一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体公开一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法。本发明通过在使用包含植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质的发酵培养基，对桔青霉进行半连续发酵，制备获得含有核酸酶P1的发酵液。该本发明方法单批发酵时间由56h缩短至20h，酶活由2500U/mL提高至7100‑7500U/mL。本发明所用的产酶促进剂添加量少，成本低，操作简单，效果明显。

权利要求

1.一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法，其特征在于，使用包含植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质的发酵培养基，利用桔青霉进行半连续发酵，制备获得含有核酸酶P1的发酵液；

其中，所述的桔青霉为CGMCC No.2014；

其中，所述的植酸类化合物为植酸钙镁和植酸锌的两种组合物；

其中，所述的表面活性剂为吐温80和司盘80的两种组合物；

其中，所述的核酸类物质为RNA；

其中，发酵培养基中表面活性剂总浓度为1g/L；植酸类化合物的总浓度为0.3g/L；核酸类物质总浓度为0.5g/L。

2.根据权利要求1所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的组分如下：葡萄糖0.5～50g/L，蛋白胨0.05～5g/L，磷酸二氢钾0.01～5g/L，磷酸氢二钾0.01～5g/L，硫酸镁0.01～5g/L，氯化钙0.01～5g/L，植酸类化合物0.3g/L，表面活性剂1g/L，核酸类物质0.5g/L，溶剂为水，pH5～8。

3.根据权利要求1所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法，其特征在于，所述的半连续发酵，其发酵温度为30℃，单批发酵时间为20h。

4.根据权利要求1所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法，其特征在于，所述的含有核酸酶P1的发酵液的酶活为7100～7500U/mL。

说明书

一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法。

背景技术

[0002] 5'-核苷酸已广泛应用于食品、生化工业以及制药工业。在食品行业中，己经由最初的食品助鲜剂，扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食品添加剂，可以添加在面包、饼干等食品中，尤其在婴幼儿食品中的使用效果非常明显，能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力，减少腹泻的发生；在医药领域，5'-核苷酸不但能够作为药物使用，而且还是许多抗病毒抗肿瘤药物的生产原料；此外，核苷酸制剂还可以作为动植物生长调节剂，有着明显的增产、增重功效。

[0003] 核苷酸生产主要采取三种方法：化学合成法、微生物发酵法及酶解法。酶解法由于降解RNA可以一次得到四种核苷酸的混合物，且酶反应收率较高，国内外工业化生产核苷酸均采用此法。在酶解法制备核苷酸中所需的酶是核酸酶Pl，它是一种能够水解RNA获得四种5'-核苷酸的磷酸二酯酶，其酶解产物杂质少后续分离工艺简单，国外一般采用该方法进行核苷酸的生产。

[0004] 桔青霉属于不对称青霉组，绒状青霉亚组，桔青霉系，是核酸酶P1的重要生产菌种。国内外生产核酸酶P1主要通过桔青霉液体深层发酵，现有方法方法耗时较长酶活较低。如何高效的生产核酸酶P1，降低生产成本，已成为核苷酸生产的首要任务。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是针对现有技术存在的不足，提供一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

[0007] 一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法，其使用包含植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质的发酵培养基，利用桔青霉进行半连续发酵，制备获得含有核酸酶P1的发酵液。

[0008] 其中，所述的桔青霉为CGMCC No.2014，该菌株记载在中国专利CN101067116A中。

[0009] 其中，所述的植酸类化合物为植酸钙镁、植酸钾和植酸锌中的任意一种或多种，优选植酸钙镁和植酸锌中的任意一种或两种组合，发酵培养基中植酸类化合物总浓度为0.001～1g/L，优选0.1～0.8g/L，更优选0.1～0.3g/L。

[0010] 其中，所述的表面活性剂为吐温80、吐温60和司盘80的任意一种或多种，优选吐温80和司盘80中的任意一种或两种组合，发酵培养基中表面活性剂总浓度为0.001～5g/L，优选0.1～3g/L，更优选0.5～2g/L。

[0011] 其中，所述的核酸类物质为RNA、DNA和核苷酸的任意一种或多种，优选RNA和核苷酸中的任意一种或两者组合，更优选RNA，发酵培养基中核酸类物质总浓度为0.001～5g/L，优选0.1～3g/L，更优选0.5～2g/L。

[0012] 其中，所述的发酵培养基组分如下：葡萄糖0.5～50g/L，蛋白胨0.05～5g/L，磷酸二氢钾0.01～5g/L，磷酸氢二钾0.01～5g/L，硫酸镁0.01～5g/L，氯化钙0.01～5g/L，植酸类化合物0.001～1g/L，表面活性剂0.001～5g/L，核酸类物质0.001～5g/L，溶剂为水，pH5～8；

[0013] 其中，所述的发酵培养基组分优选如下：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，植酸钙镁0.2g/L，植酸锌0.1g/L，Tween-80 0.5g/L，司盘-80 0.5g/L，RNA 0.5g/L，pH6，溶剂为水。

[0014] 其中，所述的半连续发酵为桔青霉在发酵罐中发酵一段时间，开始周期性地放出部分含有产物的发酵液，然后再补加相同体积的新鲜培养基的发酵方法，具体方法：a，桔青酶在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7100-7500U/mL左右；b，放出发酵液体积80％，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，向发酵罐补加相同体积无菌发酵培养基继续培养，发酵20个小时左右酶活稳定在7100-7500U/mL左右；c，重复上述步骤b，如此循环补料5次，停止半连续发酵。

[0015] 其中，所述的含有核酸酶P1的发酵液的酶活为7100～7500U/mL。

[0016] 本发明中，核酸酶P1酶活定义：将1.9mL的底物溶液(含有浓度为1％左右的RNA；0.2M pH5.2的醋酸缓冲液以0.0005M的ZnSO4)于70℃恒温水浴10min后，加入0.1mL经适当稀释的酶液，70℃保温15min后加入2.0mL核酸沉淀剂(0.25％钼酸铵-2.5过氯酸)，冰水浴
20min后离心、取上清液用蒸馏水稀释一定倍数，测定其260nm处的吸光值为A260。以先加沉淀剂者作为对照，其它操作同前。在上述条件下，每分钟所生成的核苷酸量在260nm处的吸光值的差值为1.0时定义为1个酶活力单位。

[0017] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下技术优势：

[0018] 本发明通过添加植酸类化合物、表面活性剂类物质和核酸类物质进行发酵，单批发酵时间由56h缩短至20h，酶活由2500U/mL提高至7100-7500U/mL。该方法可以显著的缩短发酵工时提高发酵酶活，所用的产酶促进剂添加量少，成本低，操作简单，效果明显，减少生产成本。

具体实施方式

[0019] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

[0020] 实施例1：

[0021] 发酵培养基的配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，植酸钙镁0.2g/L，植酸锌0.1g/L，Tween-80 0.5g/L，司盘-80 0.5g/L，RNA 0.5g/L，pH6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0022] 半连续发酵：10L搅拌罐中装入6L培养基，灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养，在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7300U/mL左右，放出发酵液体积4.8L，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，配制
4.8L发酵培养基打入发酵罐再次培养，20h后酶活稳定至7300U/mL，再次放出4.8L发酵液，同样方法补入4.8L新鲜培养基。如此循环补料5次，酶活均在7300U/mL左右，停止半连续发酵。

[0023] 对比例1：

[0024] 发酵培养基的配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，pH 6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0025] 半连续发酵同实施例1。用培养条件发酵，但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质，56h后酶活稳定至4100U/mL，放出4.8L发酵液，同样方法补入4.8L新鲜培养基。发酵55h，酶活稳定在2650U/mL，停止半连续发酵。

[0026] 实施例2：

[0027] 发酵培养基的配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，植酸钙镁0.2g/L，植酸锌0.1g/L，Tween-80 0.5g/L，司盘-80 0.5g/L，RNA0.5g/L，pH6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0028] 半连续发酵：100L搅拌罐中装入60L培养基，灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养，在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7400U/mL左右，放出发酵液体积48L，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，配制48L发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至7480U/mL，再次放出48L发酵液，同样方法补入48L新鲜培养基。如此循环补料5次，酶活均在7340U/mL左右，停止半连续发酵。

[0029] 对比例2：

[0030] 发酵培养基的配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，pH 6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0031] 半连续发酵同实施例2。用培养条件发酵，但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质，56h后酶活稳定至4170U/mL，放出48L发酵液，同样方法补入48L新鲜培养基。发酵55h，酶活稳定在3730U/mL，第2次补料发酵58h后酶活明显下降，只有2540U/mL，停止半连续发酵。

[0032] 实施例3：

[0033] 发酵培养基的配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，植酸钙镁0.2g/L，植酸锌0.1g/L，Tween-80 0.5g/L，司盘-80 0.5g/L，RNA 0.5g/L，pH6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0034] 半连续发酵：1000L搅拌罐中装入600L培养基，灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养，在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7500U/mL左右，放出发酵液体积480L，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，配制
480L发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至7500U/mL，再次放出480L发酵液，同样方法补入480L新鲜培养基。如此循环补料5次，酶活均在7500U/mL左右，停止半连续发酵。

[0035] 对比例3：

[0036] 发酵培养基的配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，pH 6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0037] 半连续发酵同实施例3。用培养条件发酵，但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质，56h后酶活稳定至4220U/mL，放出480L发酵液，同样方法补入480L新鲜培养基。发酵55h，酶活稳定在2690U/mL，停止半连续发酵。

[0038] 实施例4：

[0039] 发酵培养基的配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，植酸钙镁0.2g/L，植酸锌0.1g/L，Tween-80 0.5g/L，司盘-80 0.5g/L，RNA 0.5g/L，pH6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0040] 半连续发酵：2000L搅拌罐中装入1200L培养基，灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养,在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7480U/mL左右，放出发酵液体积960L，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，配制960L发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至7380U/mL，再次放出960L发酵液，同样方法补入960L新鲜培养基。如此循环补料5次，酶活均在7410U/mL左右，停止半连续发酵。

[0041] 对比例4：

[0042] 发酵培养基的配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，pH 6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0043] 半连续发酵同实施例4。用培养条件发酵，但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质，56h后酶活稳定至4190U/mL，放出960L发酵液，同样方法补入960L新鲜培养基。发酵55h，酶活稳定在3830U/mL，第4次补料发酵58h后酶活明显下降，只有2440U/mL，停止半连续发酵。

[0044] 实施例5：

[0045] 发酵培养基的配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，植酸钙镁0.2g/L，植酸锌0.1g/L，Tween-80 0.5g/L，司盘-80 0.5g/L，RNA 0.5g/L，pH6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0046] 半连续发酵：20T搅拌罐中装入12T培养基，灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养,在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7500U/mL左右，放出发酵液体积9.6T，发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子，配制
9.6T发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至7500U/mL，再次放出9.6T发酵液，同样方法补入9.6T新鲜培养基。如此循环补料5次，酶活均在7500U/mL左右，停止半连续发酵。

[0047] 对比例5：

[0048] 发酵培养基的配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，pH 6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0049] 半连续发酵同实施例5。用培养条件发酵，但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质，56h后酶活稳定至4170U/mL，放出9.6T发酵液，同样方法补入9.6T新鲜培养基。发酵55h，酶活稳定在3610U/mL，第3次补料发酵58h后酶活明显下降，只有2640U/mL，停止半连续发酵。

[0050] 实施例6：

[0051] 发酵培养基的配制：葡萄糖50g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氢钾4.8g/L，磷酸氢二钾4.5g/L，硫酸镁3.4g/L，氯化钙3.8g/L，植酸钙镁0.02g/L，植酸钾0.07g/L，Tween-80 
0.05g/L，司盘-80 0.005g/L，RNA 0.05g/L，pH6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0052] 半连续发酵同实施例3。

[0053] 实施例7：

[0054] 发酵培养基的配制：葡萄糖10g/L，蛋白胨0.96g/L，磷酸二氢钾3.1g/L，磷酸氢二钾3.6g/L，硫酸镁0.9g/L，氯化钙5.0g/L，植酸钙镁0.52g/L，植酸钾0.37g/L，Tween-60 0.75g/L，司盘-80 1.5g/L，核苷酸3.5g/L，pH6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0055] 半连续发酵同实施例1。

[0056] 实施例8：

[0057] 发酵培养基的配制：葡萄糖15g/L，蛋白胨1.5g/L，磷酸二氢钾4.1g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，硫酸镁4g/L，氯化钙2.1g/L，植酸钙镁0.33g/L，植酸锌0.26g/L，Tween-60 0.75g/L，司盘-80 0.5g/L，DNA 0.5g/L，pH6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。

[0058] 半连续发酵同实施例5。

[0059] 从实施例1～5与对比例1～5的结果可以看出，本发明通过添加植酸类化合物、表面活性剂类物质和核酸类物质进行发酵，单批发酵时间由56h缩短至20h，酶活由2500U/mL提高至7100～7500U/mL。且该方法可以显著的缩短发酵工时提高发酵酶活，所用的产酶促进剂添加量少，成本低，操作简单，效果明显，减少生产成本。