI的剂量接种于生长密度为90％的MDCK细胞中(6孔板)，并在感染后12h、24h、48h、72h收取上清病毒，每个时间点三个重复。将不同时间点收取的病毒用免疫细胞化学法(ICC)法在MDCK细胞上测定TCID50，绘制生长曲线。比较VK627-mCherry重组病毒与亲本病毒的复制动力学，结果显示，VK627-mCherry重组病毒各个时间点的滴度稍低于亲本病毒滴度，复制能力差异不显著，如图5所示。以上结果证明NS1携带的mCherry荧光基因，不影响病毒的复制能力。

[0132] 2.5VK627-mCherry重组病毒不同MOI感染MDCK细胞检测

[0133] 将实施例1构建的VK627-mCherry重组病毒分别以0.1MOI、0.01MOI、0.001MOI感染生长密度为90％的MDCK细胞，37℃条件下培养24h。最后置于荧光显微镜下观察荧光情况，并拍照保存。不同MOI感染MDCK细胞的结果如图6所示，在同一时间内随着MOI的升高，观察到的荧光范围就越大，强度越强。

[0134] 2.6VK627-mCherry重组病毒对抗流感病毒药物的筛选

[0135] 将实施例1构建的VK627-mCherry重组病毒以0.01MOI感染铺于96孔板的MDCK细胞，37℃条件下孵育1h，孵育过程中用含有的TPCK处理的胰酶(1μg/mL)以及浓度为0.2％(w/v)BSA的DMEM培养基稀释抗流感病毒药物利巴韦林，利巴韦林药物稀释后的浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM孵育结束后，将稀释好的不同药物浓度加入细胞孔中，每个药物浓度做3个重复，37℃条件下培养48h，最后置于荧光显微镜下观察荧光情况，并拍照保存。结果如图7所示(图7中Mock为空白对照，即不感染病毒也不做药物处理；virus为药物处理空白对照，即感染病毒后不做药物处理)，随着利巴韦林药物浓度升高，VK627-mCherry重组病毒红色荧光越来越弱，当药物浓度达到50μM时，重组病毒红色荧光完全消失，说明可通过对VK627-mCherry重组病毒荧光的观察筛选有效的抗流感病毒药物及浓度。

[0136] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。