一种3D-rGO/Fe3O4-AuNPs/HP-β-CD复合材料的制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD复合材料的制备方法和应用。所述复合材料的制备，是通过Fe3O4和AuNPs以及羟丙基‑β‑环糊精(HP‑β‑CD)修饰到三维石墨烯表面制得(3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD)。该材料不仅结合了3D‑rGO比表面积大、电子传递速率快，Fe3O4‑AuNPs电催化活性高等优点，还具有HP‑β‑CD优异的分子识别能力，通过一系列表征证实Fe3O4、AuNPs和HP‑β‑CD成功负载在三维石墨烯结构中，并将其修饰到玻碳电极表面制得新型传感平台用于鸟嘌呤和腺嘌呤的同时检测。结果表明，鸟嘌呤和腺嘌呤在较宽的线性范围下得到了较低的检测限，大大提高了修饰电极对两种嘌呤检测的灵敏度。本发明制备的传感器还成功用于实际样品鱼精DNA中鸟嘌呤和腺嘌呤的同时检测。

权利要求

1.一种3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD纳米复合材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）Fe3O4‑AuNPs纳米粒子的制备：首先将49‑51 mg Fe3O4加入到40‑60 mL超纯水中，超声分散后，在N2氛围下再加入170‑

190 μL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），室温下机械搅拌6‑8 h，黑色沉淀反复洗涤并磁滞分离，最后真空干燥，得到氨基化的Fe3O4 Fe3O4‑NH2；然后取19‑21 mg Fe3O4‑NH2粉末超声分散在15‑25 mL 超纯水中，加入39‑41 mg金纳米粒子（AuNPs）粉末，室温搅拌2‑4 h，反复洗涤并磁滞分离，50℃真空干燥7‑9 h，得到Fe3O4‑AuNPs；

2）3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs纳米材料的制备：先将40mg/20mL氧化石墨烯GO超声破碎15‑25 min，在超声溶解下加入75‑85 mg L‑半胱氨酸L‑Cys，迅速加入550‑650 μL氨水，置于锥形瓶中，在95℃的油浴中加热，反应3‑5 h，最后过滤，冷冻干燥得三维石墨烯3D‑rGO黑色固体粉末；再取制得的3D‑rGO 29‑31 mg，超声分散在20‑40 mL水中，加入29‑31 mg步骤1）获得的Fe3O4‑AuNPs，室温搅拌2‑4 h，多次洗涤并磁滞分离，冷冻干燥得到3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs；

3）3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD复合材料的制备：取19‑21 mg步骤2）中所获得的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs到50 mL锥形瓶，加入22.23‑24.23 mg碳二亚胺盐酸盐和12.8‑14.8 mg N‑羟基琥珀酰亚胺，机械搅拌1‑3 h，然后加入羟丙基‑β‑环糊精HP‑β‑CD 155‑165 mg，室温搅拌20‑30 h后，磁滞分离并冷冻干燥，得到最终的产物3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD。

2.根据权利要求1所述的纳米复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中在N2氛围下再加入APTES，室温下机械搅拌时间为7 h。

3.根据权利要求1所述的纳米复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中加入AuNPs粉末后室温搅拌时间为3 h，50℃真空干燥时间为8 h。

4.根据权利要求1所述的纳米复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中GO超声破碎时间为20 min，L‑Cys加入量为80 mg，氨水加入量为600 μL。

5.根据权利要求1所述的纳米复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中油浴中加热反应时间为4 h。

6.根据权利要求1所述的纳米复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中室温搅拌时间为3 h。

7.根据权利要求1所述的纳米复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中机械搅拌时间为2 h。

8.根据权利要求1所述的纳米复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中加入HP‑β‑CD后，室温搅拌时间为24 h。

9.一种纳米复合材料构筑的电化学传感器同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰电极的制备：对玻碳电极进行清洗并干燥，移取4‑6 μL浓度2mg/mL的权利要求1所述的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD滴涂于玻碳电极表面，在红外灯下充分烘干，即获得修饰电极3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD/GCE；

2）电化学同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤：

先通过循环伏安法和电化学阻抗法在含有5 mM铁氰化钾和亚铁氰化钾混合物和0.1 M KCl的0.1 M pH =3磷酸缓冲盐溶液PBS中对制备好的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD/GCE进行电化学表征；然后浸入含100 μM鸟嘌呤和100 μM腺嘌呤的PBS pH =3溶液中，用差分脉冲伏安法检测电信号来实现两种嘌呤的同时检测；

3）电化学同时检测实际样品中的鸟嘌呤和腺嘌呤：先制备生物样品：取90‑110 µL提取的鱼精DNA置于塑料离心管中，加入0.5‑1.5 mL HCl，于沸水浴中加热0.5‑1.5 h得到变性处理的DNA，再加入0.5‑1.5 mL NaOH，并于室温下冷却；最后通过PH =3的0.1 mol/L PBS定容至20 mL；

根据标准加入法先取10 mL制得的定容变性鱼精DNA，测定其中鸟嘌呤和腺嘌呤的氧化电流峰，然后再取10 mL制得的定容变性鱼精DNA，加入50 µM的鸟嘌呤和腺嘌呤，再次测量峰电流值，通过两次测量之间的差值算得鸟嘌呤和腺嘌呤的浓度。

10.根据权利要求9所述纳米复合材料构筑的电化学传感器同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的方法，其特征在于：所述步骤3）中加入HCl后，于沸水浴中加热时间为1 h。

说明书

一种3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD复合材料的制备方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明属于纳米复合材料和电化学检测，具体涉及一种3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD纳米复合材料的制备及其修饰到电极表面同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的方法。

背景技术

[0002] 鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)是脱氧核酸(DNA)和核酸(RNA)中重要的两种碱基。嘌呤作为生物分子，除在细胞增殖中具有多种重要的功能外，还在细胞裂解、凋亡等过程中以一种
危险信号存在。DNA中碱基的浓度,会影响酶的活性，通过改变正常的嘌呤代谢途径，从而影
响免疫系统，引发肥胖和肿瘤复发等多种疾病。因此，准确且高效地检测生物样品中鸟嘌呤
和腺嘌呤的含量，在生物科学以及分析化学领域意义重大。电化学以其高效，简便、快速的
优点多年来一直被广泛应用于鸟嘌呤和腺嘌呤的检测。

[0003] 传统的二维石墨烯基复合材料，尽管具有大的比表面积，以及良好的导电性能等，在电化学传感器等方面应用广泛，但水溶性差。而β‑环糊精(β‑CD)由于其腔内疏水、腔外亲
水的结构，与各种客体分子结合形成超分子化合物，再加上其良好的亲水性的性质，可以提
高电极的特异性识别和选择性。因此在二维石墨烯表面负载β‑CD后，不仅提高了水溶性和
对客体分子的识别能力，且增强了电化学性能，但是检测效果不是很显著。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD纳米复合物的制备及其修饰到电极表面同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的方法，解决现有技术存
在的电极检测线性范围窄、电子转移阻抗大、以及检测下限高等技术问题。

[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0006] 一种3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：

[0007] 1)Fe3O4‑AuNPs纳米粒子的制备：

[0008] 首先将49‑51mg(优选50mg)Fe3O4加入到40‑60mL(优选50mL)超纯水中，超声分散后，在N2氛围下再加入170‑190μL(优选180μL)3‑氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室温下机械
搅拌6‑8h(优选7h)，黑色沉淀用超纯水和乙醇反复洗涤并磁滞分离最后真空干燥，得到氨
基化的Fe3O4(Fe3O4‑NH2)；然后取19‑21mg(优选20mg)Fe3O4‑NH2粉末超声分散在15‑25mL(优
选20mL)超纯水中，加入39‑41mg(优选40mg)金纳米粒子(AuNPs)粉末，室温搅拌2‑4h(优选
3h)，反复洗涤并磁滞分离，50℃真空干燥7‑9h(优选8h)，即得到Fe3O4‑AuNPs；

[0009] 2)3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs纳米材料的制备：

[0010] 先将氧化石墨烯(GO)(40mg/20mL)超声破碎15‑25min(优选20min)，在超声溶解下加入75‑85mg(优选80mg)L‑半胱氨酸(L‑Cys)，迅速加入550‑650μL(优选600μL) 氨水，置于
锥形瓶中，在95℃的油浴中加热，反应3‑5h(优选4h)，最后过滤，冷冻干燥得三维石墨烯
(3D‑rGO)黑色固体粉末；再取制得的3D‑rGO 29‑31mg(优选30mg)，超声分散在20‑40mL(优
选30mg)水中，加入29‑31mg(优选30mg)步骤1)中所获得的Fe3O4‑AuNPs，室温搅拌2‑4h(优选
3h)，多次洗涤并磁滞分离，冷冻干燥得到3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs；

[0011] 3)3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD复合材料的制备：

[0012] 取19‑21mg(优选20mg)步骤2)中所获得的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs到50mL锥形瓶，加入22.23‑24.23mg(优选23.23mg)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和12.8‑14.8mg(优选13.8 mg)N‑羟
基琥珀酰亚胺NHS，机械搅拌1‑3h(优选2h)，然后加入羟丙基‑β‑环糊精(HP‑ β‑CD)155‑
165mg(优选160mg)，室温搅拌20‑30h(优选24h)后，磁滞分离并冷冻干燥，得到最终产物3D‑
rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD。

[0013] 一种用三维石墨烯纳米复合材料同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的方法，包括以下步骤：

[0014] 1)3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰电极的制备：

[0015] 对玻碳电极进行清洗并干燥，移取4‑6μL(优选5μL)如前所述的 3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD(2mg/mL)滴涂于玻碳电极(GCE)表面，在红外灯下充分烘干，即获得3D‑rGO/
Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的修饰电极；

[0016] 2)电化学同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤：

[0017] 先通过循环伏安法(CV)和电化学阻抗法(EIS)在含有5mM铁氰化钾和亚铁氰化钾3‑/4‑ ‑
混合物([Fe(CN)6] )和0.1M KCl的0.1M pH＝7磷酸缓冲盐溶液PBS中对制备好的 3D‑
rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰的玻碳电极进行电化学表征。然后浸入含100μM鸟嘌呤和100
μM腺嘌呤的PBS pH＝3溶液中，用差分脉冲伏安法(DPV)检测电信号来实现两种嘌呤的同时
检测；

[0018] 3)电化学同时检测实际样品中的鸟嘌呤和腺嘌呤：

[0019] 先制备生物样品：取90‑110μL(优选100μL)提取的鱼精DNA置于塑料离心管中，加入0.5‑1.5mL(优选1mL)HCl，于沸水浴中加热0.5‑1.5h(优选1h)得到变性处理的DNA，再加
入0.5‑1.5mL(优选1mL)NaOH，并于室温下冷却；最后通过PH＝3的0.1mol/L PBS 定容至
20mL；

[0020] 根据标准加入法先取10mL制得的定容变性鱼精DNA，测定其中鸟嘌呤和腺嘌呤的氧化电流峰，然后再取10mL制得的定容变性鱼精DNA，加入50μM的鸟嘌呤和腺嘌呤，再次测
量峰电流值，通过两次测量之间的差值算得鸟嘌呤和腺嘌呤的浓度，从而得到鸟嘌呤和腺
嘌呤的百分含量，进一步计算出鱼精DNA中(G+C)/(A+T)(其中，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶) 
的比值，与标准值对比；

[0021] 4)同时检测G和A的干扰性研究：

[0022] 为了评价构筑电化学传感器的选择性，测定几种重要的生物物质以及一些金属和无机离子等干扰物质存在时鸟嘌呤和腺嘌呤的峰电流变化。通过将8‑12mM(优选10mM)不同
的干扰物质加入0.1M含有80‑120μM(优选100μM)鸟嘌呤和80‑120μM(优选100μM) 腺嘌呤的
PBS pH＝3缓冲溶液中，检测3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD/GCE的DPV峰电流值。

[0023] 本发明制备的三维石墨烯基纳米复合材料3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD，修饰于玻碳电极(GCE)表面制得新型电化学传感器。通过差分脉冲伏安法(DPV)，用该纳米复合物
修饰电极同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤，获得了较宽的线性范围以及较低的检测限。

[0024] 与现有技术相比本发明的有益效果：

[0025] (1)本发明制备的三维石墨烯基纳米复合物3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD，包含四种多功能材料，可用于修饰电极。其中3D‑rGO独特的多孔网络结构赋予其超高的比表面积
和良好的导电性，Fe3O4纳米粒子具有良好的磁性能、强的催化能力和优异的表面活性等独
特性质， AuNPs拥有优异的电催化性能和生物相容性等优势，再加上HP‑β‑CD保留了β‑环糊
精的空腔结构，与各种客体分子结合形成超分子化合物的同时，还提高了修饰材料的水溶
性和分散性。

[0026] (2)通过DPV研究了鸟嘌呤和腺嘌呤在修饰电极表面的电化学行为，在较宽的线性范围下得到了较低的检测限，大大提高了修饰电极对两种嘌呤检测的特异性选择识别作用
和灵敏度。此外，该新型传感器还成功用于鱼精DNA中鸟嘌呤和腺嘌呤的同时检测，也获得
了满意的实验结果，这将在电化学传感器的分析和研究中发挥重要的作用。

附图说明

[0027] 图1为3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的SEM(A),TEM(B)和HRTEM(C)照片；

[0028] 图2为GO，3D‑rGO，3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs和3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的红外(A) 和拉曼(B)光谱；AuNPs，3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs和3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的紫外(C) 和
荧光(D)光谱；

[0029] 图3为3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs和3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的动态光散射图谱；

[0030] 图4为(A)GO，3D‑rGO，3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs和3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的XPS 谱图；3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的C1s(B)，Fe2p(C)和Au4f(D)XPS谱图；

[0031] 图5为GO，3D‑rGO，3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs和3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰电极3‑/4‑
在含有5mM[Fe(CN)6] 和0.1M KCl PBS pH＝7溶液中的电化学阻抗法(EIS)图(A)和循环
伏安法(CV)图(B)；

[0032] 图6为不同修饰电极在0.1M含有100μM G和100μM A的PBS pH＝3溶液中的DPV 图；

[0033] 图7为在0.1M PBS pH＝3中，3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰的GCE对100μM G 存在下不同浓度A(A)，100μM A存在下不同浓度G(B)和同时检测G和A(C)的DPV图；插图为相
应嘌呤碱基的峰电流与浓度的关系；(D)为同时检测G和A相应的线性图；

[0034] 图8为在0.1M PBS pH＝3中其他10mM干扰物缺乏或存在时，3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑ β‑CD修饰的GCE对100μM G和100μM A的电流响应图。

具体实施方式

[0035] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但实施例并不限制本发明的保护范围。

[0036] 实施例1：

[0037] 一种3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：

[0038] 1)Fe3O4‑AuNPs纳米粒子的制备：

[0039] 首先将50mg的Fe3O4加入到50mL超纯水中，超声分散后，在N2氛围下再加入180μL APTES，室温下机械搅拌7h，黑色沉淀用超纯水和乙醇反复洗涤并磁滞分离最后真空干燥，
得到氨基化的Fe3O4(Fe3O4‑NH2)。然后取20mg Fe3O4‑NH2粉末超声分散在20mL超纯水中，加入
40mg AuNPs粉末，室温搅拌3h，反复洗涤并磁滞分离，50℃真空干燥8h，得到Fe3O4‑ AuNPs；

[0040] 2)3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs纳米材料的制备：

[0041] 先将氧化石墨烯(GO)(40mg/20mL)超声破碎20min，在超声溶解下加入80mg L‑半胱氨酸(L‑Cys)，迅速加入600μL氨水，置于锥形瓶中，在95℃的油浴中加热，反应4h，最后过
滤，冷冻干燥得3D‑rGO黑色固体粉末；再取制得的3D‑rGO 30mg，超声分散在30mL 水中，加
入30mg步骤1)中所获得的Fe3O4‑AuNPs，室温搅拌3h，多次洗涤并磁滞分离，冷冻干燥得到
3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs；

[0042] 3)3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD复合材料的制备：

[0043] 取20mg步骤2)中所获得的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs到50mL锥形瓶，加入23.23mg EDCI 和13.8mg NHS，机械搅拌2h，然后加入HP‑β‑CD 160mg，室温搅拌24h后，磁滞分离并冷冻干
燥，得到最终的产物3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD(见图1‑4)；

[0044] 由图1A的SEM图所示，可以清晰地看到三维多孔结构，表明成功合成了3D‑rGO，同时F e3O4、AuNPs和HP‑β‑CD的引入，并没有影响纳米复合物的网状结构。从TEM(图1B)进一步
观察到3D‑rGO纳米片明显的褶皱，且黑色的Fe3O4和AuNPs颗粒呈椭球形，均匀地分散在3 D‑
rGO表面,并未发生明显的聚集现象。通过HRTEM(图1C)得出视野内Fe3O4和AuNPs纳米粒子的
平均直径分别约为13nm和7nm。

[0045] 图2A为GO，3D‑rGO，3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs和3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的红外光‑1 ‑1 ‑1
谱，在GO曲线中，3416cm 和1639cm 处的峰分别对应O‑H和C＝C的伸缩振动峰，1727cm 的
谱带则对应C＝O的伸缩峰。与GO相比，3D‑rGO曲线中C＝O峰的消失说明GO被成功还原为
‑1
rGO。而3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD和3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs谱图均在580cm 附近出现一个
明显的强峰，这是由于Fe3O4中的Fe‑O键的伸缩振动所引起的，这表明Fe3O4成功修饰到了三
维石墨烯表面。图2B为GO，3D‑rGO，3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs和3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的
‑1 ‑1 ‑1
拉曼光谱，位于1350cm 、1580cm 和2750cm 的突出峰分别对应D带和G带和2D带，石墨烯中
的缺陷程度一般用D峰和G峰的强度比(ID/IG)来表征，G峰和2D峰的强度比(IG/I2D) 表明石
墨烯的层数。对比GO的ID/IG(0.90)，3D‑rGO的ID/IG(1.47)增加，这是由于GO在还原过程中
形成了3D多孔结构，导致C空缺和紊乱度的增加。对于3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs，ID/IG比值进一
步增强，证实了Fe3O4和AuNPs纳米颗粒成功被引入到3D网络中。当用HP‑β‑CD功能化3D‑rGO/
Fe3O4‑AuNPs时，与3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs相比，ID/IG值有所降低(1.18)，这可能是化学修饰过
程中部分缺陷消失的结果。同时IG/I2D>1，表明3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β ‑CD纳米复合材料
是多层的。图2C的紫外吸收光谱图，3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD和 3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs
在270nm处均有一小峰，对应rGO的紫外吸收峰，这充分证明了GO的成功还原。此外，对比
AuNPs，这两种三维石墨烯基纳米材料在510nm左右并没有出现金纳米粒子的特征吸收峰，
这可能是由于合成的两种三维石墨烯基复合材料中金纳米粒子的含量太低。图2D为荧光谱
图，可以明显看到，AuNPs、3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs和3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑ β‑CD均在
618.5nm出现了纳米金的特征峰，这再一次证实AuNPs成功修饰到三维石墨烯复合材料表
面。

[0046] 图3为3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs和3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的动态光散射图谱，对3D‑ rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD和3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs两种复合材料进行了粒径比较。经过
分析，发现两种材料的水合粒径平均值分别为390.8nm和268.3nm，这说明了HP‑β‑CD成功包
裹在三维石墨烯结构中，从而使3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的粒径增大。

[0047] 图4为XPS谱图。图4A中发现四种材料中均有C和O两种元素，而在 3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD和3D‑rGO‑AuNPs/Fe3O4中还有Fe和Au元素的存在。与GO相比， 3D‑rGO的O1s
峰值明显下降，这说明在合成3D‑rGO的过程中GO发生了还原作用。而 3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/
HP‑β‑CD和3D‑rGO‑AuNPs/Fe3O4的O1s峰值明显高于3D‑rGO，表明化学修饰过程的发生。图
4B、C和D分别对3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的C1s、Fe2p以及Au4f 峰进行了拟合，观察到
C1s谱图中共有五种碳键C‑C(283.5eV)、C‑N(284.3eV)、C‑O(285.2 eV)、C＝O(286.3eV)、O‑
C＝O(287.4eV)(图4B)，Fe2p谱图中得到了Fe2p3/2(710.0eV) 和Fe2p1/2(723.5eV)两个峰，
以及Au4f谱图中Au4f5/2(87.67eV)和Au4f7/2(84.00eV) 的存在，都证实Fe3O4和AuNPs成功负
载在三维石墨烯结构中。

[0048] 一种用三维石墨烯纳米复合材料同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的方法，包括以下步骤：

[0049] 1)3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰电极的制备：

[0050] 对玻碳电极进行清洗并干燥，移取5μL如前所述的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD(2 mg/mL)滴涂于GCE电极表面，在红外灯下充分烘干，即可获得3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD 
的修饰电极；

[0051] 2)电化学同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤：

[0052] 先通过循环伏安法(CV)和电化学阻抗法(EIS)在含有5mM[Fe(CN)6]3‑/4‑和0.1M KCl 的0.1M pH＝7PBS中对制备好的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰的玻碳电极进行电
化学表征。然后浸入含100μM鸟嘌呤和100μM腺嘌呤的PBS pH＝3溶液中，用差分脉冲伏安法
(DPV)检测电信号来实现两种嘌呤的同时检测(见图5‑7)；

[0053] 图5为GO，3D‑rGO，3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs和3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰电极3‑/4‑
在含有5mM[Fe(CN)6] 和0.1M KCl PBS pH＝7溶液中的EIS图和CV图。图5A，通过EIS以 
3‑/4‑
[Fe(CN)6] 为氧化还原探针，对裸电极和不同的修饰电极进行了阻抗研究。如Nyquist图
中，阻抗曲线包括了高频区的半圆虚线和低频区线性虚线，分别对应修饰层的电子转移阻
抗(Ret) 和电解质在修饰层的扩散电阻。图5B可以看出，与裸电极相比，不同修饰电极的
Ret均有不同程度地降低，而修饰了3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD材料的电极阻抗值最小，
这是由于 3D‑rGO超高的电导率，Fe3O4和AuNPs强的电催化性能以及HP‑β‑CD优异的水溶性
共同作用的结果。

[0054] 图6为不同修饰电极在0.1M含有100μM G和100μM A的PBS pH＝3溶液中的DPV图，在0.6‑1.4V的电位范围内均有两个明显的氧化峰，且相互独立，互不干扰，这表明这些修饰
材料都具有电化学活性，均可以对G和A这两种生物分子进行同时检测。然而对比裸GCE、 
3D‑rGO/GCE、3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/GCE，3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰的电极，在DPV 
同时检测中表现出最高的电流响应信号，这不仅归功于三维石墨烯大的比表面积和良好的
导电性，还协同了Fe3O4和AuNPs强的催化性能以及HP‑β‑CD独特的选择性。以上现象表明， 
3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD/GCE被选作用来同时检测G和A。

[0055] 图7为3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD/GCE在含有G和A的混合溶液中对G和A进行检测。图7A中，保持鸟嘌呤浓度不变，来研究腺嘌呤的电化学信号随浓度变化的趋势。结果显
示，鸟嘌呤峰电流基本保持不变，而腺嘌呤的峰电流随着浓度的增加而升高，插图显示腺嘌
呤在 0.5‑190μM的浓度范围内氧化峰电流与浓度具有良好的线性关系，其线性回归方程为
2
IP(A)＝ 0.0807cA+0.270(R＝0.999)，同时A的检测限(LODs)为0.023μM。同样在图7B中得到
2
了G在线性范围0.3‑150μM下的线性方程和LODs，分别为IP(G)＝0.078cG+0.780(R ＝0.998) 
和0.019μM。图7C通过DPV也考察了鸟嘌呤和腺嘌呤的浓度同时变化时 3D‑rGO/Fe3O4‑
AuNPs/HP‑β‑CD/GCE对两种嘌呤的同时检测。图7D进一步获得鸟嘌呤在1‑150 μM和腺嘌呤
2
1‑190μM的浓度范围内线性回归方程，分别为IP(G)＝0.079cG+0.730(R＝0.999) 和IP(A)＝
2
0.081cA+0.287(R＝0.999)以及两种嘌呤的检出限LODs分别为0.026μM和0.031 μM。结果显
示，同时检测G和A与单独检测时的斜率和线性范围相差不大，且二者氧化过程互不干扰。因
此可以用3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD/GCE对G和A进行同时和单独检测。

[0056] 3)电化学同时检测实际样品中的鸟嘌呤和腺嘌呤：

[0057] 先制备生物样品：取100μL提取的鱼精DNA置于塑料离心管中，加入1.0mL HCl，于沸水浴中加热1h得到变性处理的DNA，再加入1.0mL NaOH，并于室温下冷却；最后通过 PH＝
3的0.1mol/L PBS定容至20mL；

[0058] 根据标准加入法先取10mL制得的定容变性鱼精DNA，测定其中鸟嘌呤和腺嘌呤的氧化电流峰，然后再取10mL制得的定容变性鱼精DNA，加入50μM的鸟嘌呤和腺嘌呤，再次测
量峰电流值，通过两次测量之间的差值算得鸟嘌呤和腺嘌呤的浓度，从而得到鸟嘌呤和腺
嘌呤的百分含量，进一步计算出鱼精DNA中(G+C)/(A+T)的比值，与标准值对比；

[0059] 得到的结果如下，鸟嘌呤和腺嘌呤的含量分别为21.51％和28.68％，进一步计算出(G+C) /(A+T)的比值为0.75，与标准值0.77是接近的，这说明我们构筑的电化学传感器
可用于实际样品检测。

[0060] 4)同时检测G和A的干扰性研究：

[0061] 为了评价构筑电化学传感器的选择性，测定几种重要的生物物质以及一些金属和无机离子等干扰物质存在时鸟嘌呤和腺嘌呤的峰电流变化。通过将10mM不同的干扰物质加
入0.1M 含有100μM鸟嘌呤和100μM腺嘌呤的PBS pH＝3缓冲溶液中，检测3D‑rGO/Fe3O4‑
AuNPs/HP‑ β‑CD/GCE的DPV峰电流值(见图8)；

[0062] 图8为在0.1M PBS pH＝3中其他10mM干扰物缺乏或存在时，3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/+
HP‑ β‑CD/GCE对100μM G和100μM A的电流响应图，实验结果表明，浓度高达100倍的Na ， 
2+ 2+ + ‑
Ca ，Mg ，K ，Cl，葡萄糖，L‑半胱氨酸，抗坏血酸对两种嘌呤的同时检测没有明显的干扰作
用，多巴胺在距离腺嘌呤和鸟嘌呤峰电位较远的位置出现了氧化峰，且峰电流明显低于鸟
嘌呤和腺嘌呤的电流值。以上结果表明3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD的修饰电极GCE对同时
检测鸟嘌呤和腺嘌呤具有良好的抗干扰能力。

[0063] 实施例2：

[0064] 一种3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：

[0065] 1)Fe3O4‑AuNPs纳米粒子的制备：

[0066] 首先将51mg的Fe3O4加入到60mL超纯水中，超声分散后，在N2氛围下再加入190μL APTES，室温下机械搅拌8h，黑色沉淀用超纯水和乙醇反复洗涤并磁滞分离最后真空干燥，
得到氨基化的Fe3O4(Fe3O4‑NH2)。然后取21mg Fe3O4‑NH2粉末超声分散在25mL超纯水中，加入
41mg AuNPs粉末，室温搅拌4h，反复洗涤并磁滞分离，50℃真空干燥9h，得到Fe3O4‑ AuNPs；

[0067] 2)3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs纳米材料的制备：

[0068] 先将氧化石墨烯(GO)(40mg/20mL)超声破碎25min，在超声溶解下加入85mg L‑半胱氨酸(L‑Cys)，迅速加入650μL氨水，置于锥形瓶中，在95℃的油浴中加热，反应5h，最后过
滤，冷冻干燥得3D‑rGO黑色固体粉末；再取制得的3D‑rGO 31mg，超声分散在40mL 水中，加
入31mg步骤1)所获得的Fe3O4‑AuNPs，室温搅拌4h，多次洗涤并磁滞分离，冷冻干燥得3D‑
rGO/Fe3O4‑AuNPs；

[0069] 3)3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD复合材料的制备：

[0070] 取21mg步骤2)中所获得的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs到50mL锥形瓶，加入24.23mg EDCI 和14.8mg NHS，机械搅拌3h，然后加入HP‑β‑CD 165mg，室温下搅拌30h后，磁滞分离并冷冻
干燥，得到最终的产物3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD。

[0071] 一种用三维石墨烯纳米复合材料同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的方法，包括以下步骤：

[0072] 1)3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰电极的制备：

[0073] 对玻碳电极进行清洗并干燥，移取6μL如前所述的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD(2 mg/mL)滴涂于GCE电极表面，在红外灯下充分烘干，即获得3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD 的
修饰电极；

[0074] 2)电化学同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤

[0075] 先通过循环伏安法(CV)和电化学阻抗法(EIS)在含有5mM[Fe(CN)6]3‑/4‑和0.1M KCl 的0.1M pH＝7PBS中对制备好的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰的玻碳电极进行电
化学表征。然后浸入含100μM鸟嘌呤和100μM腺嘌呤的PBS pH＝3溶液中，用差分脉冲伏安法
(DPV)检测电信号来实现两种嘌呤的同时检测；

[0076] 3)电化学同时检测实际样品中的鸟嘌呤和腺嘌呤：

[0077] 先制备生物样品：取110μL提取的鱼精DNA置于塑料离心管中，加入1.5mL HCl，于沸水浴中加热1.5h得到变性处理的DNA，再加入1.5mL NaOH，并于室温下冷却；最后通过 PH
＝3的0.1mol/L PBS定容至20mL；

[0078] 根据标准加入法先取10mL制得的定容变性鱼精DNA，测定其中鸟嘌呤和腺嘌呤的氧化电流峰，然后再取10mL制得的定容变性鱼精DNA，加入50μM的鸟嘌呤和腺嘌呤，再次测
量峰电流值，通过两次测量之间的差值算得鸟嘌呤和腺嘌呤的浓度，从而得到鸟嘌呤和腺
嘌呤的百分含量，进一步计算出鱼精DNA中(G+C)/(A+T)的比值，与标准值对比；

[0079] 4)同时检测G和A的干扰性研究：

[0080] 为了评价构筑电化学传感器的选择性，测定几种重要的生物物质以及一些金属和无机离子等干扰物质存在时鸟嘌呤和腺嘌呤的峰电流变化。通过将12mM不同的干扰物质加
入0.1M 含有120μM鸟嘌呤和120μM腺嘌呤的PBS pH＝3缓冲溶液中，检测3D‑rGO/Fe3O4‑
AuNPs/HP‑ β‑CD/GCE的DPV峰电流值。

[0081] 实施例3：

[0082] 一种3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：

[0083] 1)Fe3O4‑AuNPs纳米粒子的制备：

[0084] 首先将49mg预先合成的Fe3O4加入到40mL超纯水中，超声分散后，在N2氛围下再加入 170μL APTES，室温下机械搅拌6h，黑色沉淀用超纯水和乙醇反复洗涤并磁滞分离最后
真空干燥，得到氨基化的Fe3O4(Fe3O4‑NH2)。然后取19mg Fe3O4‑NH2粉末超声分散在15mL超纯
水中，加入39mg AuNPs粉末，室温搅拌2h，反复洗涤并磁滞分离，50℃真空干燥7h，得到
Fe3O4‑AuNPs；

[0085] 2)3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs纳米材料的制备：

[0086] 先将氧化石墨烯(GO)(40mg/20mL)超声破碎15min，在超声溶解下加入75mg L‑半胱氨酸(L‑Cys)，迅速加入550μL氨水，置于锥形瓶中，在95℃的油浴中加热，反应3h，最后过
滤，冷冻干燥得3D‑rGO黑色固体粉末；再取制得的3D‑rGO 29mg，超声分散在20mL 水中，加
入29mg步骤1)中所获得的Fe3O4‑AuNPs，室温搅拌2h，多次洗涤并磁滞分离，冷冻干燥得到
3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs；

[0087] 3)3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD复合材料的制备：

[0088] 取19mg步骤2)中所获得的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs到50mL锥形瓶，加入22.23mg EDCI 和12.8mg NHS，机械搅拌1h，然后加入HP‑β‑CD 155mg，室温搅拌20h后，磁滞分离并冷冻干
燥，得到最终的产物3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD。

[0089] 一种用三维石墨烯纳米复合材料同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤的方法，包括以下步骤：

[0090] 1)3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰电极的制备：

[0091] 对玻碳电极进行清洗并干燥，移取4μL如前所述的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD(2 mg/mL)滴涂于GCE电极表面，在红外灯下充分烘干，即获得3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD 的
修饰电极；

[0092] 2)电化学同时检测鸟嘌呤和腺嘌呤：

[0093] 先通过循环伏安法(CV)和电化学阻抗法(EIS)在含有5mM[Fe(CN)6]3‑/4‑和0.1M KCl 的0.1M pH＝7PBS中对制备好的3D‑rGO/Fe3O4‑AuNPs/HP‑β‑CD修饰的玻碳电极进行电
化学表征。然后浸入含100μM鸟嘌呤和100μM腺嘌呤的PBS pH＝3溶液中，用差分脉冲伏安法
(DPV)检测电信号来实现两种嘌呤同时检测；

[0094] 3)电化学同时检测实际样品中的鸟嘌呤和腺嘌呤：

[0095] 先制备生物样品：取90μL提取的鱼精DNA置于塑料离心管中，加入0.5mL HCl，于沸水浴中加热0.5h得到变性处理的DNA，再加入0.5mL NaOH，并于室温下冷却；最后通过 PH＝
3的0.1mol/L PBS定容至20mL；

[0096] 根据标准加入法先取10mL制得的定容变性鱼精DNA，测定其中鸟嘌呤和腺嘌呤的氧化电流峰，然后再取10mL制得的定容变性鱼精DNA，加入50μM的鸟嘌呤和腺嘌呤，再次测
量峰电流值，通过两次测量之间的差值算得鸟嘌呤和腺嘌呤的浓度，从而得到鸟嘌呤和腺
嘌呤的含量，进一步计算出鱼精DNA中(G+C)/(A+T)的比值，与标准值对比；

[0097] 4)同时检测G和A的干扰性研究：

[0098] 为了评价构筑电化学传感器的选择性，测定几种重要的生物物质以及一些金属和无机离子等干扰物质存在时鸟嘌呤和腺嘌呤的峰电流变化。通过将8mM不同的干扰物质加
入0.1M 含有80μM鸟嘌呤和80μM腺嘌呤的PBS pH＝3缓冲溶液中，检测3D‑rGO/Fe3O4‑
AuNPs/HP‑ β‑CD/GCE的DPV峰电流值。

[0099] 上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和保护范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域中普通工程技术人员
对本方面的技术方案做出各种的变型和改进，均应落入本发明的保护范围。