水稻灰褐叶色突变GBL1基因及其应用

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及水稻灰褐叶色突变GBL1基因及其应用，所述突变GBL1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，与野生型相比，突变GBL1基因在LOC_Os01g56400第1内含子的第一个碱基发生了G到A的碱基替换，导致LOC_Os01g56400第1外显子最后20个碱基被切除，从而引起移码突变。该基因可导致水稻在苗期叶片出现严重白化且有不同程度的褐色斑点，抽穗期叶片呈白色条纹，成熟期叶片呈灰褐叶色，可应用于水稻叶色性状的分子育种中，育种出极具观赏价值的观赏型水稻。

权利要求

1.水稻灰褐叶色突变GBL1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述水稻灰褐叶色突变GBL1基因的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的水稻灰褐叶色突变GBL1基因在筛选调节水稻叶色性状的促进剂或拮抗剂中的应用。

4.权利要求1所述的水稻灰褐叶色突变GBL1基因在水稻灰褐叶色性状的分子育种中的应用。

说明书

水稻灰褐叶色突变GBL1基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及水稻灰褐叶色突变GBL1基因及其应用。

背景技术

[0002] 观光休闲农业的极速发展对观赏型水稻需求日益增加，为拓展水稻功能、提高水稻经济效益、发展乡村旅游、助力“乡村振兴”、满足人们对彩色叶片观赏水稻的需要，发现一些稳定遗传、极具观赏价值的水稻叶色突变具有非常重要的意义。

[0003] 目前报道的水稻叶色突变体，主要有黄绿叶突变体、白化突变体和白化转绿突变体。其中，黄绿叶突变体主要与叶绿素合成缺陷有关，农艺性状相对较好，有一定的产量(赵绍路等，2018)；白化突变体多与质体的发育有关，严重的苗期致死，无法做观赏稻使用；白化转绿突变体一般在苗期白化，随着生育后期温度的提高，叶色逐渐恢复正常，也具有一定的观赏价值(贺治洲等，2014)。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的在于提供一种水稻灰褐叶色突变GBL1基因，该基因苗期叶片出现严重白化且有不同程度的褐色斑点，抽穗期叶片呈白色条纹，成熟期则转为灰褐叶色，提前衰老。

[0005] 本发明的另一个目的在于提供水稻灰褐叶色突变GBL1基因编码的蛋白。

[0006] 本发明的再一个目的在于提供水稻灰褐叶色突变GBL1基因的应用。

[0007] 为了实现上述目的，本发明利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼型恢复系缙恢10号(Jin10)的种子，获得了一个灰褐叶色突变体(命名为gbl1)，该灰褐叶色突变体gbl1表现为苗期叶片出现严重白化且有不同程度的褐色斑点，抽穗期叶片呈白色条纹，成熟期则转为灰褐叶色，提前衰老。遗传分析和分子标记定位结果显示，该突变性状由一对隐性基因(命名为GBL1)控制，该隐形基因位于水稻第1染色体RM11722和Ind1之间约92kb的物理范围内。

[0008] 在上述基因定位的基础上，本发明扩大定位样本进行精细定位，最终将GBL1精细定位在Ind4和Ind3之间23kb的物理范围内，然后，通过基因预测和对比分析，初步确定LOC_Os01g56400、LOC_Os01g56380、LOC_Os01g56390、LOC_Os01g56400、LOC_Os01g56410、LOC_Os01g56420可能为GBL1的候选基因；随后，对5个候选基因进行测序，初步确定LOC_Os01g56400为GBL1的候选基因，突变GBL1基因与野生型相比，LOC_Os01g56400在第1内含子的第1个碱基发生了G到A的碱基替换，导致LOC_Os01g56400第1外显子最后20个碱基被切除，从而引起移码突变。突变的GBL1基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，编码一个具有273个氨基酸的蛋白质，编码的蛋白质具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，通过对蛋白结构的分析预测，结果表明突变GBL1基因编码的蛋白质为ABC转运蛋白。

[0009] 进一步从野生型缙恢10号中克隆了LOC_Os01g56400的全长基因组序列，构建植物表达载体，转化突变体gbl1。结果发现，转基因中LOC_Os01g56400的转录本恢复正常，其植株表型也得到恢复，结果进一步确认LOC_Os01g56400就是GBL1。

[0010] 进一步从野生型缙恢10号中克隆了LOC_Os01g56400的全长CDS序列，构建超表达载体，转化突变体gbl1。结果发现，转基因植株的叶色恢复成了正常的绿色，除此之外，表型未发现明显改变，结果进一步确认LOC_Os01g56400就是GBL1。

[0011] 本发明还公开了一种含有上述水稻灰褐叶色突变GBL1基因的核苷酸序列的载体。

[0012] 本发明还公开了一种含有上述载体或其染色体中整合有外源的上述水稻灰褐叶色突变GBL1基因的核苷酸序列的细胞。

[0013] 优选地，所述细胞包括农杆菌细胞。

[0014] 本发明还公开了水稻灰褐叶色突变GBL1基因在筛选调节水稻叶色性状的促进剂或拮抗剂中的应用。

[0015] 本发明还公开了水稻灰褐叶色突变GBL1基因在观赏性水稻品种选育中的应用。

[0016] 进一步地，本发明还公开了水稻灰褐叶色突变GBL1基因在水稻灰褐叶色性状的分子育种中的应用。

[0017] 本发明的有益效果为：本发明提供了水稻灰褐叶色突变GBL1基因，该基因苗期叶片出现严重白化且有不同程度的褐色斑点，抽穗期叶片呈白色条纹，成熟期则转为灰褐叶色，提前衰老，为观赏性水稻的选育提供了有力的工具。

附图说明

[0018] 图1为突变体gbl1和野生型WT的田间表型鉴定结果；

[0019] 其中，A为4叶期WT和gbl1的表型；B为图A箭头所指野生型W和突变体gbl1的叶片；C为图B方框中叶片的放大；D为分蘖前期WT的表型；E为分蘖前期gbl1的表型；F为灌浆后期WT的表型；G为灌浆后期gbl1的表型；H为分蘖前期WT和gbl1的光合色素含量；I为灌浆后期WT和gbl1的光合色素含量。

[0020] 图2为GBl1的图位克隆结果；

[0021] 其中，A为GBl1基因的精细定位；B为GBl1候选基因的测序鉴定；C为候选基因LOC_Os01g56400的剪切变化；D为互补转基因植株；E为互补转基因植株对应的叶片；F为GBl1剪切模式恢复。

[0022] 图3为GBl1的超表达结果；

[0023] 其中，A为超表达植株的苗期植株表型；B为超表达植株的叶色；C：超表达植株中目的基因GBL1的表达量。

[0024] 图4为GBL1编码蛋白的二级结构；

[0025] 图5为GBl1在水稻各组织中的表达结果；

[0026] 其中，A为GBl1在水稻各组织中的RT-PCR分析；B为GBl1在水稻各组织中的qRT-PCR分析；C、D、E、F和G分别为GBl1在根、茎、叶、叶鞘和SAM中的GUS染色，R为根，C为茎秆，L为叶片，S为叶鞘，SAM为茎尖分生组织。

[0027] 图6为分蘖期野生型WT和突变体gbl1叶肉细胞的透射电镜观察结果；

[0028] 其中，A为分蘖期野生型和gbl1的植株；B为分蘖期野生型和gbl1的叶片；其中，WT为野生型，gbl1为突变体；a为野生型叶肉细胞(B图a部位的透射电镜观察)，1为a图1的放大，1-1则为1图1-1的放大；b和c为突变体叶肉细胞(B图b部位的透射电镜观察)，2-1和3-1分别为图b-2和c-3的放大；g为基粒片层。

[0029] 图7为温差对gbl1的突变表型的影响结果；

[0030] 其中，A为培养条件为30℃下光照14h和22℃下暗处理10h；B为培养条件为30℃下光照14h和24℃下暗处理10h；C为培养条件为30℃下光照14h和26℃下暗处理10h。

[0031] 图8为硫酸亚铁对gbl1的突变表型的影响结果；

[0032] 其中，CK、50μM、200μM、350μM和500μM分别表示外源FeSO4的处理浓度对应的突变体表型，其中CK为0处理。

具体实施方式

[0033] 下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

[0034] 实验方法：

[0035] 1.水稻基因组DNA的简易提取——碱煮法

[0036] 本发明中，基因定位群体DNA的提取采用碱煮法进行，该方法的关键是取幼嫩叶片，DNA提取完毕后要尽快PCR扩增和电泳分析，如不能立即PCR扩增，应置于-20℃冰箱长期保存。具体方法如下：

[0037] (1)叶片和离心管对等编号，取1cm2左右的鲜嫩叶片，剪成1-2mm2的碎片，放入0.5mL的离心管中；

[0038] (2)加100μL 0.125mol/L的NaOH；

[0039] (3)沸水浴30s后取出；

[0040] (4)加100μL 0.125mol/L的HCl和50μL 0.125mol/L的Tris-HCl，沸水煮2min终止反应；

[0041] (5)自然冷却后溶液可直接作为定位的模板，如不立即使用，则盖好盖子保存在-20℃冰箱中备用。

[0042] 2.水稻基因组DNA的提取——CTAB法

[0043] 本发明中，候选基因测序和载体构建过程中DNA的提取均采用改良的CTAB法进行提取，具体方法如下：

[0044] (1)称取1g左右的水稻幼嫩叶片，剪碎后放入直径10cm的研钵内，加入液氮没过叶片，迅速研磨至粉末，主要研磨过程中应佩戴线手套，以免冻伤；

[0045] (2)将研磨好的叶片粉末转移至预先做好标记的10mL离心管中，加入4mL已65℃预热的CTAB提取缓冲液，65℃再温浴45min，每15min颠倒混匀1次；

[0046] (3)取出离心管，加入4mL氯仿:异戊醇(24:1)，颠倒混匀，抽提20min，期间每5min颠倒混匀1次(注：该过程应对离心管的重量调整一致，不足者用氯仿:异戊醇补足，以便离心时保持平衡)。

[0047] (4)6,000rpm离心15min，将上清液转移至一新的预先做好标记的10mL离心管中(注：为避免吸入杂质和保持离心管平衡，统一吸取了3mL)，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，可观察到白色絮状物，即为基因组DNA。

[0048] (5)勾出絮状沉淀，放入盛有1mL 75％乙醇的1.5mL离心管中，上下颠倒，弃乙醇，重复洗涤3次(注：弃乙醇时应小心操作，以免絮状物漏出)；

[0049] (6)真空干燥仪彻底干燥(无乙醇)后，加入500μL超纯水充分溶解，直至呈透明状无沉淀；

[0050] (7)加入15μL RNase A贮存液，37℃保温60min；

[0051] (8)RNA彻底降解后，加入500μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分混匀，10,000rpm离心10min；

[0052] (9)吸取上清液450μL至一新的预先标记的1.5mL离心管中，加入450μL氯仿/异戊醇(24:1)混匀，10,000rpm离心10min；

[0053] (10)取上清液400μL至一新的预先标记的1.5mL离心管中，加入800μL-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒直至出现絮状物，即DNA；

[0054] (11)10,000rpm离心10min，弃上清液，加入75％乙醇，洗涤2次；

[0055] (12)10,000rpm离心10min，弃上清液，真空干燥后加入适量的TE(一般200μL)充分溶解DNA；

[0056] (13)取2μL溶解后的DNA，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和含量后，-20℃保存备用。

[0057] 3.水稻总RNA的提取

[0058] 本发明中，水稻总RNA的提取选用天根RNAprep pure Plant Kit(Cat.#DP432)试剂盒，操作步骤按说明书进行，具体步骤如下：

[0059] (1)从水稻植株相应部位剪取新鲜组织，迅速置于预先加入3粒钢珠的无RNA酶的2mL离心管中，并放入液氮中速冻；

[0060] (2)取50-100mg植物组织在液氮中迅速研磨成粉末，加入600μL已加入β-巯基乙醇的HL溶液，涡旋剧烈震荡混匀；

[0061] (3)将所有溶液转移至过滤柱CS上(可将枪头剪去部分以便更好的吸取溶液)，12,000rpm离心5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀；

[0062] (4)缓慢加入0.5倍上清体积的已预冷无水乙醇，混匀后将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

[0063] (5)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

[0064] (6)DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-free的离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀。

[0065] 4.RNA反转录成cDNA

[0066] 本发明中，RNA反转录成cDNA采用TaKaRa公司RNA反转录专用试剂盒(PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser)，操作步骤按其说明书略加改动，具体如下：

[0067] (1)取扩增管一支，依次加入下列溶液，总体积10μL；

[0068]

[0069] (2)42℃热激2min后立即置于冰上冷激1min；

[0070] (3)然后再依次加入以下试剂：

[0071]

[0072]

[0073] (4)混匀后低速瞬时离心，置于PCR仪上，按以下程序进行反应；

[0074]

[0075] (5)反应结束后，置于-20℃冰箱保存备用。

[0076] 5.RT-PCR扩增体系及程序

[0077] 本发明中，采用如下方法进行DNA扩增，具体如下：

[0078] 1)PCR扩增体系：

[0079]

[0080] 注：该处描述的为通用PCR扩增体系，对于定位群体的PCR扩增，各成分相应减半至总体积12.5μL。

[0081] 2)PCR扩增程序：

[0082]

[0083] 注：退火温度由引物的TM值决定，延申时间由所用酶的延伸效率决定，这里列举的PCR扩增程序为Indel和SSR扩增标准程序，可通用于水稻基因的分子定位。

[0084] 3)PCR产物检测(琼脂糖凝胶电泳)：

[0085] PCR扩增完成后，加入5μL 6×DNA loading buffer，用1.00％的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察照相，琼脂糖浓度由片段大小决定。

[0086] 4)PCR产物检测(聚丙烯凝胶电泳)：

[0087] 本实验用的电泳槽为北京六一生物科技有限公司生产的DYCZ-30C双板夹芯式垂直电泳仪，梳子厚度为1.0mm。

[0088] PCR产物经10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，0.2％的AgNO3染色10min，去离子水漂洗2次，每次30s，然后再用0.1％的甲醛和2％的NaOH混合液染色至条带清晰可辨，去离子水冲洗2次后观察照相。

[0089] 6.QPCR体系及程序

[0090] 本发明中，QPCR分析所用试剂盒为Takara的SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNase H Plus)试剂盒，所用设备为Applied Biosystems 7500Real-time PCR，内参为Ubiquitin基因，使用2-ΔΔCt方法计算各基因的相对表达量。

[0091] 1)PCR扩增体系：

[0092]

[0093] 2)PCR扩增程序：

[0094]

[0095] 7.PCR产物回收

[0096] 本发明中，PCR产物回收利用天根生化DP209-03普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行，回收具体方法参照使用说明书进行，回收产物取1.00μL用1.00％的琼脂糖凝胶电泳检测。

[0097] 8.PCR产物连接至质粒载体

[0098] 本发明中，PCR产物连接至质粒载体的方法参照Takara T4DNA Ligase说明书描述的方法适当改进进行连接，体系如下：

[0099]

[0100] 9.转化大肠杆菌感受态

[0101] 本发明中，质粒转化大肠杆菌感受态的具体方法如下：

[0102] (1)从12.5μL连接过夜产物中取6μL至于100μL大肠杆菌感受态中，轻轻混匀后冰浴30min；

[0103] (2)42℃热激90s后，冰上放置2min；

[0104] (3)加入1mL液体LB，220rpm、37℃摇床培养1h；

[0105] (4)5,000rpm离心6min，丢弃850μL左右的上清(可用移液器移取，也可直接倾倒)，剩余250μL重悬，然后均匀的涂布在含有相应抗生素的LB平板上；

[0106] (5)涂布感受态的LB平板用封口膜封住，37℃恒温培养24h左右；

[0107] (6)超净台上，向2mL离心管中加入1.5mL含相应抗生素的液体LB，编号；

[0108] (7)挑取长势正常(即大而圆的斑点)的单菌落，用白枪头挑斑后至于含液体LB的2mL离心管中，220rpm、37℃摇床培养24h左右；

[0109] (8)离心管出现浑浊，则大肠杆菌已培养好，取出待下一步分子鉴定。

[0110] 10.阳性克隆的分子鉴定

[0111] 本发明中，阳性克隆的分子鉴定方法如下：

[0112] (1)PCR菌液初步鉴定：超净台上，轻轻打开培养菌的2mL离心管，取2μL浑浊菌液做模板，按方法5所描述的PCR方法鉴定阳性克隆，目的条带较亮的一般可判定为阳性克隆，可做下一步研究。

[0113] (2)酶切鉴定：对PCR初步判定的阳性克隆，提取质粒，用相应的限制性内切酶进行酶切，1％的琼脂糖凝胶电泳进一步检测。

[0114] (3)测序鉴定：将阳性克隆送至测序公司进行测序，序列比对分析阳性克隆的正确性，正确的阳性克隆保存备用。

[0115] 11.质粒的提取

[0116] 质粒的少量快速抽提参照相应公司的质粒提取试剂盒说明书进行，本发明中所用的主要为天根小量质粒提取试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit II)。

[0117] 12.农杆菌感受态制备

[0118] 本发明中，农杆菌为农杆菌(Agrobacterium)EHA105，感受态的制备方法如下：

[0119] (1)超净台上，将10mL无菌LB液体培养基至于三角瓶中，然后再加入10μL-80℃贮存的农杆菌单克隆菌液；

[0120] (2)28℃摇床250rpm培养24h，OD600为0.5左右，停止培养；

[0121] (3)从中吸取100μL菌液，移至另一装有10mL无菌LB液体培养基的三角瓶中；

[0122] (4)28℃摇床250rpm再培养OD600至0.5左右；

[0123] (5)停止培养，冰浴10min；

[0124] (6)6,000rpm、4℃冷冻离心6min，弃上清液；

[0125] (7)加入4mL预冷的0.1mol/L CaCl2，重悬菌体后冰浴30min；

[0126] (8)6,000rpm、4℃冷冻离心6min，弃上清液；

[0127] (9)再加入4mL预冷的0.1mol/L CaCl2，重悬菌体；

[0128] (10)加甘油至终浓度12.5％左右，分装至1.5mL离心管中，100μL/管，-80℃保存备用；

[0129] 13.转化农杆菌感受态

[0130] 本发明中，转化农杆菌感受态的方法如下：

[0131] (1)取出-80℃保存的农杆菌感受态，立即至于冰上；

[0132] (2)加入含目的基因且测序验证正确的阳性质粒5μL，轻轻混匀后再冰浴5min；

[0133] (3)液氮冷激8min后再37℃热激5min；

[0134] (4)然后依次加入900μL的YEB液体培养基、2μL的链霉素和1.5μL利福平，至于28℃摇床上，200rpm培养3-5h；

[0135] (5)5,000rpm离心5min，弃900μL上清，利用剩余液体重悬菌株后均匀的涂布于含有100μL Kan、25μL链霉素和40μL利福平的YEB固体平板上；

[0136] (6)28℃倒置培养，直至长出2mm左右的菌落，约需2d左右。

[0137] 14.光合色素含量测定

[0138] 本发明中，光合色素的测量方法为：取不同发育时期水稻单株相应部位的新鲜叶片，擦洗干净后剔除中脉，电子天平称取0.15g，剪成2mm2的碎片，置于50mL离心管中，立即加入50％丙酮和50％无水乙醇的混合液，暗处理24h后，利用分光光度记测量波长663nm、646nm和470nm下的光密度，根据以下公式计算光合色素含量：

[0139] Ca＝12.21D663-2.81D646

[0140] Cb＝20.13D646-5.03D663

[0141] Cx·c＝(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229

[0142] 注：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Cx·C为类胡萝卜素的总浓度；D663、D646和D470分别为叶绿体色素提取液在波长663nm、646nm和470nm下的光密度。总叶绿素含量由叶绿素a和b值相加构成。

[0143] 15.透射电镜观察

[0144] 本发明中，透射电镜的观察方法如下：

[0145] (1)固定：取拟做投射电镜观察的组织部位，剪成2mm2以内的小块，迅速投入2.5％的戊二醛电镜固定液中，抽真空使组织完全浸入固定液，4℃条件下至少固定2-4h。然后用0.1M磷酸缓冲液(PH7.4)漂洗3次，再用1％的锇酸固定1-2h，随后用0.1M磷酸缓冲液PBS(PH7.4)漂洗15min，重复3次。

[0146] (2)脱水：用不同浓度的乙醇(50％、70％、80％、90％、95％、100％和100％)梯度脱水，每次15min；

[0147] (3)包埋：丙酮和812包埋剂(1∶1)渗透过夜后更换为纯812包埋剂再次渗透过夜，然后在60℃条件下聚合48h。

[0148] (4)切片：使用超薄切片机切片，厚度为60-80nm。

[0149] (5)染色：2％醋酸铀饱和水溶液染色15min，后用枸橼酸铅染色15min，染色后的切片放置展片台上过夜晾干。

[0150] (6)照相：用H600型透射电镜观察并照相分析。

[0151] 说明：实施例中未注明具体条件的实验方法，通常参照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或参照制造厂商所建议的条件。

[0152] 具体实施例

[0153] 实施例1水稻灰褐叶色突变体gbl1的获知和形态学观察

[0154] 西南大学水稻研究所利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼型恢复系缙恢10号(Jin10)的种子，获得了七百多份突变体，从而成功构建了缙恢10号的EMS诱变体库。在缙恢10号的EMS诱变体库发现了一个灰褐叶色突变体(命名为gbl1)。灰褐叶色突变体gbl1在田间种植条件下，4叶期叶色表现为灰白色，叶片表面出现不规则的褐色斑块(见图1-A、B、C)；分蘖前期叶色表现为灰褐叶色，仅个别叶片呈现绿色(见图1-E)，同时，该时期灰褐叶色突变体gbl1的分蘖数也明显少于野生型(见图1-D和E)；灌浆后期，野生型缙恢10号的叶片还呈绿色时，突变体gbl1的叶片则变为了严重的灰褐叶色(见图1-F和G)。

[0155] 实施例2水稻灰褐叶色突变体gbl1的光合色素含量分析

[0156] 分别对分蘖前期突变体gbl1灰褐色叶片和野生型的叶片进行光合色素含量测定，结果表明，突变体gbl1的灰褐叶色片的叶绿素a、b和类胡罗卜素的含量均极显著低于野生型的叶片(见图1-H)；分别对灌浆后期突变体gbl1灰褐色叶片和野生型的叶片进行光合色素含量测定，结果表明，突变体gbl1叶片的光合色素含量极显著降低(见图1-I)。

[0157] 实施例3温度对突变体gbl1的表型影响分析

[0158] 在重庆，水稻3月中旬播种，8月初收获，前期低温、后期高温，因此初步认为水稻灰褐叶色突变体gbl1的表型可能受温度影响，为验证这一结论，将水稻灰褐叶色突变体gbl1和野生型置于不同的温度下培养至分蘖前期，结果发现，灰褐叶色突变体gbl1在22℃和30℃恒温条件下培养，3-5叶期均无明显表型；而当白天处于30℃下14h，晚上分别22℃、24℃和26℃下处理10h，突变体gbl1出现了叶色变化，且温差越大变异越明显(图7)；表明灰褐叶色突变体gbl1的叶色变化可能受温度变化的影响。

[0159] 实施例4突变体gbl1基因遗传分析

[0160] 用表型正常的缙恢10号与突变体杂交，F1代表型正常，说明该突变体受隐性基因控制。F2代群体中出现明显的分离，分别表现双亲性状。经卡方测验，正常株﹕突变株符合3∶1分离比，表明突变体受隐性单基因(命名为GBL1)控制。

[0161] 实施例5突变体gbl1的图位克隆

[0162] (1)初步定位：选取均匀分布于水稻12条染色体上的400对SSR标记扩增亲本和基因池DNA，初步将突变体gbl1的控制基因定位在水稻第1染色体RM11722和Ind1之间约92kb的物理范围内。

[0163] (2)精细定位：

[0164] 将灰褐叶色突变体gbl1与日本晴进行杂交得F1代，F1代自交得到F2群体。利用1216株F2隐性单株，在分蘖期，参照碱煮法提取嫩叶叶片DNA进行精细定位，最终，将GBL1精细定位在Ind4和Ind3之间23kb的物理范围内，其中，GBL1基因精细定位所用引物如下表所示：

[0165]引物名称 正向引物序列 反向引物序列
Ind1 CTATTGTACCTGCTCTTAGAGC GACTATTAGCCGACTATAAACAT
Ind2 AGTCCGTGTTGCAGCCGACT ATAGCAGCGGGCTACAGATC
Ind3 TGTAGACCGTGTCACTGTCCT TGTCCGCCATTGCAGATGCT
Ind4 CGGCCTCTATATCCAACCAG CCACTACCTCTCAAGCCTGTCC
Ind5 CCGTGAGAGTGAACGTGAAGG AGTCTAGTGGATTGAGTCCACC

[0166] (3)基因预测和比较分析：

[0167] 根据http://www.gramene.org/和http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml进行基因分析和预测，发现精细定位的23K物理范围内包含5个注释基因(见图2-A)，初步判定该5个注释基因为候选基因，分别为LOC_Os01g56380、LOC_Os01g56390、LOC_Os01g56400、LOC_Os01g56410、LOC_Os01g56420。

[0168] 参照CTAB法提取突变体gbl1的DNA对5个候选基因进行测序，结果表明，仅LOC_Os01g56400在第1内含子的第1个碱基(见核苷酸序列305位碱基)发生了G到A的碱基替换，初步确定LOC_Os01g56400为GBL1的候选基因，突变GBL1基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，编码一个具有273个氨基酸的蛋白，所述蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，利用NBCI数据库进行blast分析，结果发现该蛋白属于ABC-ATPase超家族，具有该类蛋白的主要结构域：ATP结合位点、ABC转运信号基序、D-Loop等(图4A)。利用http://www.ebi.ac.uk/网站进一步对蛋白结构进行分析，获得了类似的结果，发现该编码蛋白的49-269个氨基酸具有一个典型的ATP结合盒(ATP-binding cassette)，73-246个氨基酸则为AAA+ATPase结构域(图4B)，表明GBL1编码一个ABC转运蛋白。

[0169] 分别取野生型缙恢10号和gbl1突变体分蘖期的叶片提取RNA，分别以提取得到的野生型缙恢10号和gbl1突变体的RNA为模板，反转录合成cDNA，然后，进行测序，结果显示，突变GBL1基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，与野生型缙恢10号相比，第1内含子的第1个碱基发生了G到A的碱基替换，导致第1外显子最后20个碱基被切除，从而引起移码突变(图3C)。

[0170] 根据GenBank已登录的水稻日本晴基因LOC_Os01g56400序列，利用Vector NTI软件设计横跨第1外显子的引物PIF(SEQ ID No.3)和PIR(SEQ ID No.4),分别对反转录得到的gbl1突变体和野生缙恢10号的cDNA进行PCR扩增，将RT-PCR产物进行1.00％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，突变体gbl1的条带变小(图2C)，从而，进一步证明了G到A的碱基替换的确引起了LOC_Os01g56400的剪接模式的变化。

[0171] 实施例6构建表达载体

[0172] 参照CTAB法提取野生型缙恢10号幼嫩组织的基因组DNA，利用互补引物cGBL1-F(SEQ ID No.5)和cGBL1-R(SEQ ID No.6)扩增基因组DNA，连接到pCAMBIA1301载体上，转化大肠杆菌感受态DH5a，PCR验证阳性菌斑，测序验证序列的准确性。正确的质粒转化根癌农杆菌EHA105，并导入突变体gbl1中，GUS染色和测序鉴定阳性单株。结果发现，转基因中LOC_Os01g56400的转录本恢复正常，其植株表型也得到恢复(图2-D和图2-E)。结果进一步表明LOC_Os01g56400就是GBL1。

[0173] 实施例7构建超表达载体

[0174] 取野生型缙恢10号叶片提取RNA，反转录合成cDNA后，利用超表达引物oGBL1-F(SEQ ID No.7)和oGBL1-R(SEQ ID No.8)扩增GBL1基因全长CDS序列，包括2572bp的启动子区域和941bp的3’端序列，连接到pCAMBIA1301:Camv35S双元表达载体中，转化大肠杆菌感受态DH5a，PCR验证阳性菌斑，测序验证序列的准确性。正确的质粒转化根癌农杆菌EHA105，并导入突变体gbl1中，GUS染色、测序和QPCR等鉴定阳性单株。结果发现，转基因植株的叶色恢复成了正常的绿色，除此之外，表型未发现明显改变，结果进一步表明LOC_Os01g56400就是目的基因GBL1(图3)

[0175] 实施例8突变GBL1基因的表达分析

[0176] 为明确突变GBL1基因的表达模式，首先利用RT-PCR对突变GBL1基因在根、茎、叶、叶鞘和SAM的表达进行了分析。结果发现，突变GBL1基因在分蘖期的根、茎、叶、鞘和SAM中均有较高的表达(图5-A)。QPCR进一步分析发现，突变GBL1基因在叶片中的表达相对较高(图5-B)。

[0177] 在突变GBL1基因启动子部位设计引物pGBL1-F(SEQ ID No.9)和pGBL1-R(SEQ ID No.10)，PCR扩增野生型水稻缙恢10号的基因组DNA，连接到pCAMBIA1301载体上，转化大肠杆菌感受态DH5a，PCR验证阳性菌斑，测序验证序列的准确性。正确的质粒转化根癌农杆菌EHA105，并导入野生型缙恢10号中，GUS染色和测序鉴定阳性单株。结果发现，T0代转基因植株的根、茎、叶、叶鞘和SAM中均被染成了蓝色，且在叶片中蓝色深浅呈不规则分布，这与叶片的白化表型相一致(图5-C-G)。结果表明突变GBL1基因是一个组成型表达的基因。

[0178] 实施例9叶绿体发育相关基因的表达

[0179] 从细胞学水平鉴定gbl1白化的原因，对分蘖期倒1全展叶的中部进行透射电镜观察(图6-A和图6-B)。结果发现，野生型叶肉细胞含有大量的叶绿体(图6-a)，叶绿体结构发育完善，内含排列规则的基粒，基粒片层分布正常(图6-1-1)；而突变体gbl1的叶肉细胞则发育缺陷，仅含有少量发育不完善的叶绿体(图6-b和图6-c)，叶绿体内含有排列规则的基粒，但基粒片层较薄(图6-2-1和图6-3-1)。因此，推测突变GBL1基因可能调控水稻叶绿体的发育。

[0180] 突变GBL1基因的同源基因OsABCI8，通过控制铁等金属离子的转运调控叶绿体的发育。为验证突变GBL1基因是否与OsABCI8有类似的功能，利用不同金属离子进行处理，结果表明，当用硫酸亚铁处理时，随着浓度的升高，gbl1的突变表型得到了部分恢复(图8)，因此推断，突变GBL1基因可能与铁离子的运输有关。

[0181] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。