一种乙酰羟酸合成酶及其应用

摘要

本发明涉及一个解除L‑异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶及其应用，属于代谢工程领域。本发明所述ilvBNM基因编码的乙酰羟酸合成酶具有如下特点：该酶在解除了L‑异亮氨酸对其的反馈抑制作用，在L‑异亮氨酸浓度为0‑12mmol/L条件下，ILVBNM酶活性无明显变化，且其活性较野生型ilvBN编码的乙酰羟酸合成酶未见明显降低，可应用于L‑异亮氨酸中的生产。

权利要求

1.一种乙酰羟酸合成酶，其特征在于，所述乙酰羟酸合成酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述乙酰羟酸合成酶的编码基因。

3.权利要求2所述的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID No.2所示。

4.权利要求1所述乙酰羟酸合成酶在生产L-异亮氨酸中的应用。

说明书

一种乙酰羟酸合成酶及其应用

技术领域：

[0001] 本发明涉及一个解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶及其应用，属于代谢工程领域。背景技术：

[0002] L-异亮氨酸属于分支链氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一。L-异亮氨酸是合成人体激素和酶的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的作用，在人体生命活动中扮演着至关重要角色。因此，L-异亮氨酸在食品和医药等行业具有非常广泛的市场及应用前景。

[0003] L-异亮氨酸的合成方法有提取法、化学合成法和发酵法。工业化生产主要采用毛发提取法和发酵法合成L-异亮氨酸。由于提取法具有原料来源受限制、生产成本高、污染环境等不足，目前主要采用发酵法生产L-异亮氨酸。目前，L-异亮氨酸的工业生产菌种主要由诱变获得，具有营养缺陷、生长慢、遗传性状不稳定等不足，从而引起发酵周期长、发酵性能不稳定、产量和转化率低等问题。发明内容：

[0004] 为了克服目前野生型乙酰羟酸合成酶受L-异亮氨酸反馈抑制的不足，本发明提供一种解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶突变体及其编码基因及其应用。

[0005] 本发明解决述问题的技术方案之一是：提供一个解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶突变体，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述乙酰羟酸合成酶突变体的编码基因为ilvBNM，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

[0006] 所述乙酰羟酸合成酶突变体来自一株谷氨酸棒杆菌突变株，所述突变株筛选过程如下：以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/Lα-氨基丁酸的基本培养基上筛选出菌株ILE396；以ILE396为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/L硫代异亮氨酸的基本培养基上筛选出菌株ILE693。

[0007] 提取ILE693基因组，通过设计引物进行PCR扩增乙酰羟酸合成酶编码基因，将PCR产物回收后进行测序，发现该基因编码的乙酰羟酸合成酶相对于来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的野生型乙酰羟酸合成酶发生如下氨基酸突变：K30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H673L。

[0008] 在本发明中采用如下定义：

[0009] 1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法

[0010] 使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

[0011] 2、乙酰羟酸合成酶突变体的标识

[0012] 采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示乙酰羟酸合成酶突变体中突变的氨基酸。如K30Q，表示位置30的氨基酸由野生型乙酰羟酸合成酶的Lys替换成Gln，K30表示第30位的氨基酸为Lys，位置的编号对应于SEQ ID NO.3中野生型乙酰羟酸合成酶的氨基酸序列编号。

[0013] 本发明中，ilvBN代表野生型乙酰羟酸合成酶编码基因(SEQ ID NO.4所示)，ILVBN代表野生型乙酰羟酸合成酶(SEQ ID NO.3所示)；ilvBNM为乙酰羟酸合成酶突变体基因(SEQ ID NO.2所示)；ILVBNM为乙酰羟酸合成酶突变体(SEQ ID NO.1所示)。突变前后的氨基酸对照如下表：

[0014]乙酰羟酸合成酶 氨基酸
ILVBN K30，A84，G128，A226，K227，Y252，T362，H673
ILVBNM K30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H673L

[0015] 所述乙酰羟酸合成酶突变体ILVBNM，具有如下酶学特性：在L-异亮氨酸浓度为0-12mmol/L条件下，ILVBNM酶活性无明显变化，即该突变体解除了L-异亮氨酸对其反馈抑制M
作用；且在L-异亮氨酸浓度为0-12mmol/L条件下，ILVBN的酶活性与野生型乙酰羟酸合成酶ILVBN相比无降低。

[0016] 本发明还提供乙酰羟酸合成酶突变体ILVBNM在生产L-异亮氨酸中的应用。

[0017] 有益效果：

[0018] 1、本发明所述ilvBNM基因编码的乙酰羟酸合成酶具有如下特点：该酶在解除了L-异亮氨酸对其的反馈抑制作用(图1)，在L-异亮氨酸浓度为0-12mmol/L条件下，ILVBNM酶活性无明显变化，且其活性较野生型ilvBN编码的乙酰羟酸合成酶未见明显降低(图2)。附图说明：

[0019] 图1 L-异亮氨酸对ilvBN和ilvBNM基因编码的乙酰羟酸合酶活性的影响；

[0020] 图2 ilvBNM与ilvBN编码的乙酰羟酸合酶活性对比；具体实施方式：

[0021] 为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

[0022] 实施例1：解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBNM的获得[0023] (1)抗L-异亮氨酸结构类似物突变株的筛选

[0024] ①谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032菌悬液的制备[0025] 将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032接种至LB液体培养基，于32℃，200rpm，培养12h，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤3次后重悬，使得OD600＝0.6-0.8，取10μL菌悬液涂在载片上。

[0026] ②常压室温等离子诱变

[0027] 诱变参数为：载片置于气流端口2mm处，功率120W，气流量10SLM，作用时间25s。

[0028] ③抗L-异亮氨酸结构类似物α-氨基丁酸突变株的筛选

[0029] 将步骤②诱变后的菌悬液涂布在含50mg/L α-氨基丁酸的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。

[0030] ④菌株产L-异亮氨酸能力测定

[0031] 将步骤③筛选的菌株利用种子培养基进行96孔板培养，然后以10％的接种量接种至含发酵培养基的96孔板进行发酵实验，ILE396的L-异亮氨酸产量最高。

[0032] ⑤抗L-异亮氨酸结构类似物硫代异亮氨酸突变株的筛选及产L-异亮氨酸能力测定

[0033] 以ILE396为诱变对象，重复步骤①和②，将诱变后的菌悬液涂布在含50mg/L硫代异亮氨酸的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。重复步骤④，ILE693的L-异亮氨酸产量最高。

[0034] ⑥培养基

[0035] 种子培养基：葡萄糖25g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO45g/L，KH2PO42g/L，MnSO4 0.6g/L，玉米浆40mL，pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。

[0036] 发酵培养基(g/L)：葡萄糖80g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，MnSO40.015g/L，VB1 0.001g/L，玉米浆30mL。pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌
15min。

[0037] ⑦检测方法

[0038] 将发酵液于8000g离心5min后取上清液，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对其进行衍生反应，采用高效液相色谱测定L-异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(15mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm，根据高效液相法的测定结果，根据与标准品出峰时间及峰面积对比，确定L-异亮氨酸产量。

[0039] (2)解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBNM突变体的获得[0040] 提取ILE693基因组，利用引物ilvBN-1和ilvBN-2进行PCR扩增，PCR条件为：94℃5min 1个循环，94℃30s、56℃30s、72℃1min 30个循环，72℃10min 1个循环，反应体系为
100μL。取10μL PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR扩增的目的片段回收后连接至pMDTM 18-T Vector并转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中，然后涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养上，于37℃倒置培养24h。挑取3个单克隆，提取重组质粒并测定其序列。

[0041] 测序结果表明，与野生型ilvBN相比，突变后基因编码的乙酰羟酸合成酶发生了K30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H673L突变，将该突变体命名为ILVBNM，编码基因命名为ilvBNM。

[0042] (3)乙酰羟酸合成酶突变体ILVBNM与野生型乙酰羟酸合成酶ILVBN的酶学性质比较

[0043] 分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032和ILE693基因组为模板，利用引物IV-1和IV-2进行PCR扩增，产物回收后连接至经BamH I酶切的pET-His质粒，然后转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，获得菌株E.coli-ilvBN和E.coli-ilvBNM。利用IPTG对E.coli-ilvBN和E.coli-ilvBNM诱导表达重组蛋白ILVBN和ILVBNM，收集菌体，用100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.8)重悬后进行超声破碎并离心后取上清液。

[0044] ILVBNM和ILVBN的酶活性测定方法如下：取100μL上述上清液至1mL磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 7.8含100mmol/L丙酮酸钠、100mmol/L 2-酮丁酸、10mmol/LMgCl2，0.2mmol/L焦磷酸硫胺素)，于37℃反应1h后，加入100μL硫酸(3mol/L)，并于65℃处理15min以终止反应。将上述反应液与1mL 0.5％肌酸和1mLα-萘酚溶液(含2.5mol/LNaOH)混合，于
65℃处理20min后冷却取室温，利用分光光度测定2-酮基-2-羟基丁酸生成量(OD525)。结果如图2所示，ILVBNM和ILVBN的活性分别为16.7和16.9nmol/(min·mg总蛋白)，二者无明显差异。

[0045] L-异亮氨酸对ILVBNM和ILVBN的酶活性影响测定方法如下：向上述反应液中分别加入0、2、4、6、8、10、12mmol/LL-异亮氨酸，然后测定2-酮基-2-羟基丁酸生成量，以考察ILVBNM解除L-异亮氨酸的反馈抑制作用。将L-异亮氨酸添加浓度为0时的酶活性定义为M100％，其余L-异亮氨酸浓度条件下的ILVBN 和ILVBN的酶活性与之相比即为相对酶活性。
结果如图1所示，ILVBN的相对酶活性随L-异亮氨酸浓度增加迅速降低，L-异亮氨酸浓度高于8mmol/L时，几乎无活性，表明该酶受L-异亮氨酸反馈抑制作用；而突变体ILVBNM的相对活性随L-异亮氨酸浓度的增加无明显变化，表明其解除了L-异亮氨酸的反馈抑制作用。

[0046] 综合以上结果，乙酰羟酸合成酶突变体ILVBNM解除了L-异亮氨酸的反馈抑制作用，同时其活性较野生型ILVBN相比未见降低。

[0047] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。