本发明公开的是一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPAPAHs的方法。将土壤中土著细菌以PAHs为唯一碳源进行驯化、富集，监测培养液中多环芳烃双加氧酶α亚基(RHDα)基因丰度和细菌群落变化，挑选出合适的细菌群落并扩大培养，然后接种于土壤，即可降低土壤中PAHs含量。所述土著PAHs降解菌群落有较高含量RHDα基因；本发明能够通过提高农田土壤中包括nidA和nahAc在内的RHDα基因丰度，有效去除污染农田中USEPA PAHS，具有高效、环保的优点。
1.一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、土著PAHs降解菌群落的制备：
（1）将土壤悬浊液加入预先配制的含有PAHs的土壤浸出液中，对土壤中的细菌以PAHs为唯一碳源进行驯化；
（2）监测驯化过程中参与PAHs降解的细菌RHDα 基因的丰度以及细菌群落的变化，经qPCR测定其中nidA和nahAc和基因拷贝数，驯化过程中nidA和nahAc的含量满足要求的做为一级种子液；
所述nidA的正向引物序列和反向引物序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示，SEQ ID No.1：TTCCCGAGTACGAGGGATACSEQ ID No.2：TCACGTTGATGAACGACAAA；
所述nahAc的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，SEQ ID No.3：ACTTGGTTCCGGAGTTGATGSEQ ID No.4：CAGGTCAGCATGCTGTTGTT；
属水平上，所述土著PAHs降解菌群落各降解菌的组成比例分别为：Achromobacter ：
0.72–25.45%、Nocardioides ：0.02%–19.88%、Methylobacillus：7.55–22.91%、Pseudomonas：6.18–30.03%、Pseudoxanthomonas：3.06–10.74%、Rhizobium：0.37–8.56%、Methylophilus ：2.35–14.34%和 Shinella：0.97–10.56%；
门水平上，所述土著PAHs降解菌群落的各降解菌的组成比例分别为：Proteobacteria：
78.58–99.54%、Actinobacteria：0.14–19.96%、Bacteroidetes：0.23–1.80%、Verrucomicrobia：0.08–0.33%；
将上述二级种子液接种于土壤，通过提高土壤中nidA和nahAc基因含量即可降低土壤PAHs含量。
2.根据权利要求1所述的一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法，其特征在于，所述土著PAHs降解菌群落的监测方法为：每隔两天采样一次并进行细菌群落结构鉴定和RHDα基因含量检测。
3.根据权利要求1所述的一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法，其特征在于，所述土著PAHs降解菌群落的制备方法为：（1） 土壤浸出液的制备：将未污染的土壤和水以1:10的比例混合并搅拌均匀，静置2 h后将上清液5000 rpm/min离心10 min以去除不溶性杂质，121 ℃高温灭菌20 min后室温保存；
（2）一级种子液：按照10%的接种量将污染土壤的悬浊液接种到土壤浸出液中，再加入终浓度为30 mg/L的10种PAHs经驯化、富集后，每隔两天将培养液5000 rpm/min离心后一部分提取其基因组DNA，另一部分加入终浓度为30%的甘油后冷冻保存为一级种子液；
（3）细菌群落结构的鉴定和RHDα基因含量的测定：经16S rRNA基因高通量测序，测定该细菌群落16S rRNA基因V3-V4区；经qPCR测定其中nidA和nahAc和基因拷贝数；
（4）二级种子液：将所选的一级种子液经过LB培养基扩大培养后，8000 rpm/min 4℃离心5 min，弃去上清液，加入蒸馏水，再次离心，该操作重复三次，以充分洗去菌体中残留的LB培养基；最后用蒸馏水调整菌悬液浓度OD600， 4℃保存备用为二级种子液。
4.根据权利要求1所述的一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法，其特征在于，所述一级种子液OD600值不小0.5。
5.根据权利要求1所述的一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法，其特征在于，所述一级种子液中nidA和nahAc基因拷贝数分别达到至少3000和10000个每毫升。
6.根据权利要求1所述的一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法，其特征在于，所述二级种子液浓度OD600值为0.2-1.0。
7.根据权利要求1所述的一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法，其特征在于，所述的PAHs为以下9种PAHs：萘、苊烯、苊、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽和䓛，浓度都为3 mg/L。
8.根据权利要求1所述的一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法，其特征在于，所述土壤接种方式为按照每1kg土接种100 mL土著PAHs降解菌群落，直接将二级种子液喷洒到土壤并搅拌均匀。
一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的
方法
技术领域
[0001] 本发明涉及环境工程微生物技术领域，具体是涉及一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法。
背景技术
[0002] 多环芳烃(PAHs)是一种环境中广泛存在的一类难降解、高风险有机污染物。现发现已知的PAHs多达几百种，由于其有致癌、致畸、致突变的“三致”效应，且在土壤中具有分布广、隐蔽性大、治理困难等特点。其中16种被美国环保署列为优先控制的PAHs。由于污水灌溉、大气沉降、石化泄露等造成我国及全球土壤PAHs污染日趋严重。根据全国土壤污染调查公报显示，全国土壤中PAHs超标率达到1.4％。
[0003] 目前常见的土壤中PAHs去除方法，主要通过物理或化学方法将土壤中PAHs固定或分解。但是由于农田土壤的特殊应用，常用的物理或化学方法并不能够适用于修复农田土壤PAHs污染。因此利用微生物修复这一具有低能耗、高效和环境安全的生物技术修复农田土壤具有实际意义。然而，仅以某一种或某几种纯培养的微生物作用于污染土壤，尽管有一定的降解效果，但不仅微生物用量大，而且不利于天然土壤微生物种群的平衡。目前，尚未发现利用驯化、富集土著PAHs降解菌同时去除农田土壤中美国环保署优先控制的多环芳烃(USEPA PAHs)的方法。
发明内容
[0004] 本发明旨在填补利用土著PAHs降解菌群落同时去除农田土壤中美国环保署优先控制的多环芳烃(USEPA PAHs)的方法技术应用的空白，提供一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法。
[0005] 本发明的技术方案是：
[0006] 一种利用土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤一、土著PAHs降解菌群落的制备：
[0008] (1)将土壤悬浊液加入预先配制的含有PAHs的土壤浸出液中，对土壤中的细菌通过以PAHs为唯一碳源进行驯化；
[0009] (2)监测驯化过程中参与PAHs降解的细菌RHDα基因的丰度以及细菌群落的变化，驯化过程中nidA和nahAc的含量满足要求的做为一级种子液；
[0010] 所述nidA引物的正向引物序列和反向引物序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示，
[0011] SEQ ID No.1：TTCCCGAGTACGAGGGATAC
[0012] SEQ ID No.2：TCACGTTGATGAACGACAAA；
[0013] 所述nahAc引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，
[0014] SEQ ID No.3：ACTTGGTTCCGGAGTTGATG
[0015] SEQ ID No.4：CAGGTCAGCATGCTGTTGTT；
[0016] 所述土著PAHs降解菌群落的组成为：无色菌属(Achromobacter)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、甲基菌属(Methylobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、嗜甲基菌属(Methylophilus)和志贺氏杆菌(Shinella)，该群落拥有广泛的降解谱，其在土壤浸出液中对于10种PAHs都具有良好的降解效率；
[0017] (3)将所述一级种子液经扩大培养得到二级种子液；
[0018] 步骤二、土壤接种：
[0019] 将上述二级种子液接种于土壤，通过提高土壤中nidA和nahAc基因含量即可降低土壤PAHs含量。
[0020] 进一步地，在上述方案中，属水平上，所述土著PAHs降解菌群落各降解菌的组成比例分别为：Achromobacter(0.72–25.45％)、Nocardioides(0.02％–19.88％)、Methylobacillus(7.55–22.91％)、Pseudomonas(6.18–30.03％)、Pseudoxanthomonas(3.06–10.74％)Rhizobium(0.37–8.56％)、Methylophilus(2.35–14.34％)和Shinella(0.97–10.56％)；
[0021] 门水平上，所述土著PAHs降解菌群落的各降解菌的组成比例分别为：Proteobacteria(78.58–99.54％)，Actinobacteria(0.14–19.96％)，Bacteroidetes(0.23–1.80％)，Verrucomicrobia(0.08–0.33％)；
[0022] 进一步地，在上述方案中，所述土著PAHs降解菌群落的监测方法为：每隔两天采样一次并进行细菌群落结构鉴定和RHDα基因含量检测。
[0023] 进一步地，在上述方案中，所述土著PAHs降解菌群落的制备方法具体为：
[0024] (1)土壤浸出液的制备：将未污染的土壤和水以1:10的比例混合并搅拌均匀，静置2h后将上清液5000rpm/min离心10min以去除不溶性杂质，121℃高温灭菌20min后室温保存；
[0025] (2)一级种子液：按照10％的接种量将污染土壤的悬浊液接种到土壤浸出液中，再加入终浓度为30mg L-1的10种PAHs经驯化、富集后，每隔两天将培养液5000rpm/min离心后一部分提取其基因组DNA，另一部分加入终浓度为30％的甘油后冷冻保存为一级种子液；
[0026] (3)细菌群落的鉴定和RHDα基因含量的测定：经16S rRNA基因高通量测，测定该细菌群落16S rRNA基因V3-V4区；经qPCR鉴定其中nidA和nahAc和基因拷贝数；
[0027] (4)二级种子液：将所选的一级种子液经过LB培养基扩大培养后，8000rpm/min 4℃离心5min，弃去上清液，加入蒸馏水，再次离心，该操作重复三次，以充分洗去菌体中残留的LB培养基；最后用蒸馏水调整菌悬液浓度OD600，4℃保存备用为二级种子液。
[0028] 优选地，在上述方案中，所述一级种子液OD600值不小0.5。
[0029] 优选地，在上述方案中，所述一级种子液中nidA和nahAc基因拷贝数分别达到至少3000和10000个每毫升。
[0030] 优选地，在上述方案中，所述二级种子液浓度OD600值为0.2-1.0。
[0031] 进一步地，所述的PAHs为以下10种PAHs：萘、苊烯、苊、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽和 浓度都为3mg L-1。
[0032] 进一步地，所述接种方式为按照每1kg土接种100mL，将二级种子液直接喷洒到土壤并搅拌均匀。
[0033] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0034] (1)本发明能够有效的去除USEPA PAHs，尤其对高环PAHs去除率较高(2)本发明可以在去除USEPA PAHs的同时并不引入任何化学试剂或者非土著的细菌。
附图说明
[0035] 图1是一级种子液中RHDα基因丰度；其中，图a为nidA的基因丰度，图b为nahAc的基因丰度；
[0036] 图2是加入不同含量的土著PAHs降解菌群落对于土壤中PAHs降解的影响结果图；
[0037] 图3是第35天土壤中不同环数多环芳烃的降解效率；
[0038] 图4是加入不同含量土著PAHs降解菌群落的土壤中RHDα基因含量变化。
具体实施方式
[0039] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
[0040] 1、土著PAHs降解菌群落的制备：
[0041] (1)土壤浸出液的制备：将未污染的土壤和水以1:10的比列混合并搅拌均匀，静置2h后将上清液5000rpm/min离心10min以去除不溶性杂质，121℃高温灭菌20min后室温保存。
[0042] (2)一级种子液：按照10％的接种量将污染土壤的悬浊液接种到土壤浸出液中，再加入终浓度为30mg L-1的10种PAHs经16天驯化、富集。每隔两天采样一次，将培养液5000rpm/min离心后一部分提取其基因组DNA，另一部分加入终浓度为30％的甘油后冷冻保存为一级种子液。
[0043] (3)细菌群落的鉴定和RHDα基因含量的测定：经16S rRNA基因高通量测，测定该细菌群落16S rRNA基因V3-V4区。经qPCR鉴定其中nidA和nahAc基因拷贝数。
[0044] (4)二级种子液：合适的一级种子液经过LB培养基扩大培养后，8000rpm/min 4℃离心5min，弃去上清液，加入蒸馏水，再次离心，该操作重复三次，以充分洗去菌体中残留的LB培养基制得OD600值为0.0、0.2、0.5和1.0的土著PAHs降解菌群落储备液，4℃保存备用为二级种子液。其中OD600值为0.0的二级种子液仅含蒸馏水用于对照试验。
[0045] 将上述二级种子液按照每千克土100mL为标准接种到受PAHs污染的农田土中。每隔七天采样一次持续35天，并测定土壤中PAHs及nidA和nahAc的含量。
[0046] 2、一级种子液群落结构分析
[0047] (1)PCR扩增：以一级种子液基因组DNA为模版，使用16S rRNA V3-V4区域的特异性引物、Takara公司高保真酶进行PCR，确保产物特异性。
[0048] (2)PCR产物纯化：产物使用1.5％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，利用Axygen公司的胶回收试剂盒回收目的条带。
[0049] (3)测序及生物信息学分析：将PCR产物建库后用Miseq PE350进行测序，并进一步分析其群落结构。
[0050] 3、待测土壤PAHs含量的测定：
[0051] 将土壤经真空冷冻干燥后充分研磨，-80℃保存待测。
[0052] 取上述制备好的土壤样品于20mL玻璃离心管中，分别加入10mL二氯甲烷，水浴超声处理30min，静置30min，将所有上清液过层析柱(上层2g无水硫酸钠，下层2g硅胶)净化并用10mL体积比为1:1的二氯甲烷和正己烷溶液洗脱；洗脱液40℃恒温下浓缩至干，用甲醇定容到2mL，过0.22μm孔径有机相滤膜后，HPLC/UV-FLD分析。
[0053] 4、待测样品nidA和nahAc含量的测定：
[0054] (1)一级种子液中，nidA和nahAc基因含量的测定
[0055] 以一级种子液基因组DNA为模版，分别使用nidA和nahAc基因特异性引物、诺唯赞公司AceQ qPCR SYBR Green Master Mix进行qPCR实验，测定一级种子液中上述两个基因的含量。
[0056] 其中nidA引物序列为：
[0057] 正向引物：TTCCCGAGTACGAGGGATAC
[0058] 反向引物：TCACGTTGATGAACGACAAA；
[0059] nahAc引物序列为：
[0060] 正向引物：ACTTGGTTCCGGAGTTGATG
[0061] 反向引物：CAGGTCAGCATGCTGTTGTT。
[0062] (2)待测土壤中nidA和nahAc含量的测定
[0063] 取0.25g新鲜的土壤，按照强力土壤DNA提取试剂盒说明书提取土壤总DNA，-20℃保存。土壤中nidA和nahAc测定方法同(1)中一级种子液中方法。
[0064] 表1不同天的数细菌群落组成。
[0065]
[0066] 由表1和图1可知，在16天的驯化过程中第10天的群落结构以及nidA和nahAc的含量满足要求被选为合适的一级种子液。该一级种子液Achromobacter、Nocardioides、Methylobacillus、Pseudomonas、Pseudoxanthomonas、Rhizobium、Methylophilus和Shinella的含量分别为25.45％、13.26％、10.68％、10.36％、6.02％、3.07％、4.73％和2.10％；nidA和nahAc的基因丰度为6083和11770。
[0067] 由图2和图3可知，加入OD600值为0.2、0.5和1.0的二级种子液均可以明显降低污染土壤中的PAHs含量，其PAHs含量从95.23mg kg-1分别降低到了29.85、28.09和23.41mg kg-1。其中，2-3和4-5环PAHs的降解效率并不与加入的菌量成正相关，但6环PAHs降解效率与加入的菌量成正相关。因此，在降解含2-5环PAHs较多的土壤时，二级种子液浓度为0.2即可；而降解6环PAHs较多的土壤时，二级种子液的浓度可设置为1.0。
[0068] 由图4可知，加入OD600值为0.2、0.5和1.0的二级种子液可以明显提高参与PAHs降解、具有编码双加氧酶α亚基功能的nidA和nahAc基因丰度。上述两个基因丰度的提高加快土壤中PAHs降解的效率。
[0069] 可见，本发明的一种利用驯化、富集的土著PAHs降解菌群落去除农田土壤中USEPA PAHs的方法，能够有效的去除土壤中USEPA PAHs，总去除率高达68％以上，且对土壤理化性质无不良影响，具有环保、高效的特点。
[0070] 根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的必要特性，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以做出本发明的多种变化和修改以使其适应多种用途和情况。因此，其他实施方案也在权利要求的范围内。
