鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用。本发明采用序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码鸭坦布苏病毒E2蛋白，包含所述鸭坦布苏病毒E2蛋白的免疫组合物可用于制备鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗，该疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对鸭没有致病性，并且本发明的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

权利要求

1.一种免疫组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

S1、将密码子优化后的鸭坦布苏病毒E2蛋白的编码基因克隆到真核表达载体中，得到含有鸭坦布苏病毒E2蛋白编码基因的重组质粒，所述编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示；

S2、将所述重组质粒转染CHO细胞，通过培养、筛选、驯化得到能够稳定的高度表达E2蛋白的重组CHO细胞株；

S3、对步骤S2中的重组CHO细胞株进行发酵培养，得到重组鸭坦布苏病毒E2蛋白；

S4、将步骤S3中的重组鸭坦布苏E2蛋白加入到佐剂中，即得免疫组合物，所述重组鸭坦布苏病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

其中，重组CHO细胞是使用谷氨酰胺合成酶筛选扩增系统进行筛选，相应的筛选方法包括：使用的表达载体包含有谷氨酰胺合成酶基因，在CHO细胞中能够表达谷氨酰胺合成酶，通过使用不含有谷氨酰胺的培养基以及添加谷氨酰胺合成酶抑制剂进行重组细胞的筛选。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述真核表达载体类型选自pSV2-GS、pCI-GS、pcDNA4-GS 中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述CHO细胞选自CHO-DG44细胞、CHO-DX11细胞、CHO-K1细胞和CHO-S细胞中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，发酵培养中使用的培养基为传代培养基。

说明书

鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基因工程亚单位疫苗，具体涉及一种鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于动物免疫药物技术领域。

背景技术

[0002] 鸭坦布苏病毒病又名鸭黄病毒病，或鸭减蛋综合征等，是由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)引起的一种传染病。该病于2010年在中国东南部一带首次发现，主
要对蛋鸭致病，也发生于种鹅，肉鸭。蛋鸭发病临床表现为肢体站立不稳，行走困难，采食量下降，产蛋量骤然减少，在短时间内产蛋减少能超过90％，部分病鸭在数日内死亡，死亡率为5％-10％。内脏病变为卵巢发生出血，萎缩，卵泡破裂等，部分出现脑膜出血。

[0003] 坦布苏病毒具有典型的黄病毒属的基因结构组成，其基因组由衣壳蛋白C、M蛋白，囊膜E蛋白和7个非结构蛋白组成，黄病毒的囊膜蛋白E蛋白包含许多与宿主嗜性、宿主细胞膜融合及宿主细胞表面受体结合相关的抗原位点，且具有较高的保守性和免疫原性。

[0004] 有研究发现该病毒可能作为一种人畜共患病感染人群，所以针对这种新出现的鸭坦布苏病毒，使用经病毒灭活的疫苗或细胞致弱病毒活疫苗均存在很大的生物安全风险。
现有的鸭坦布苏病毒商业化疫苗主要为弱毒疫苗，弱毒疫苗存在毒力返强的可能性，对免
疫鸭群存在很大的风险，其免疫效果易受多种因素的影响，而利用原核蛋白表达系统表达
的蛋白生物活性欠佳。

[0005] 由于该病原为新出现的病原，相关研究还有待深入。因此迫切需要研制一种新型安全高效的鸭坦布苏病毒病疫苗以用来控制我国这种新出现的鸭病。

发明内容

[0006] 本发明旨在提供一种免疫组合物，以解决现有技术中的问题。

[0007] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种免疫组合物，包含：

[0008] 采用序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸭坦布苏病毒E2蛋白。

[0009] 本发明进一步的技术方案是：所述的鸭坦布苏病毒E2蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

[0010] 本发明的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对鸭坦布苏病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

[0011] 本发明的又一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防鸭坦布苏病毒感染的药剂的用途。

[0012] 本发明的又一目的在于提供一种核酸分子，其可以用于编码鸭坦布苏病毒E2蛋白，包含SEQ ID NO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的
顺序核苷酸序列。

[0013] 本发明的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于在受试动物中诱导针对鸭坦布苏病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

[0014] 本发明的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于预防动物受鸭坦布苏病毒感染的药剂的用途。

[0015] 例如，所述的药剂可以是鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗。

[0016] 本发明的又一目的在于提供一种蛋白，其选自由以下组成的组：

[0017] SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的蛋白。

[0018] 本发明的又一目的在于提供一种适用于在受试动物体内产生针对鸭坦布苏病毒的免疫反应的免疫组合物，包含：

[0019] 所述的鸭坦布苏病毒E2蛋白和佐剂。

[0020] 本发明的另一目的在于所述的蛋白用于制备鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗方面的应用。

[0021] 本发明的另一目的在于一种所述的免疫组合物的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

[0022] S1、将密码子优化后的鸭坦布苏病毒E2蛋白基因克隆到对应的真核表达载体中，得到含有鸭坦布苏病毒E2蛋白编码基因的重组质粒；

[0023] S2、将所述重组质粒转染CHO细胞，通过培养、筛选、驯化得到对应的悬浮稳定高度表达E2蛋白的重组CHO细胞株；

[0024] S3、对S2步骤中的CHO细胞株进行发酵培养，得到对应的重组鸭坦布苏病毒E2蛋白；

[0025] S4、将S3步骤中的重组E2蛋白加入到佐剂中，即得所述免疫组合物。

[0026] 优选的技术方案中，所述真核表达载体类型选自pSV2-GS，pCI-GS，pcDNA4-GS中的任意一种，但不限于此。

[0027] 优选的技术方案中，所述CHO细胞选自CHO-DG44细胞、CHO-DX11细胞、CHO-K1细胞和CHO-S细胞中的任意一种，但不限于此。

[0028] 优选的技术方案中，所述CHO细胞是使用谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)筛选扩增系统进行筛选，所述筛选包括使用的表达载体包含有谷氨酰胺合成酶基因，其在CHO细胞中能够表达谷氨酰胺合成酶，通过使用不含有谷氨酰胺的培养基以及添加谷氨酰胺合成酶抑制剂进行重组细胞筛选的步骤。

[0029] 优选的技术方案中，步骤S3中，发酵培养中使用的培养基为传代培养基。

[0030] 本发明公开了一种CHO细胞表达的鸭坦布苏病毒重组亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在鸭体内产生较强的体液免疫，免疫后的鸭能够抵御DTMUV感染，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，其目的在于提供一种可大规模工业化生产的鸭坦布
苏病毒重组亚单位疫苗的制备方法：先分别克隆包含E2蛋白编码基因的真核表达载体，然
后转染CHO细胞，通过选择，筛选得到悬浮稳定高效表达E2蛋白的CHO细胞株；发酵培养上述的细胞株，收获培养上清中的重组E2蛋白；最后将上清中的E2蛋白进行适当吸收后与佐剂
充分混匀得到重组表达亚单位疫苗。

[0031] 本发明目的在于提供一种免疫效果好、工艺更安全的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗，本发明使用CHO细胞表达重组鸭坦布苏病毒E2蛋白。本发明生产过程不涉及全病毒培养，通过CHO细胞进行蛋白表达，产品的抗原性、免疫原性与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对鸭没有致病性，并且本发明的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

[0032] 采用上述方案后，本发明与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：

[0033] 提供的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对鸭没有致病性，并且本发明的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，同时大大降低了疫苗生产成本。

附图说明

[0034] 构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

[0035] 图1为将E2蛋白基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到1.5kbp附近出现一个条带；其中1为DTUMV-E2基因，2为阴性对照，M为分子量标记；

[0036] 图2为多个E2蛋白基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，1.5kbp条带附近出现阳性样品。其中1～5均为E2蛋白基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，6为非阳性样品，M为分子量标记；

[0037] 图3为构建的含有目的基因的转移载体pCI-E2-GS图谱；

[0038] 图4为实施例3中收获的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果，E2蛋白的细胞培养物在分子量约53kDa附近出现目的条带；其中1为实施例3中收获的细胞培养物上
清，2为阴性对照，M为分子量标记；

[0039] 图5为实施例4中SDS-PAGE电泳后的产物Western Blot检测结果；其中1为重组CHO细胞表达样品，2为阴性对照，M为分子量标记；

[0040] 图6为使用本发明疫苗后，攻毒后对照组鸭解剖图，显示心脏如煮熟样，卵黄性腹膜炎及脾肝有出血点。

具体实施方式

[0041] 应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0042] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

[0043] 本发明提供了一种免疫组合物，包含：

[0044] 采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸭坦布苏病毒E2蛋白。

[0045] 本发明也涉及一种诱导针对鸭坦布苏病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本发明的疫苗。

[0046] 本发明也涉及一种保护受试动物免受鸭坦布苏病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的疫苗。

[0047] 本发明还包括适用于诱导针对鸭坦布苏病毒的免疫反应的疫苗。本发明的疫苗可为包含上述核酸分子的质粒。核酸分子可被并入病毒颗粒中。疫苗可还包含佐剂分子。佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

[0048] 本发明的疫苗还包含蛋白分子。本发明提供选自由以下组成的组的蛋白：包含SEQ ID NO:2的蛋白；在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白；SEQ ID NO:2的片段；与SEQ ID NO:2的片段95％相同的蛋白。

[0049] 本发明还提供一种选自由以下组成的组的蛋白：(a)SEQ ID NO:2；(b)在如SEQ ID NO:2所述的全长序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的蛋白；(c)SEQ ID NO:2的包含SEQ ID NO:2的20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:2的氨基酸序
列的整个长度上95％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段。

[0050] 本发明的疫苗还包含核酸分子。本发明还提供包含编码上文所述的一种或多种蛋白分子的序列的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的
序列：SEQ ID NO:1；在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的整个长度上95％相同的核酸序列；SEQ ID NO:1的片段；与SEQ ID NO:1的片段95％相同的核苷酸序列。

[0051] 本发明一些方面提供诱导针对鸭坦布苏病毒的免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：向个体施用鸭坦布苏病毒抗原和/或其组合物。

[0052] 本发明另外的方面提供保护个体免受鸭坦布苏病毒感染的方法。所述方法包括以下步骤：向所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列的核酸分子或组合物；其中所述
核酸序列在所述个体的细胞中表达，并且针对由所述核酸序列编码的蛋白诱导保护性免疫
反应。

[0053] 本发明的一些方面提供一种诱导针对鸭坦布苏病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本发明的核酸分子。

[0054] 本发明的一些方面提供一种保护受试动物免受鸭坦布苏病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的核酸分子。

[0055] 本发明的一些方面提供一种适用于在受试动物中产生针对鸭坦布苏病毒的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的核酸分子以及佐剂分子。所述佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

[0056] 本发明的疫苗还包括一种或多种如上所述的核酸分子和一种或多种由所述核酸分子编码的蛋白。

[0057] 1.定义.

[0058] 本发明所用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的而并不旨在限制。如在说明书和所述权利要求中所使用，除上下文另外明确规定之外，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。

[0059] 对于本发明所列举的数值范围，明确涵盖了在有相同精密度之间的每个插入的数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。

[0060] 如本发明所用的“佐剂”意指被添加到本发明所述的疫苗中来增强由下文所述编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。

[0061] 如本发明所用的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。

[0062] 如本发明所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或动物的细胞中指导表达的启动子和
多聚腺苷酸化信号。

[0063] 如本发明所用的“互补体”或“互补”意指核酸可以指在核苷酸或核酸分子的核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或者Hoogsteen碱基配对。

[0064] 如本发明所用的“共有”或“共有序列”意指基于分析特定鸭坦布苏病毒抗原的一队列的多个亚型的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含蛋白的疫苗可以被用来诱导针对特定鸭坦布苏病毒抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫，所述疫苗包含编
码这些蛋白的共有序列和/或核酸分子。

[0065] 如本发明可互换使用的“电穿孔”、“电-透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。

[0066] 如本发明所用的相对于核酸序列的“片段”意指编码能够在与全长野生型病毒株鸭坦布苏病毒抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽的核酸序列或其一部分。所述片
段可以是选自编码下文所述的蛋白片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。

[0067] 就多肽序列来说，“片段”或“免疫原性片段”意指能够在与全长野生型病毒株鸭坦布苏病毒抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽。蛋白的片段可以包含蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，蛋白的片段可以包含蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少
30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个
氨基酸或更多。

[0068] 如本发明所用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件
包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本发
明所用的术语“表达形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有可操作地连接至编码蛋白的编码序列的必须的调控元件，以使得当存在于所述个体的细胞中时，编码序列将表达。

[0069] 如本发明所用的术语“同源性”是指互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。至少部分抑制完全互补序列杂交于靶标核酸的部分互补序列是使用功能术语“基本上同源”来提及。当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时，如本发明所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序列的链。当关于单链核酸序列使用时，如本发明所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于单链核酸模板序列(即，是单链核酸模板序列的互补序列)。

[0070] 在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下，如本发明所用的“相同”或“同一性”意指在指定区域中序列具有相同残基的指定百分比。可以通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量
以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结
果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或
多个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在
计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是
等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。

[0071] 如本发明所用的“免疫反应”意指响应于抗原如鸭坦布苏病毒共有抗原的引入，宿主的免疫系统(例如动物的免疫系统)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形式。

[0072] 如本发明所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

[0073] 核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方
法来获得。

[0074] 基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所
述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已
知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。

[0075] 如本发明所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏
元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病
毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂而基本地或区别地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7
启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMVIE启动子。

[0076] “信号肽”和“前导序列”在本发明可互换使用并且是指可以被连接在本发明所述的鸭坦布苏病毒蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白的位置。本发明所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白的剩余部分裂解，所述蛋白在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白。信号肽/前导序列连接在所述蛋白的N端。

[0077] 如本发明所用的“严格的杂交条件”意指这样的条件，即在所述条件下如在核酸的复杂混合物中第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)进行杂交。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。严格的条件在限定的离子强度pH下可以被选择为比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5-10℃。所述Tm可以是这样的温度(在限
定的离子强度、pH以及核酸浓度下)，在所述温度下与靶标互补的50％的探针与靶序列在平衡状态下进行杂交(因为靶序列过量存在，在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占用)。严格条件可以是那些条件，即其中盐浓度小于约1.0M的钠离子，如在pH 7.0至8.3下约0.01-
1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短的探针(例如，约10-50个核苷酸)为至少约
30℃且对于长的探针(例如，大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严格的条件还可以通过添
加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择的或特定的杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格的杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC以及1％SDS、在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。

[0078] 如本发明所用的“基本上互补”意指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、
270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的互补体至少60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者意指两个序列在严格的杂交条件下进行杂交。

[0079] 如本发明所用的“基本上相同”意指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、
100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸区域内是至少60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的，或者就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补体基本上互补，则第一序列和第二序列也这样相同。

[0080] “亚型”或“血清型”：如本发明交换使用的并且关于鸭坦布苏病毒，意指鸭坦布苏病毒的基因变体，以使得一个亚型被免疫系统识别而从不同的亚型中分离。

[0081] 本发明就核酸而言所用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上相同的核酸；或者(iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

[0082] 就肽或多肽而言的“变体”通过氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上不同，但是保留至少一种生物活性。变体还意指具有与参考蛋白基本上相同的氨基酸序列的蛋白，所述参考蛋白具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可以部分通过考虑氨基
酸的亲疏水性指数来识别。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本
领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白功能。在一个方
面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生
物功能的蛋白的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均
亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域所了解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用具有
彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受
所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解
为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水
性、电荷、大小以及其它特性所揭示的。

[0083] 如本发明所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA载体。

[0084] 2.疫苗

[0085] 本发明的疫苗可被设计来控制受试动物中针对一种或多种鸭坦布苏病毒血清型的免疫反应的程度或强度。疫苗可包含抑制它整合至染色体中的元件或试剂。疫苗可为编
码鸭坦布苏病毒E2蛋白的RNA。可将RNA疫苗引入细胞中。本发明的疫苗可包含鸭坦布苏病
毒E2蛋白。鸭坦布苏病毒E2蛋白是通过诱导1)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应、2)T辅助细胞反应以及/或3)B细胞反应，或优选所有以上提及的反应，以达成交叉递呈来进行的免疫介
导的病毒清除的靶标。

[0086] 所述抗原可以包含使它们特别有效地作为免疫原的蛋白表位，可针对所述免疫原诱导抗鸭坦布苏病毒免疫反应。鸭坦布苏病毒抗原可以包括全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。

[0087] 一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本发明核酸编码序列具有95％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本发明核酸编码序列具有96％同源
性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本发明核酸编码序列具有97％同
源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本发明核酸编码序列具有98％
同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本发明核酸编码序列具有
99％同源性的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本发明所公开的蛋白的编码序列同源
的本发明所公开的编码序列的核酸分子包含编码IgE前导序列的连接至编码本发明所公开
的同源蛋白序列的编码序列的5’末端的序列。

[0088] 在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码IgE前导物的编码序列。

[0089] 一些实施方案涉及SEQ ID NO:1的片段。片段可以是至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少
97％、至少98％或者至少99％的SEQ ID NO:1。片段可与SEQ ID NO:1的片段至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。片段可与SEQ ID NO:1的片段至少80％、至少
85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，片段包含编码前导序列的序列，例如免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，例如像IgE前导物的编码序列。

[0090] 一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2同源的蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2中所述的蛋白序列具有95％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID 
NO:2中所述的蛋白序列具有96％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID 
NO:2中所述的蛋白序列具有97％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID 
NO:2中所述的蛋白序列具有98％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQID 
NO:2中所述的蛋白序列具有99％同源性的免疫原性蛋白。

[0091] 一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2相同的蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上80％相同的氨基酸序列的
免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的
整个氨基酸序列长度上85％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在
如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上90％相同的氨基酸
序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基酸
序列的整个氨基酸序列长度上91％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及
具有在如SEQ IDNO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上92％相同的
氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有
氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上93％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方
案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上94％
相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全
长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些
实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度
上96％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所
述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上97％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋
白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸
序列长度上98％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID 
NO:2中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上99％相同的氨基酸序列的免
疫原性蛋白。

[0092] 在一些实施方案中，蛋白不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白不含IgE前导物。蛋白的片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少
40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少
80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的蛋白。可提供SEQ ID NO:2的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少
65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

[0093] 可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2的免疫原性片段同源的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少
80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:295％同源的蛋白。一些实施方案涉及与本发明蛋白序列的免疫原性片段具有96％
同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本发明蛋白序列的免疫原性片段具有97％同
源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本发明蛋白序列的免疫原性片段具有98％同源
性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本发明蛋白序列的免疫原性片段具有99％同源性
的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导序列，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

[0094] 可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2的免疫原性片段相同的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少
80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的在SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的整个长度上80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％相同的蛋白。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

[0095] 3.疫苗构建体和质粒

[0096] 疫苗可包括编码鸭坦布苏病毒E2蛋白、鸭坦布苏病毒抗原以及鸭坦布苏病毒E2蛋白/抗原的组合的核酸构建体或质粒。本发明提供可以包含编码本发明所公开的鸭坦布苏
病毒抗原的核酸序列的遗传构建体，所述核心抗原包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列。另外，本发明提供可包含编码本发明
公开的鸭坦布苏病毒表面抗原(包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列)的核酸序列的遗传构建体。所述遗传构建体可以作为功
能性染色体外的分子而存在。所述遗传构建体可以是包括着丝粒、端粒或质粒或粘粒的线
性微型染色体。

[0097] 所述遗传构建体还可以是重组病毒载体的基因组的一部分，所述重组病毒载体包括重组腺病毒、重组腺病毒伴随病毒以及重组牛痘。遗传构建体可以是在减毒的活微生物
或活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。

[0098] 遗传构建体可以包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多聚腺苷酸化信号。

[0099] 核酸序列可组成可以是载体的遗传构建体。所述载体能够以在动物中有效引发免疫反应的量在动物的细胞中表达抗原。所+述载体可以是重组体。所述载体可以包含编码抗原的异源核酸。所述载体可以是质粒。所述载体可以适用于用编码抗原的核酸来转染细胞，所述转化的宿主细胞在其中发生抗原表达的条件下培养并维持。

[0100] 编码序列可以被优化来用于表达的稳定性和高水平。在一些情况下，选择密码子来减少RNA二级结构的形成，如由于分子内键而形成的二级结构。

[0101] 所述载体可以包含编码抗原的异源核酸，并且可以进一步包含可以在抗原编码序列的上游的起始密码子和可以在抗原编码序列的下游的终止密码子。起始密码子和终止密
码子可以与抗原编码序列在框中。所述载体还包含可操作地连接至抗原编码序列的启动
子。可操作地连接至抗原编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠
乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重
复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、鸟类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子、爱巴二氏(Epstein Barr)病毒(EBV)启动子或劳氏肉
瘤病毒(RSV)启动子。所述启动子还可以是来自人基因的启动子，所述人基因如人肌动蛋
白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。所述启动子还可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。

[0102] 所述载体还可以包含多聚腺苷酸化信号，所述多聚腺苷酸化信号可以在鸭坦布苏病毒核心蛋白编码序列的下游。所述多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化
信号或人β-球蛋白多聚腺苷酸化信号。所述SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体
(Invitrogen，San Diego，CA)的多聚腺苷酸化信号。

[0103] 载体也可包含在共有鸭坦布苏病毒核心蛋白编码序列或共有鸭坦布苏病毒表面抗原蛋白编码序列的上游的增强子。所述增强子对于DNA表达是必须的。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、HA、RSV或者EBV的一种增强子。

[0104] 载体还可以包含动物的复制起点，以便将载体维持在染色体外并在细胞中产生载体的多个拷贝。所述载体可以是来自Invitrogen(San Diego，CA)的pVAX1、pCEP4或者
pREP4，其可以包含爱巴二氏病毒的复制起点和核抗原EBNA-1编码区域，这可以在没有整合的情况下产生高拷贝附加型复制。所述载体可以是具有变化的pVAX1或者pVax1变体，如本
发明所述的变体质粒。所述变体pVax1质粒是主链载体质粒pVAX1(Invitrogen，Carlsbad 
CA)的2998碱基对变体。所述CMV启动子位于碱基137-724处。T7启动子/引发位点位于碱基
664-683处。多克隆位点位于碱基696-811处。牛GH多聚腺苷酸化信号是在碱基829-1053处。
卡那霉素(Kanamycin)抗性基因是在碱基1226-2020处。pUC起点是在碱基2320-2993处。

[0105] 所述载体可以是pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白。所述载体可以是pYES2(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae strain)中产生蛋白。所述载体还可
以具有MAXBACTM完整的杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白。所述载体还可以是pcDNAI或者pcDNA3(Invitrogen，SanDiego，
Calif.)，其可用于在动物细胞如Sf9细胞系中产生蛋白。所述载体可以是通过常规技术和
容易可得的起始物质来产生蛋白的表达载体或系统，所述技术和物质包括Sambrook等，
Molecular Cloning and Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor(1989)。

[0106] 本发明的技术方案可以先克隆包含E2蛋白编码基因的真核表达载体，然后转染CHO细胞，通过选择，筛选得到悬浮稳定高效表达E2蛋白的CHO细胞株；发酵培养2所述的细胞株，纯化后得到重组E2蛋白；将重组E2蛋白与佐剂充分混匀得到重组表达亚单位疫苗。

[0107] 本发明使用CHO细胞表达鸭坦布苏病毒E2蛋白，使用真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，能够从细胞培养上清中收获目的蛋白，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，不仅缩短了蛋白纯化时间和简化
疫苗生产步骤，也大大降低了疫苗生产成本。而且使用了优化的E2蛋白序列，使用悬浮培养CHO细胞进行表达，表达量非常高，蛋白免疫原性好。

[0108] 本发明中E2蛋白序列可以是原始序列，增加以及截短的序列，使用载体pSV2-GS，pCI-GS，pcDNA4-GS，优选的用pCI-GS。CHO细胞系可以是为DG44，DXB11，CHO-K1，CHO-S细胞株，优选的CHO-S。佐剂选自白油(M52)、硬脂酸铝、司本、吐温的一种或者两种以上的组合。

[0109] 实施例1 重组真核表达载体pCI-E2-GS的构建

[0110] 1.密码子优化的DTMUV E2基因来自南京金斯瑞生物科技有限公司，并克隆到pUC-57载体上，构建了pUC-E2质粒载体。优化后的E2基因序列如SEQ ID NO:1所示。

[0111] 2.E2基因扩增 以pUC-E2作为模板，E2-F、E2-R作为引物进行PCR扩增(E2-F、E2-R的基因序列如SEQ ID NO：3、4所示)，扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

[0112] 表1 E2基因扩增体系

[0113]

[0114] 将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在1.5kbp附近的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

[0115] 3.酶切 将pCI-GS质粒和纯化后的E2基因PCR产物分别使用XhoⅠ、KpnⅠ37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

[0116] 表2 E2基因酶切反应体系

[0117]

[0118] 表3 pCI-GS质粒酶切反应体系

[0119]

[0120] 4.连接 将酶切过的pCI-GS质粒和E2基因酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

[0121] 表4 E2基因与pCI-GS质粒连接体系

[0122]

[0123]

[0124] 5.转化 取10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

[0125] 6.菌落PCR和测序鉴定 挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，E2-F和E2-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现1.5kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。得到真核表达载体pCI-E2-GS。构建好的载体图谱如图3所示。

[0126] 实施例2 表达E2蛋白的重组CHO细胞的构建与筛选

[0127] 1.细胞转染

[0128] 1.1准备细胞 取对数生长期的CHO细胞，取样计数，以1×106cells/ml的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000rpm离心4分钟后，弃上清，用20ml左右的新鲜CHO-WM培养基重悬，再次离心，1000rpm离心4分钟，弃上清后用少量培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43×107cells/ml。

[0129] 1.2质粒与细胞混合 取实施例1中pCI-E2-GS质粒载体5ug，加入至EP管中，添加0.7ml细胞，混合均匀后，静置15分钟。

[0130] 1.3电转 280V 20ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6×106cells/ml时，添加50uM MSX(L-methionine sulphoximine)加压筛选。

[0131] 2.单克隆筛选

[0132] 2.1用苏州沃美生物技术有限公司的CHO细胞无血清无蛋白培养基CHO-WM细胞培养基+50uM MSX重新悬浮细胞，计数。

[0133] 2.2铺板 稀释细胞至5个/mL，取200ul混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4-6h。记录单个细胞的孔。

[0134] 2.3待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，100ul 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL CHO-WM培养基(含10％FBS+50uM MSX)终止消
化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，Elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。

[0135] 3.细胞摇瓶发酵

[0136] 3.1传代培养基的配置：使用CHO-WM培养基添加50uM MSX作为传代培养基，置于37℃水浴锅预热至37℃。

[0137] 3.2从CO2恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

[0138] 3.3稀释细胞至2.5-3.5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

[0139] 3.4每隔24h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

[0140] 实施例3 SDS-PAGE检测

[0141] 将实施例2中收获的细胞培养物上清进行SDS-PAGE检测，同时使用空的CHO细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×上样缓冲液，沸水浴
5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。

[0142] 实施例2中培养物的检测结果如图4所示，在分子量约53kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

[0143] 实施例4 Western Blot检测

[0144] 将实施例3中SDS-PAGE电泳后的产物分别转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，鸭源抗DTMUV多抗血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗鸭多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。结果如图
5所示，图中重组CHO上清样品有细胞条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。

[0145] 实施例5 蛋白含量与琼扩检测

[0146] 收获的CHO培养上清液中E2蛋白含量使用Elisa方法检测。操作方式如下：用包被缓冲液稀释鸭抗DTMUV多抗血清至合适浓度，每孔100μl，4℃过夜，PBST洗涤三次，1％BSA封闭1h。加入不同浓度的抗原标准品(通过粒子交换层析，疏水层析，分子筛纯化得到的蛋白)和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入检测DTMUV-E2蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入二抗-即HRP标记的羊抗鸭IgG，37℃孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2M H2SO4终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中DTMUV-E2蛋白的量。

[0147] 按照实施例5，大规模制备的DTMUV-E2蛋白，Elisa检测结果如下，疫苗原液中蛋白的平均含量分别约2.1mg/mL。

[0148] 使用琼扩方法检测表达的E2蛋白效价，在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入DTMUV琼扩检测标准血清，周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次方的表达抗原。倒置孵育72h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价。琼扩效价检测结果如下：DTMUV-E2蛋白琼扩效价为1:256。

[0149] 实施例6 亚单位疫苗制备

[0150] 将收获的表达抗原上清使用生理盐水稀释，使得DTMUV-E2蛋白琼扩效价达到1:16。然后将浓缩的E2蛋白抗原与油佐剂按照2:3的比例配置成油乳剂疫苗，具体的，每1L的混合疫苗原液加入白油1429g，司本70.2g，硬脂酸铝8.43g以及吐温53.3g。然后使用高速剪切乳化机乳化混匀，质检合格后置于4℃保存。

[0151] 实施例7 免疫实验

[0152] 用42～120日龄健康易感北京鸭(或樱桃谷鸭)10只，各胸部肌肉接种1.0ml疫苗，首次免疫14日龄后，按相同剂量和接种途径对免疫鸭进行二次免疫。二次免疫后28日，连同不免疫对照鸭10只，各肌肉注射DTMUV-MD株病毒液0.5ml(含100个DID50)。攻毒后2日，对所有鸭进行采血，分离血清，使用鸭胚进行病毒分离。对照鸭10只病毒分离阳性，免疫鸭9只病毒分离阴性，说明疫苗保护合格。可以观察到对照组出现鸭发热，减食，腹泻，双腿瘫痪向后伸展等症状。剖检对照组鸭可发现脾脏肿大，心脏如煮熟样，卵黄破裂出现卵黄性腹膜炎，脾肝有出血点(图6)。

[0153] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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