抗CD3的纳米抗体CD3/Nb29及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了抗CD3的纳米抗体CD3/Nb29及其制备方法与应用。本发明所提供的纳米抗体，包含决定簇互补区和框架区；所述纳米抗体的决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；通过本发明所公布的纳米抗体核苷酸序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于CD3分子检测试剂的研发，制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂以及制备抑制CD3活性和促进T细胞增殖的药物。

权利要求

1.纳米抗体，包含抗原决定簇互补区和框架区；其特征在于：所述纳米抗体的抗原决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；

所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第23-32位氨基酸；

所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第49-55位氨基酸；

所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第93-113位氨基酸；

所述纳米抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示。

2.与权利要求1所述纳米抗体相关的生物材料，为B1）至B12）中的任一种：B1）编码权利要求1所述纳米抗体的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；

B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；

B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；

B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物；

B9）含有B1）所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10）含有B2）所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11）含有B3）所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12）含有B4）所述重组载体的转基因动物细胞系；

所述核酸分子为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.9的cDNA分子或DNA分子。

3.权利要求1所述纳米抗体的制备方法，包括将编码权利要求1所述纳米抗体的核酸分子导入受体细胞得到表达所述纳米抗体的转基因细胞，培养所述转基因细胞，得到所述纳米抗体；

其中所述编码权利要求1所述纳米抗体的核酸分子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.9所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述受体细胞为微生物细胞。

说明书

抗CD3的纳米抗体CD3/Nb29及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学领域中抗CD3的纳米抗体CD3/Nb29及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] CD3分子是T细胞膜上的重要分化抗原,是成熟T细胞的特征性标志。它与T细胞表面受体TCR形成复合物，在细胞内信号转导过程中起着重要作用。CD3抗体可特异性地识别T细胞表面CD3分子，引起T细胞TCR-CD3复合体的交联，直接产生活化信号，导致T细胞活化并增殖。目前研究表明，CD3抗体在肿瘤治疗中有重要的作用。

[0003] 但是，抗体药物应用存在很多问题，比如研发周期长，生产成本过高；难以大规模生产；稳定性差易降解，贮存成本高；容易被污染，维护成本费用高昂；并具有免疫原性等，限制了其在临床上的应用范围。

[0004] 纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结合纳米粒子科学的概念进行的抗体工程革命，从而研发出的最新和最小的抗体分子。1993年Hamers等报道，骆驼体内存在着天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)，现已被重新命名为“纳米抗体”(nanobody，Nb)。纳米抗体具有完整功能的最小的抗原结合片段，其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，长4nm。Nb具有许多独特的性质，很适合进行基因改造，在疾病的精确诊断和靶向治疗等方面展现了广阔的应用前景。纳米抗体在化学组成和形状上比抗体简单许多，不具有化学疏水性，其抗热性和抗酸碱性更强，更容易相互结合或与其他化合物结合，能被单基因编码，容易用微生物合成。纳米抗体对环境具有良好的耐受性，具备高度的构象稳定性，而且分子质量更小，临床的治疗效果更好，同时这些小蛋白分子更容易合成，价格也更低。纳米抗体的独特的性质，使其在疾病的精确诊断和免疫靶向治疗等方面展现了更为广阔的应用前景。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是，如何制备有效治疗肿瘤的药物。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了纳米抗体。

[0007] 本发明的第一方面，提供了一种纳米抗体，称为CD3/Nb29，该纳米抗体包含决定簇互补区CDR和框架区FR；所述纳米抗体的决定簇互补区CDR由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第23-32位氨基酸；所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第49-55位氨基酸；所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第93-113位氨基酸。

[0008] 优选地，该纳米抗体的框架区FR由FR1、FR2、FR3和FR4组成；其中所述FR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第1-22位氨基酸；所述FR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第33-48位氨基酸；所述FR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第56-92位氨基酸；所述FR4的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.8的第114-124位氨基酸。

[0009] 优选地，所述纳米抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示。

[0010] 本发明也相应提供了一种CD3的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

[0011] 优选地，所述的CD3的纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

[0012] 为了使所述纳米抗体CD3/Nb29便于纯化，可在序列表中SEQ ID No.8的第1-124位氨基酸所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0013] 表1、标签的序列

[0014] 标签 残基 序列Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
HA 9 YPYDVPDYA

[0015] 本发明另外一方面，所述纳米抗体CD3/Nb29可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。所述纳米抗体CD3/Nb29的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.9所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0016] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述纳米抗体CD3/Nb29相关的生物材料。

[0017] 本发明所提供的与所述纳米抗体CD3/Nb29相关的生物材料，为B1)至B12)中的任一种：

[0018] B1)编码所述纳米抗体CD3/Nb29的核酸分子；

[0019] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

[0020] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

[0021] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

[0022] B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

[0023] B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

[0024] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

[0025] B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

[0026] B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

[0027] B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

[0028] B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

[0029] B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。

[0030] 上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0031] 上述生物材料中，B2)所述的含有编码所述纳米抗体CD3/Nb29的核酸分子的表达盒，又称为CD3/Nb29基因表达盒，是指能够在宿主细胞中表达纳米抗体CD3/Nb29的DNA，该DNA不但可包括启动纳米抗体CD3/Nb29基因转录的启动子，还可包括终止纳米抗体CD3/Nb29基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

[0032] 可用现有的表达载体构建含有所述纳米抗体CD3/Nb29基因表达盒的重组载体。

[0033] 上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

[0034] 上述生物材料中，所述重组载体可为将B1)所述核酸分子导入到pComb3中得到的重组载体。在本发明的一个实施例中，B3)所述重组载体为将所述纳米抗体CD3/Nb29的编码基因(核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.9的第1-372位核苷酸)导入pComb3中得到的重组载体pComb3-CD3/Nb29，重组载体pComb3-CD3/Nb29表达SEQ ID No.8所示的纳米抗体CD3/Nb29。

[0035] 上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

[0036] 上述生物材料中，所述转基因动物细胞系不包括繁殖材料；所述重组微生物可为将B1)所述核酸分子导入到大肠杆菌WK6中得到的重组微生物。

[0037] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的B1)所述纳米抗体CD3/Nb29的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的B1)所述纳米抗体CD3/Nb29的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码所述纳米抗体CD3/Nb29且具有纳米抗体CD3/Nb29活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

[0038] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.8所示的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

[0039] 上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。

[0040] 上述生物材料中，B1)所述核酸分子为下述1)或2)或3)：

[0041] 1)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.9的cDNA分子或DNA分子；

[0042] 2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述纳米抗体CD3/Nb29的cDNA分子或基因组DNA分子；

[0043] 3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述纳米抗体CD3/Nb29的cDNA分子或基因组DNA分子。

[0044] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述纳米抗体CD3/Nb29的衍生抗体。

[0045] 本发明所提供的所述纳米抗体CD3/Nb29的衍生抗体，为下述a)或b)或c)或d)或e)：

[0046] a)含有所述纳米抗体CD3/Nb29的单链抗体；

[0047] b)含有a)所述单链抗体的融合抗体；

[0048] c)含有所述纳米抗体CD3/Nb29的融合抗体；

[0049] d)含有所述纳米抗体CD3/Nb29的Fab；

[0050] e)含有所述纳米抗体CD3/Nb29的完整抗体。

[0051] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述纳米抗体CD3/Nb29的制备方法。

[0052] 本发明所提供的所述纳米抗体CD3/Nb29的制备方法，包括将编码所述纳米抗体CD3/Nb29的核酸分子导入受体细胞得到表达所述纳米抗体CD3/Nb29的转基因细胞，培养所述转基因细胞，得到所述纳米抗体CD3/Nb29。

[0053] 上述纳米抗体CD3/Nb29的制备方法中，所述编码所述纳米抗体CD3/Nb29的核酸分子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.9所示。

[0054] 上述纳米抗体CD3/Nb29的制备方法中，所述受体细胞可为微生物细胞，如大肠杆菌，具体可为大肠杆菌WK6。

[0055] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述A1-A8中的任一种用途：

[0056] A1、所述纳米抗体CD3/Nb29在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；

[0057] A2、所述生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；

[0058] A3、所述纳米抗体的衍生抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；

[0059] A4、所述纳米抗体CD3/Nb29的制备方法在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用；

[0060] A5、所述纳米抗体CD3/Nb29在制备抑制CD3活性或促进T细胞增殖产品中的应用；

[0061] A6、所述生物材料在制备抑制CD3活性或促进T细胞增殖产品中的应用；

[0062] A7、所述衍生抗体在制备抑制CD3活性或促进T细胞增殖产品中的应用；

[0063] A8、所述纳米抗体CD3/Nb29的制备方法在制备抑制CD3活性或促进T细胞增殖产品中的应用。

[0064] 上述产品可为药物。

[0065] 扩增编码序列表中SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或其任一片段氨基酸序列的核酸分子的引物对，也属于本发明的保护范围。

[0066] 本发明提供了一种抗CD3的纳米抗体、编码该纳米抗体的核苷酸序列及宿主细胞，以及其制备方法和应用。该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于CD3分子检测试剂的研发，制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂以及制备抑制CD3活性和促进T细胞增殖的药物。

附图说明

[0067] 图1是纳米抗体的DNA电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为2000bp的分子标记，第二孔道为CD3纳米抗体DNA电泳条带，PCR产物带约为450bp。

[0068] 图2是CD3纳米抗体CD3/Nb29经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；泳道M表示蛋白分子量Marker。

[0069] 图3A为纳米抗体CD3/Nb29与B细胞的结合实验结果；图3B为纳米抗体CD3/Nb29与T细胞的结合实验结果。

具体实施方式

[0070] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

[0071] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0072] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0073] 下述实施例中的大肠杆菌WK6经东南大学生命科学研究院万亚坤实验室同意后，公众可从广西医科大学获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

[0074] 实施例1、纳米抗体的制备

[0075] 本发明提供了来源于骆驼的1种纳米抗体，其名称为CD3/Nb29，该纳米抗体CD3/Nb29的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示，由SEQ ID No.9的核苷酸序列编码。

[0076] 纳米抗体CD3/Nb29的核苷酸电泳图如图1所示，其中第一道为2000bp的分子标记，第二孔道为CD3纳米抗体DNA电泳条带，该PCR产物带约为450bp。

[0077] 将载体pComb3(Biovector产品)的PstI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.9所示的DNA分子，其他序列均不变，得到重组载体pComb3-CD3/Nb29，pComb3-CD3/Nb29与pComb3的差别仅在于将pComb3的PstI和NotI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.9所示的DNA分子。重组载体pComb3-CD3/Nb29表达SEQ ID No.8所示的纳米抗体CD3/Nb29。将pComb3-CD3/Nb29导入大肠杆菌WK6中，得到重组菌WK6-pComb3-CD3/Nb29。

[0078] 纳米抗体的具体制备步骤如下：

[0079] (1)将WK6-pComb3-CD3/Nb29涂布在含有氨苄青霉素和葡萄糖的LB平板(LB平板中，氨苄青霉素和葡萄糖的浓度分别为100μg/mL和20mg/mL)上，37℃培养过夜(12小时)；

[0080] (2)挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液(LB培养液中，氨苄青霉素的浓度为100μg/mL)中，37℃摇床培养过夜(12小时)；

[0081] (3)取1mL步骤(2)培养过夜的培养液接种至330mL TB培养液中，37℃摇床培养至OD值达到0.6-1时，加入IPTG，得到WK6-pComb3-CD3/Nb29培养液，使WK6-pComb3-CD3/Nb29培养液中IPTG的浓度为1mM，将WK6-pComb3-CD3/Nb29培养液在28℃下于摇床(摇床的转速为220rpm)上培养过夜(12小时)，得到WK6-pComb3-CD3/Nb29诱导液；

[0082] (4)将步骤(3)的WK6-pComb3-CD3/Nb29诱导液于4℃下离心，收集菌体；

[0083] (5)利用文献(Zhu M,Hu Y,Li G,Ou W,Mao P,Xin S,Wan Y:Combining magnetic nanoparticle with biotinylated nanobodies for rapid and sensitive detection of influenza H3N2.Nanoscale Res Lett 2014,9:528.)中的渗透法，获得抗体粗提液；具体步骤为：收集步骤(4)含有菌体的菌液，在6000rpm离心20min，菌体沉淀后弃去上清，在菌体沉淀中加入4-5ml裂解液(20毫升细胞裂解液配方:40μL 0.5M EDTA(PH8.0)，4ml 10％SDS，1ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96ml蒸馏水)，250rpm，4℃裂解2h，得到裂解混合液。随后再加入与裂解混合液的体积比为4:1的裂解液，在4℃裂解2h。再在4000rpm离心30min，收集上清裂解液。

[0084] (6)利用文献(Zhu M,Hu Y,Li G,Ou W,Mao P,Xin S,Wan Y:Combining magnetic nanoparticle with biotinylated nanobodies for rapid and sensitive detection of influenza H3N2.Nanoscale Res Lett 2014,9:528.)中的镍柱离子亲和层析法制备纳米抗体CD3/Nb29。具体为:将步骤(5)裂菌后收集到的上清裂解液，每管加入氯化镁600μL混匀后，加入1.5ml镍磁珠混匀后，4℃震荡结合1h。倒入层析柱，先用PBS清洗至镍珠颜色变蓝，然后用20mM的咪唑洗2个柱体积，如果镍柱脏，可以增加至3个柱体积。用2ml 50mM的咪唑洗一次，用1ml 100mM的咪唑洗一次，加入1ml 500mM的咪唑，放置10min，收集蛋白；再加入2ml 500mM的咪唑，放置10min，收集蛋白；再加入1ml 500mM的咪唑，放置10min，收集蛋白。把三次收集的蛋白混合即为蛋白粗提液。蛋白粗提液放入超滤离心管，反复用PBS洗涤蛋白粗提液，至咪唑浓度为1mM。超滤管上蛋白就是制得的纳米抗体CD3/Nb29。

[0085] 纳米抗体CD3/Nb29的SDA-PAGE电泳图分别如图2。结果显示，上述方法得到的纳米抗体CD3/Nb29的纯度达到90％以上。

[0086] 实施例2、纳米抗体与CD3结合率的测定

[0087] 纳米抗体CD3/Nb29与CD3结合率测定(直接法)

[0088] 从健康志愿者人外周血细胞中分离T细胞和B细胞，将实例1的纳米抗体CD3/Nb29(1μg)分别加入1×106个上述T细胞和B细胞中4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次后，加入5μl PE anti-HA tag antibody(abcam，Clone:20B12)4℃孵育30min，PBS洗涤2次后，将样品上BACKMAN流式细胞仪，结果如图3A，3B所示。图3A是空白对照和CD3纳米抗体CD3/Nb29分别与B细胞的结合百分率；图3B是空白对照和CD3纳米抗体CD3/Nb29分别与T细胞的结合百分率；图3A和3B中横轴为荧光强度(PE)，纵轴为数量百分比(％of Max)，S2代表空白对照，S1代表CD3纳米抗体CD3/Nb29。图示结果可以看出CD3纳米抗体CD3/Nb29能够很好的与T细胞结合，结合率高达67.9％。

[0089] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。