对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位的方法

摘要

本发明公开了对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位的方法，属于农业生物技术范畴。本发明首先解剖并分离出稻飞虱的不同组织；然后根据Cardinium的16S rRNA序列设计出三段具有荧光标记的特异性的寡核苷酸探针；最后利用特异性探针对稻飞虱中存在的Cardinium进行杂交，通过激光共聚焦显微镜的扫描即可快速对稻飞虱组织中的Cardinium进行准确的定位。本发明所述的定位方法具有高度的特异性、敏感性、可行性和有效性，同时可节约成本。本发明有利于更好地研究Cardinium和宿主之间的相互作用关系，也有助于研究压制害虫种群的策略以及抵抗病毒传播的机制。

权利要求

1.对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位的方法，其特征在于，包括以下步骤： （1）稻飞虱组织的解剖和分离：收集稻飞虱成虫，在显微镜下解剖出飞虱组织，并分离到装有1×PBS的离心管中；所述稻飞虱为白背飞虱或褐飞虱；所述组织为唾液腺、卵巢、精巢、肠道中的一种或多种； （2）寡核苷酸探针的设计：根据Cardinium的16S rRNA序列设计出三段具有荧光标记的特异性的寡核苷酸探针；所述三段荧光标记的具有特异性的寡核苷酸探针为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列， SEQ ID NO.1 3~用Cy5在寡核苷酸探针序列5’端标记； （3）寡核苷酸探针与稻飞虱组织中Cardinium的杂交：将步骤（1）解剖的组织用4%的多聚甲醛固定，清洗后置于杂交液中过夜，所述杂交液中包括所述寡核苷酸探针，清洗后分别用鬼笔环肽和DAPI对细胞骨架和细胞核染色，再次清洗后用抗荧光淬灭剂封片； （4）激光共聚焦显微镜下的观察：调节激光共聚焦显微镜的激发波长和发射波长，分别对Cardinium、细胞骨架和细胞核扫描，即可对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布准确定位。

2.根据权利要求1中所述的对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位的方法，其特征在于，所述（3）中，寡核苷酸探针与稻飞虱组织中Cardinium的杂交，具体包括以下步骤： ① 4%多聚甲醛固定：用1×PBS将解剖的组织清洗2遍，清除残余液体，加入1ml的4%多聚甲醛组织固定30min，去除多聚甲醛，再用1×PBS清洗2‑3遍； ②核酸杂交液中黑暗过夜：向制备好的核酸杂交液加入三段特异性的寡核苷酸探针，将其加入到装有组织的离心管中，杂交液没过组织即可，此操作过程需避光，于46℃水浴锅中黑暗过夜； ③清洗杂交液：清洗掉杂交液，分别取含有0.015% DTT的2×SSC，含有0.015% DTT的1×SSC，含有

0.015% DTT的0.5×SSC各清洗1遍，再用PBS洗1遍，使组织置于离心管底部； ④染细胞骨架：将鬼笔环肽用1×PBS 稀释200倍，向离心管中加入700ml稀释液进行染色，染色时长为1小时，然后再用1×PBS清洗3遍，在避光下进行操作； ⑤染细胞核：向离心管中加入DAPI，液体没过组织即可，置于黑暗中1小时，用1×PBS清洗3遍，在避光下进行操作； ⑥抗荧光淬灭剂封片：将组织置于载玻片上，调整好位置，加入抗荧光淬灭剂封片。

3. 根据权利要求2中所述的对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位的方法，其特征在于，所述②中，配制杂交液的方法，采用如下配方： 核酸杂交液成分配制剂量50%去离子甲酰胺5ml5×SSC3ml200mg/ml 右旋糖酐硫酸酯2.5g250ug/ml 鲑鱼精DNA0.003g二硫苏糖醇0.1mol/l0.154g0.5×Denhardt’s solution5ml250ug/ml poly(A)

0.003g。

4.根据权利要求2中所述的对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位的方法，其特征在于，所述②中，探针与杂交液的稀释比例为1：50～200。

5.根据权利要求2中所述的对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位的方法，其特征在于，所述②中探针与杂交液的稀释比例为1：100。

6.根据权利要求1中所述的对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位的方法，其特征在于，所述（4）中，所采用的激发光波长和发射波长为： Cadinium：Cy5，645～

670 nm； 细胞核：DAPI，359～461 nm； 细胞骨架：FITC，494～518 nm。

说明书

对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位的

方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位的方法。

背景技术

[0002] Cardinium是一类位于细胞内的可以进行母系传播的革兰氏阴性内共生细菌。它们广泛存在于许多节肢动物中，一些重要的农业害虫如稻飞虱、叶螨、烟粉虱和寄生蜂中均发现Cardinium的存在。它们可以对宿主的生殖和发育进行调控，包括胞质不亲和性（Cytoplasmic incompatibility，CI）、孤雌生殖（parthenogenesis inducing）、雌性化（Feminization）和杀雄（Male‑killing）。其中，由Cardinium诱导的最重要的生殖表型是CI。CI的发生与共生菌的侵染有关，当未感染的雌虫与感染的雄虫交配时所产生的后代不能够正常孵化。这些表型的发生主要得益于Cardinium在昆虫各种组织中的广泛分布。

[0003] Wolbachia是另一种内共生菌，也广泛存在于节肢动物中，并且一些Wolbachia株系已经被转染到蚊子和果蝇中。人们通过对宿主中的Wolbachia进行定位，了解了它们在宿主组织中的分布范围，确定了它们具有的100%的垂直传播率，从而有利于更好地研究压制害虫种群的策略以及抵抗病毒传播的机制。然而，Cardinium在一些重要害虫组织中的分布却没有很好地被描述。

[0004] 白背飞虱Sogatella furcifera（Horváth）和褐飞虱Nilaparvata lugens（Stål）是两种可以长距离迁飞性的害虫，对亚洲农耕区的水稻造成严重危害。白背飞虱可以自然感染Cardinium并诱导宿主强烈的CI；褐飞虱虽然自然状态下不感染Cardinium，通过人工转染的方法也可以稳定感染Cardinium。

[0005] 然而，两种稻飞虱中Cardinium在组织中的分布还没有被准确的定位。因此，我们急需一种方法对稻飞虱中分布的Cardinium进行定位，从而有利于更好地研究共生菌和昆虫之间的相互作用关系。

发明内容

[0006] 本发明提供对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位的方法，利用该方法可以直观地了解Cardinium与稻飞虱的相关作用关系。

[0007] 对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位的方法，具体包括如下步骤：

[0008] （1）稻飞虱组织的解剖和分离：收集稻飞虱成虫，在显微镜下小心地解剖出飞虱组织，将它们分离到装有1×PBS的离心管中；

[0009] （2）寡核苷酸探针的设计：根据Cardinium的16S rRNA序列设计出三段具有荧光标记的特异性的寡核苷酸探针；

[0010] （3）寡核苷酸探针与稻飞虱组织中Cardinium的杂交：将步骤（1）解剖的组织用4%的多聚甲醛固定，清洗后置于杂交液中过夜，清洗后分别用鬼笔环肽和DAPI对细胞骨架和细胞核染色，再次清洗后用抗荧光淬灭剂封片；

[0011] （4）激光共聚焦显微镜下的观察：调节激光共聚焦显微镜的激发波长和发射波长，分别对Cardinium、细胞骨架和细胞核扫描，即可对稻飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布准确定位。

[0012] 进一步的，（1）中所述稻飞虱为白背飞虱或褐飞虱。

[0013] 进一步的，（1）中所述组织为唾液腺、卵巢、精巢、肠道中的一种或多种。

[0014] 进一步的，所述（2）中，所述三段荧光标记的具有特异性的寡核苷酸探针为：

[0015] C162: 5’‑ ATCTTTCCAGCATGCGCT ‑3’ （SEQ ID NO.1）；

[0016] C587: 5’‑ CAATCGCAGTTCTAGCGTTA ‑3’ （SEQ ID NO.2）；

[0017] C997: 5’‑ GCACCTTGTATTCCGTCC ‑3’ （SEQ ID NO.3）；

[0018] SEQ ID NO.1 3用Cy5在寡核苷酸探针序列5’端标记。~

[0019] 进一步的，所述（3）中，寡核苷酸探针与稻飞虱组织中Cardinium的杂交，具体包括以下步骤：

[0020] ① 4%多聚甲醛固定：用1×PBS将解剖的组织清洗2遍，清除残余液体，加入约1ml的4%多聚甲醛组织固定30min，去除多聚甲醛，再用1×PBS清洗2‑3遍；

[0021] ② 核酸杂交液中黑暗过夜：向制备好的核酸杂交液加入三段特异性的寡核苷酸探针，将其加入到装有组织的离心管中，杂交液没过组织即可，此操作过程需避光，于46℃水浴锅中黑暗过夜；

[0022] ③ 清洗杂交液：清洗掉杂交液，分别取2×SSC（0.015%（w/v）DTT），1×SSC（0.015% （w/v）DTT），0.5×SSC（0.015%（w/v）DTT）各清洗1遍，再用PBS洗1遍，使组织置于离心管底部；

[0023] ④ 染细胞骨架：将鬼笔环肽用1×PBS 稀释200倍，向离心管中加入700ml稀释液进行染色，染色时长为1小时，然后再用1×PBS清洗3遍，在避光下进行操作；

[0024] ⑤ 染细胞核：向离心管中加入DAPI，液体没过组织即可，置于黑暗中1小时，用1×PBS清洗3遍，在避光下进行操作；

[0025] ⑥ 抗荧光淬灭剂封片：将组织置于载玻片上，调整好位置，加入抗荧光淬灭剂封片。

[0026] 进一步的，所述②中，配制杂交液的方法，采用如下配方：

[0027]核酸杂交液成分 配制剂量
50%去离子甲酰胺 5ml
5×SSC 3ml
200mg/ml 右旋糖酐硫酸酯 2.5g
250ug/ml 鲑鱼精DNA 0.003g
二硫苏糖醇0.1mol/l 0.154g
0.5×Denhardt’s solution 5ml
250ug/ml poly(A) 0.003g

[0028] 进一步的，所述②中，探针与杂交液的稀释比例为1：50～200，优选的，探针与杂交液的稀释比例为1：100。

[0029] 进一步的，所述（4）中，所采用的激发光波长和发射波长为：

[0030] Cadinium：Cy5，645～670 nm；

[0031] 细胞核：DAPI，359～461 nm；

[0032] 细胞骨架：FITC，494～518 nm。

[0033] 本发明通过解剖稻飞虱的不同组织，采用三段Cardinium特异性寡核苷酸探针，通过激光共聚焦的观察，对稻飞虱中不同组织中存在的Cardinium进行定位。

[0034] 本发明将三种稻飞虱中Cardinium的检测方法（PCR定性检测稻飞虱中Cardinium、qPCR定量检测稻飞虱中Cardinium以及电镜观察稻飞虱中存在的Cardinium）结合于一身，可以快速定性、定量、直观地对稻飞虱各种组织中存在的Cardinium进行检测和定位。

[0035] 同时本发明避免了通过免疫组化对Cardinium进行染色的方法，可以节约大量的费用。

[0036] 本发明所述的对Cardinium定位的方法具有高度的特异性、敏感性、可行性和有效性，即可节约成本，又可以在直观地在较短时间内对Cardinium的分布进行定位。

[0037] 本发明还有利于直观地观察Cardinium与宿主细胞的关系，这利于更好地研究Cardinium和宿主之间的相互作用关系，也有助于更好地研究压制害虫种群地策略以及抵抗病毒传播的机制。

附图说明

[0038] 图1a 图1d分别为Cardinium在白背飞虱卵巢管、精巢、唾液腺和肠道中的分布状~况。

[0039] 图2a 图2d分别为Cardinium在褐飞虱卵巢管、精巢、唾液腺和肠道中的分布状况。~

具体实施方式

[0040] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0041] 实施例1：对白背飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位。

[0042] （一）白背飞虱组织的解剖和分离

[0043] 收集20头成熟的白背飞虱雌虫和雄虫，将要解剖的飞虱置于干净的培养皿中，在显微镜下用解剖镊小心地解剖出唾液腺、卵巢、精巢、肠道等组织，将它们转移到含有1×PBS的试管中。

[0044] （二）寡核苷酸探针的设计

[0045] 根据Cardinium的16S rRNA序列设计出三段具有荧光标记的特异性的寡核苷酸探针，用Cy5在探针序列的5’端进行标记，分别是SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3。

[0046] （三）寡核苷酸探针与白背飞虱中Cardinium的杂交

[0047] 寡核苷酸探针与白背飞虱中Cardinium的杂交，具体包括以下步骤：

[0048] （1）4%多聚甲醛固定

[0049] 用1×PBS将解剖的组织清洗2遍，清除残余液体，加入约1ml的4%多聚甲醛组织固定30min，去除多聚甲醛，再用1×PBS清洗2‑3遍；

[0050] （2）核酸杂交液中黑暗过夜

[0051] 首先制备核酸杂交液，杂交液具体的配方参照下表。

[0052] 核酸杂交液成分 配制剂量50%去离子甲酰胺 5ml
5×SSC 3ml
200mg/ml 右旋糖酐硫酸酯 2.5g
250ug/ml 鲑鱼精DNA 0.003g
二硫苏糖醇0.1mol/l 0.154g
0.5×Denhardt’s solution 5ml
250ug/ml poly(A) 0.003g

[0053] 向配制好的核酸杂交液中加入三段设计好的特异性寡核苷酸探针，其中探针与杂交液的稀释比例为1：100。小心地混合液体加入到存有组织的离心管中，杂交液没过白背飞虱组织即可。此操作过程避光，将离心管置于46℃水浴锅中黑暗过夜；

[0054] （3）清洗杂交液

[0055] 清洗掉杂交液，用移液枪分别取2×SSC （0.015% （w/v） DTT），1×SSC （0.015% （w/v） DTT），0.5×SSC （0.015% （w/v） DTT）对白背飞虱的组织清洗，各清洗1遍，再用1×PBS洗数遍，直到所有残余杂交液被清除，干净的白背飞虱组织沉淀于试管底部。全程在避光下进行操作。

[0056] （4）染细胞骨架

[0057] 将鬼笔环肽用1×PBS 稀释200倍，向离心管中加入700ml稀释液进行染色。将离心管放到要床上缓慢晃动，时间为1小时。去掉残留液体，用1×PBS清洗3遍。全程在避光下进行操作。

[0058] （5）染染细胞核

[0059] 向离心管中加入DAPI，液体没过组织即可。将离心管置于黑暗室温下1小时，然后用PBS清洗3遍。全程在避光下进行操作。

[0060] （6）抗荧光淬灭剂封片

[0061] 将白背飞虱组织置于载玻片上，调整好位置，加入抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片并用指甲油封片。

[0062] （四）激光共聚焦显微镜下的观察

[0063] 调节激光共聚焦的激发光波长，分别对Cardinium、细胞骨架和细胞核进行扫描，即可对其准确定位，如图1所示，其中图1a 图1d分别为Cardinium在白背飞虱卵巢管、精巢、~唾液腺和肠道中的分布状况，箭头处即为Cardinium。

[0064] 所采用的激发光波长和发射波长：

[0065] Cadinium：Cy5，645～670 nm；

[0066] 细胞核：DAPI，359～461 nm；

[0067] 细胞骨架：FITC，494～518 nm。

[0068] 实施例2：对褐飞虱不同组织中共生菌Cardinium的分布进行定位。

[0069] （一）褐飞虱组织的解剖和分离

[0070] 收集20头成熟的褐飞虱雌虫和雄虫，将要解剖的飞虱置于干净的培养皿中，在显微镜下用解剖镊小心地解剖出唾液腺、卵巢、精巢、肠道等组织，将它们转移到含有PBS的试管中。

[0071] （二）寡核苷酸探针的设计

[0072] 根据Cardinium的16S rRNA序列设计出三段荧光标记的具有特异性的寡核苷酸探针，使用Cy5在探针序列的5’端进行标记，分别是SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3。

[0073] （三）寡核苷酸探针与褐飞虱中Cardinium的杂交

[0074] 寡核苷酸探针与褐飞虱中Cardinium的杂交，具体包括以下步骤：

[0075] （1）4%多聚甲醛固定

[0076] 用1×PBS将解剖的组织清洗2遍，清除残余液体，加入约1ml的4%多聚甲醛组织固定30min，随后去除多聚甲醛，用1×PBS清洗2‑3遍；

[0077] （2）核酸杂交液中黑暗过夜

[0078] 首先制备核酸杂交液，杂交液具体的配方参照下表。

[0079]核酸杂交液成分 配制剂量
50%去离子甲酰胺 5ml
5×SSC 3ml
200mg/ml 右旋糖酐硫酸酯 2.5g
250ug/ml 鲑鱼精DNA 0.003g
二硫苏糖醇0.1mol/l 0.154g
0.5×Denhardt’s solution 5ml
250ug/ml poly(A) 0.003g

[0080] 向配制好的核酸杂交液中加入三段设计好的特异性寡核苷酸探针，其中探针与杂交液的稀释比例为1：100。小心地混合液体加入到存有褐飞虱组织的离心管中，杂交液没过组织即可。此操作过程避光，将离心管置于46℃水浴锅中黑暗过夜；

[0081] （3）清洗杂交液

[0082] 清洗掉杂交液，用移液枪分别取2×SSC （0.015% （w/v） DTT），1×SSC （0.015% （w/v） DTT），0.5×SSC （0.015% （w/v） DTT）对褐飞虱的组织清洗，各清洗1遍，再用1×PBS洗数遍，直到所有杂交液被清除，干净的褐飞虱组织沉淀于试管底部。全程在避光下进行操作。

[0083] （4）染细胞骨架

[0084] 将鬼笔环肽用1×PBS 稀释200倍，向离心管中加入700ml稀释液进行染色。将离心管放到要床上缓慢晃动，时间为1小时。去掉残留液体，用1×PBS清洗3遍。全程在避光下进行操作。

[0085] （5）染染细胞核

[0086] 向离心管中加入DAPI，液体没过组织即可。将离心管置于黑暗室温下1小时，然后用1×PBS清洗3遍。全程在避光下进行操作。

[0087] （6）抗荧光淬灭剂封片

[0088] 将褐飞虱组织置于载玻片上，调整好位置，加入抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片并用指甲油封片。

[0089] （四）激光共聚焦显微镜下的观察

[0090] 调节激光共聚焦的激发光波长，分别对Cardinium、细胞骨架和细胞核进行扫描，即可对其准确定位，如图2所示，图2a 图2d分别为Cardinium在褐飞虱卵巢管、精巢、唾液腺~和肠道中的分布状况，箭头处即为Cardinium。

[0091] 所采用的激发光波长和发射波长：

[0092] Cadinium：Cy5，645～670 nm；

[0093] 细胞核：DAPI，359～461 nm；

[0094] 细胞骨架：FITC，494～518 nm。