ENPP1在制备高级别浆液性卵巢癌诊断及预后试剂盒中的应用

摘要

本发明公开了检测ENPP1蛋白的试剂在制备高级别浆液性卵巢癌鉴别诊断和预后判断试剂盒中的应用，属于分子生物学与生物医学技术领域。本发明以ENPP1蛋白作为治疗和预后判断的标志物，通过免疫组织化学方法辅助诊断高级别浆液性卵巢癌，并对高级别浆液性卵巢癌治疗效果和预后进行判断，ENPP1在正常卵巢组织和卵巢浆液性囊腺瘤表达为阴性或者弱表达，但在高级别浆液性卵巢癌中是高表达，并且这种表达强度和临床预后指标紧密相关。根据不同的表达强度和高级别浆液性卵巢癌预后之间的相关性，对患者进行分层处理，为开发更有效的针对性化疗药物提供判断依据，具有重要的临床应用和药物开发价值。

权利要求

1.检测组织样本中ENPP1蛋白的试剂在制备高级别浆液性卵巢癌鉴别诊断和/或预后判断的试剂盒中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测组织样本中ENPP1蛋白的试剂为抗ENPP1蛋白的抗体。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测组织样本中ENPP1蛋白的试剂为ENPP1鼠抗人单克隆抗体。

说明书

ENPP1在制备高级别浆液性卵巢癌诊断及预后试剂盒中的

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学与生物医学技术领域，具体涉及检测ENPP1蛋白的试剂在制备高级别浆液性卵巢癌鉴别诊断和/或预后判断试剂盒中的应用。

背景技术

[0002] 全世界每年约有24万妇女被诊断患有卵巢癌，其死亡率几乎是乳腺癌的三倍，使卵巢癌成为发达国家最致命的妇科恶性肿瘤。III期或IV期患者5年生存率不到25％。卵巢癌分为三大类：上皮细胞癌、生殖细胞癌和特异性间质细胞瘤，绝大多数卵巢癌是上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancers，EOCs)。上皮性卵巢癌主要分为两大组织类型：I型和II型肿瘤。I型肿瘤包括各种低级别浆液性、粘液性、子宫内膜样、透明细胞癌，往往生长缓慢，通常来自可识别的癌前病变。相比之下，II型肿瘤的特点是高级别和快速进展的疾病。

[0003] 高级别浆液性卵巢癌(Highgrade serous ovarian carcinoma，HGSOC)是最常见的II型肿瘤，约占所有卵巢癌的75％。不幸的是，它也是最具侵略性的。目前还没有有效和特异性高的早期预测高级别浆液性卵巢癌的指标和方法，即使肿瘤细胞已经在腹腔内广泛扩散转移也缺乏特异性症状而无法早期发现和诊断，因此，大多数女性初次诊断为卵巢癌时已经进展到疾病晚期，预后很差。其中远处转移和治疗后复发是临床治疗效果差的根本性原因。

[0004] 卵巢癌是多因素多基因综合作用导致的一种复杂性疾病，每一种组织类型均有不同的分子水平起源，甚至同一种组织类型内部也存在着分子起源的不同，这导致分子和细胞行为、临床表现和预后存在着天壤之别，而目前临床只能根据病理分期作为治疗方案和预后判断依据，这种依据是完全脱离分子生物学基础的，无法提供有效的分层个性化治疗的细胞学行为判断依据，导致诊断和治疗效果不尽人意。实际工作中急需更精准的标志物将患者分为高风险和低风险类型，从而可以采取有效的个性化治疗方案，提高治疗效果，改善预后。

[0005] 目前卵巢癌的分子标记物包括两种层面的分子，核酸和蛋白质。核酸类标记物包括基因拷贝数变异(CNV)，微卫星不稳定(MSI)，碱基突变(Mutation)，单核苷酸多态性(SNP)等，近年的研究也包括miRNA的改变，但这些大部分只能作为患病易感性的预警，和细胞行为的相关性相去甚远，临床应用价值不大。而我们知道蛋白质是基因表达的终产物，可以直接发挥功能，改变细胞的生物学行为和对周围环境的直接反应，比如肿瘤的发生发展，对治疗手段的反应，因此蛋白水平的研究成果可以直接和有效的提供具有临床指导价值的分子标记，满足卵巢癌分子水平的分类诊断和预后判断的需要，对卵巢癌的个性化治疗和改善预后具有重要价值。但目前为止尚未有明确的有效的研究成果，无法达到临床需要的特异性和精准性。

[0006] ENPP1(Ecto-nucieotdepyrophosphatase/phosphodesterase l)是一种具有焦磷酸酶和磷酸二酯酶活性的Ⅱ型跨膜糖蛋白，在骨和软骨中高度表达。研究表明，ENPP1在子宫内膜异位症、肺癌细胞、乳腺癌细胞和神经胶质母细胞瘤等肿瘤细胞中表达明显提高。但目前为止尚未见在高级别浆液性卵巢癌中的研究。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于研究ENPP1蛋白在高级别浆液性卵巢癌中表达量的差异，区分出ENPP1不同表达量与高级别浆液性卵巢癌临床分期、病理分级等预后指标间的相关性，说明ENPP1蛋白表达在高级别浆液性卵巢癌致病性、临床诊断以及预后判断中的作用和应用价值，最终开展其在临床检测试剂盒中的应用。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0009] 本发明首先检测了正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤和高级别浆液性卵巢癌中ENPP1蛋白的表达，发现ENPP1在高级别浆液性卵巢癌中表达量明显高于正常卵巢组织和卵巢浆液性囊腺瘤组织，具有显著的统计学差异。

[0010] 本发明同时对高级别浆液性卵巢癌患者的血清CA125、腹水量、肿瘤最大直径、FIGO分期、细胞分化等级和化疗敏感性进行了分层分析，结果显示ENPP1蛋白表达越高的患者预后越差。

[0011] 综合上述分析结果，本发明提供了ENPP1作为高级别浆液性卵巢癌临床鉴别诊断和/或预后判断的蛋白标记物的应用价值。

[0012] 通过检测ENPP1蛋白在癌组织中的表达量，可以对高级别浆液性卵巢癌的鉴别诊断和/或预后进行判断，包括：高级别浆液性卵巢癌的临床鉴别诊断，为高表达ENPP1蛋白的患者提供更好的个性化化疗方案，对高级别浆液性卵巢癌进行更好的分层治疗，最终改善患者的预后。

[0013] 因此，本发明提供了检测ENPP1蛋白的试剂在制备高级别浆液性卵巢癌鉴别诊断和/或预后判断的试剂盒中的应用。

[0014] 所述检测ENPP1蛋白的试剂为抗ENPP1蛋白的抗体。

[0015] 优选的，所述检测ENPP1蛋白的试剂为ENPP1鼠抗人单克隆抗体。

[0016] 所述鉴别诊断包括：高级别浆液性卵巢癌或卵巢浆液性囊腺瘤的鉴别诊断；所述预后判断包括：高级别浆液性卵巢癌治疗药物、治疗方法、治疗疗效及预后的评估。

[0017] 作为以上蛋白分子标记物的临床检测应用，本发明提供了一种用于高级别浆液性卵巢癌鉴别诊断和/或预后判断的试剂盒，通过检测高级别浆液性卵巢癌ENPP1蛋白表达量，对高级别浆液性卵巢癌临床鉴别诊断和预后进行预判。

[0018] 所述试剂盒中包括特异性针对ENPP1蛋白的小鼠抗人单克隆抗体和免疫组织化学技术需要的通用二抗和显色试剂。

[0019] 用于免疫组织化学技术的试剂包括：山羊血清封闭液、0.01M柠檬酸盐抗原修复液、3％H2O2过氧化物酶阻断剂、HRP标记的羊抗鼠二抗、DAB显色试剂和TBS溶液。

[0020] 本发明还提供了基于上述试剂盒的免疫组织化学方法和评分标准，包括如下步骤：

[0021] 将待测组织样本经福尔马林固定、脱水、石蜡包埋并切片得到组织切片，随后进行免疫组织化学染色、显微镜观察阅片并进行评分和统计学分析。

[0022] 具体实验步骤如下：

[0023] 手术获得组织标本经福尔马林固定和石蜡包埋切片，随后进行水化、抗原修复、过氧化氢灭活内源性过氧化物酶和血清封闭后，ENPP1鼠抗人单克隆抗体在室温条件下孵育60分钟，TBS冲洗三次后与二抗在室温反应15分钟，辣根过氧化酶标签孵育，DAB显色，苏木素复染，最后酒精脱水、二甲苯透明后中性树脂封片。光学显微镜观察评分。

[0024] 根据阳性细胞百分比和染色强度(400倍下10个随机视野)，按照以下评分标准对ENPP1蛋白表达进行半定量评价。阴性染色定义为0分，淡黄色为弱染色1分，褐黄色为中染色2分，深黄色为强染色3分。对阳性细胞的百分比进行评分时，<5％定义为0分，<25％定义为1分，<75％定义为2分，>75％定义为3分。两个评分相加后得出半定量分析结果，如下：阴性–(0分)，弱阳性+(1–2分)，中度阳性++(3–4分)和强阳性+++(5–6分)。

[0025] 根据实验结果显示ENPP1在正常卵巢组织中表达基本为阴性，在卵巢浆液性囊腺瘤表达为阴性或者弱阳性，而在高级别浆液性卵巢癌中普遍表达为中度阳性和强阳性。

[0026] 治疗效果和预后判断方法如下，ENPP1阴性和弱阳性患者预后较好，治疗效果好，而强阳性患者常规治疗效果和预后最差，中度阳性患者的治疗效果和预后情况介于两者之间。

[0027] 本发明具备的有益效果：

[0028] 本发明首次研究ENPP1蛋白在高级别浆液性卵巢癌中的表达情况，发现ENPP1在正常卵巢组织和卵巢浆液性囊腺瘤表达为阴性或者弱表达，但在高级别浆液性卵巢癌中是高表达，并且这种表达强度和临床预后指标紧密相关，ENPP1高表达的患者治疗效果差，各项预后指标表现差，预示预后差。因此，本发明以ENPP1蛋白作为治疗和预后判断的标志物，提供了一种用于高级别浆液性卵巢癌鉴别诊断和/或预后判断的试剂盒，通过免疫组织化学方法辅助诊断高级别浆液性卵巢癌，并对高级别浆液性卵巢癌治疗效果和预后进行判断，同时根据不同的表达强度和高级别浆液性卵巢癌预后之间的相关性，对患者进行分层处理，为开发更有效的针对性化疗药物提供判断依据，具有重要的临床应用和药物开发价值。

附图说明

[0029] 图1为ENPP1蛋白在正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤与高级别浆液性卵巢癌中的表达情况。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，应该说明的是，以下的实施例中采用的技术路线和方法仅仅是为了更好地理解本发明，但其内容并不限于本发明。

[0031] 如不加以特别说明，实施例中涉及的具体实验方法均为常规方法，所用的实验试剂均为常规试剂公司购买。其中一抗ENPP1小鼠抗人单克隆抗体，购买自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC.，Cat.No:sc-166649。

[0032] 实施例1

[0033] ENPP1蛋白在正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤和高级别浆液性卵巢癌表达差异的分析

[0034] 一、研究对象：

[0035] 收集浙江大学医学院附属妇产科医院2004年1月至2010年12月正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤和高级别浆液性卵巢癌标本组织共计241份。样本包括41个正常卵巢上皮组织，97个卵巢浆液性囊腺瘤，103个高级别浆液性卵巢癌(包括6个I期，30个II期，62个III期和5个IV期)。排除术前接受化疗、免疫治疗或放射治疗的患者。所有患者均接受了初次手术，随后接受了紫杉醇为基础的化疗。

[0036] 对于所有患者收集以下临床指标：术前血清CA125、腹水量、肿瘤最大直径、FIGO分期、细胞分化等级、化疗敏感性。化疗期间出现进展性疾病或者完成初次化疗疗程后6个月内复发的患者被确定为化疗耐药。复发时超过6个月或无复发的患者定义为化疗敏感。

[0037] 本项发明研究得到按照浙江大学医学院附属妇产科医院伦理委员会同意，并遵循批准的指导方针和条例进行。

[0038] 二、实验方法：

[0039] 2.1组织石蜡包埋切片

[0040] 1、取材：新鲜标本组织10％福尔马林固定后，将组织从固定液取出目的部位组织修平整放于脱水盒内。

[0041] 2、脱水：将脱水盒依次放进梯度酒精进行脱水。75％酒精4小时→85％酒精2小时→90％酒精2小时→95％酒精1小时→无水乙醇Ⅰ30分钟→无水乙醇Ⅱ30分钟→醇苯5分钟→二甲苯Ⅰ10分钟→二甲苯Ⅱ10分钟→石蜡Ⅰ1小时→石蜡Ⅱ1小时→石蜡Ⅲ1小时。

[0042] 3、包埋：先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出放入包埋框，于-20℃冷却蜡凝固后取出、修整蜡块。

[0043] 4、切片：蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片，待蜡烤化后取出常温保存。

[0044] 2.2组织脱水、抗原修复和内源性过氧化物酶阻断

[0045] 1、石蜡切片置于67℃烘箱烘片2小时，脱蜡至水，用TBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟。

[0046] 2、0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH＝6.0)微波加热至沸腾，将上述水化后的组织切片放入已沸腾的缓冲液中，微波处理10分钟，流水自然冷却，蒸馏水冲洗两次，最后用TBS冲洗两次，每次3分钟。

[0047] 3、每张切片加1滴3％H2O2，室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶活性，用TBS冲洗三次，每次3分钟。

[0048] 2.3非特异性位点封闭和一抗孵育

[0049] 1、封闭非特异性位点：吸干切片上的水分，加山羊血清封闭液，湿盒内室温反应10分钟。

[0050] 2、甩掉封闭液，滴加一抗(1:500)覆盖全部组织，放入湿盒内室温60分钟。

[0051] 3、TBS冲洗三次，每次三分钟。

[0052] 2.4DAKO EnVision System二抗标记、显色和复染

[0053] 所用试剂盒为DAKO公司的EnVisionTM+System,Peroxidase(DAKO EnVisionTM+System,)，具体实验步骤如下：

[0054] 1、TBS漂洗10分钟，EnVision二抗反应液(HRP标记)室温孵育15分钟。

[0055] 2、TBS漂洗10分钟，滴加两滴(100微升左右)DAB溶液，室温显色5分钟后显微镜下观察，染色合适后终止染色，自来水冲洗。

[0056] 3、蒸馏水漂洗后，苏木素复染，1-2分钟，细胞核变蓝色即可终止，自来水或者TBS冲洗反蓝(可用0.5％an水反蓝)。

[0057] 4、切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

[0058] 三、显微镜观察和评分标准

[0059] 肿瘤细胞浆中和细胞膜上出现棕黄色颗粒被认为是阳性标记。根据阳性细胞百分比和染色强度(400倍下10个随机视野)，按照以下评分标准对ENPP1蛋白表达进行半定量评价。阴性染色定义为0分，淡黄色为弱染色1分，褐黄色为中染色2分，深黄色为强染色3分。对阳性细胞的百分比进行评分时，<5％定义为0分，<25％定义为1分，<75％定义为2分，>75％定义为3分。两个评分相加后得出半定量分析结果，如下：阴性–(0分)，弱阳性+(1–2分)，中度阳性++(3–4分)和强阳性+++(5–6分)。

[0060] 四、ENPP1蛋白表达和正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤与高级别浆液性卵巢癌的相关分析

[0061] 基于实验结果，我们发现ENPP1蛋白主要表达在细胞膜上和细胞浆中，ENPP1蛋白在正常卵巢组织中表达为阴性，在卵巢浆液性囊腺瘤表达为阴性或者弱阳性，而在高级别浆液性卵巢癌中普遍表达为中度阳性和强阳性。数据经统计学卡方检验后发现均有统计学显著差异。这一结果可用于临床对卵巢来源的浆液性癌和浆液性囊腺瘤的鉴别诊断。具体结果和分析数据见图1和表1。

[0062] 表1.ENPP1蛋白在正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤与高级别浆液性卵巢癌中的表达

[0063]

[0064] 注：#三组间比较；*正常卵巢上皮和浆液性囊腺瘤两组间比较；**正常卵巢上皮和高级别浆液性癌两组间比较；***浆液性囊腺瘤和高级别浆液性癌两组间比较。

[0065] 实施例2

[0066] ENPP1蛋白在高级别浆液性卵巢癌中表达的临床病理指标和预后因素的分层分析[0067] 基于实施例1的结果，对其中的高级别浆液性卵巢癌的临床病理指标和预后因素进行相关性分析，结果显示随着临床分期和细胞分化等级的提高，ENPP1蛋白的表达越来越强，这一结果提示ENPP1蛋白表达阴性和弱阳性患者预后较好，而表达强阳性患者常规治疗效果和预后差。中度阳性患者的治疗效果和预后情况介于两者之间。具体结果和分析数据见表2。

[0068] 表2.高级别浆液性卵巢癌中ENPP1蛋白表达和预后指标及化疗敏感性之间的关系[0069]

[0070]

[0071] Underlined values show statistical data with significant difference.[0072] Kendall's tau-b correlation coefficients(r)were applied by the Bivariate Correlation analysis.A P value less than 0.05 was considered significant.

[0073] 申请人声明：上述实施例为本发明较佳的实施方式，在阅读本发明的上述内容之后，在具体实行检测时，其他的任何在本发明的理论实质与实验原理下所作的改动或者修整，均应为本发明的等效置换方式，同样落在本发明的保护范围之内。