一种用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料（厄洛替尼‑季铵盐‑七甲川菁染料‑壳聚糖，CE7Q）及其制备方法。所述纳米材料是通过在壳聚糖表面修饰分子靶向药物厄洛替尼、季铵盐和七甲川菁染料形成的CE7Q纳米材料。该CE7Q纳米材料兼具分子靶向作用和较好的光热转换效率，实现光热治疗和分子靶向治疗的结合，提高肺癌耐药细胞对厄洛替尼的敏感性。

权利要求

1.一种用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料，其特征在于：所述壳聚糖纳米材料为厄洛替尼-季铵盐-七甲川菁染料-壳聚糖CE7Q，其结构式如下：其中x为七甲川菁染料Cy7修饰的壳聚糖重复单元的个数，y为季铵盐Q-amine修饰的壳聚糖重复单元的个数，z为厄洛替尼Er修饰的壳聚糖重复单元的个数；

上述用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料的制备方法，反应式如下：

其中1为N-4-叠氮-邻苯二甲酰亚胺基-壳聚糖CS-N3； 2为壳聚糖纳米材料CE7Q；n为壳聚糖衍生物重复单元的个数；x为Cy7修饰的壳聚糖重复单元的个数，y为Q-amine修饰的壳聚糖重复单元的个数，z为Er修饰的壳聚糖重复单元的个数；

所述用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料是N-4-叠氮-邻苯二甲酰亚胺基-壳聚糖CS-N3与Q-amine，Cy7和Er在无水硫酸铜和维生素C钠盐的催化作用下进行“点击化学”反应，得到壳聚糖纳米材料CE7Q；

所述壳聚糖纳米材料CE7Q中Er的接枝率为10%～40%，Cy7的接枝率为10%～40%，Q-amine的接枝率为20%～80%；

上述用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料的制备方法包括如下具体步骤：

（1）将CS-N3加入到装有二甲亚砜的烧瓶中，使CS-N3的终浓度为10 mg/mL，搅拌至完全溶解，然后加入和Cy7、Q-amine和Er；

（2）步骤（1）所得混合液置于氮气气氛中，将无水硫酸铜和维生素C钠盐分别溶于水，之后慢慢滴入烧瓶，室温条件下避光搅拌反应24-72小时；

（3）反应结束后将反应液用透析袋在二次水中透析三天，透析后，将产物冻干，得到CE7Q；

步骤（1）中，CS-N3和Q-amine，Er和Cy7的质量比为：2:0.6:0.7:1～7:9:1:1。

2.根据权利要求1所述的用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料，其特征在于：步骤（1）中，CS-N3和Q-amine，Er和Cy7的质量比为：5:4:1:1。

3.一种如权利要求1所述的壳聚糖纳米材料制成的纳米粒。

4.根据权利要求3所述的纳米粒，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：将所述壳聚糖米材料CE7Q加入到二甲亚砜中，搅拌溶解，然后用注射器缓慢滴加到二次水中，并在室温条件下避光搅拌，接着静置30～60 min，CE7Q通过自组装形成纳米粒CE7Qs。

说明书

一种用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料及其制备方法。

背景技术

[0002] 非小细胞肺癌（NSCLC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，在过去几十年中其治疗已取得一定进展，但晚期患者的生存期数据依然令人失望。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）作为一种有效抑制肿瘤细胞生长的靶向药物，为NSCLC的治疗带来了重大变革。在很短的时间内，EGFR-TKIs成为EGFR突变的晚期NSCLC患者的一线治疗药物（Nan X, Xie C, Yu X, et al. EGFR TKI as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer.[J]. Oncotarget, 2017, 8(43):75712-75726.）。厄洛替尼（Er）作为第一代EGFR-TKIs的代表性药物，显著提高了患者的总体生存率。不幸的是，大多数患者在接受EGFR-TKIs治疗9至13个月后会出现获得性耐药（Tan C S, Gilligan D, Pacey S. Treatment approaches for EGFR-inhibitor- resistant patients with non-small-cell lung cancer[J]. The Lancet Oncology, 2015, 16(9):e447-e459.）。

[0003] 光热治疗是利用光热剂在激光照射下产生的局部热量导致病理细胞热消融的方法。作为一种非侵入性的治疗手段，它具有副作用小、治疗效率高等特点。目前研究较多的光热剂包括纳米金、氧化铁和近红外（NIR）荧光染料，其中，七甲川菁染料因具有较高的光热转换效率，在肿瘤的光热治疗中得到关注。通过纳米载体将光热剂和化疗药物选择性地输送到肿瘤细胞，可以提高细胞对化疗药物的敏感性，逆转耐药，而且对周围的健康组织没有损伤。七甲川菁染料的光谱范围在700～1000 nm，作为近红外荧光成像剂具有荧光背景低，准确度高等优点（Shi C, Wu J B, Pan D. Review on near-infrared heptamethine cyanine dyes as theranostic agents for tumor imaging, targeting, and photodynamic therapy[J]. Journal of Biomedical Optics, 2016, 21(5):50901.）。

[0004] 壳聚糖是自然界仅次于纤维素的第二丰富的多糖，作为一种生物相容性强、可生物降解、黏附性强的阳离子聚合物，被应用于抗癌药物的有效递送。壳聚糖及其衍生物作为药物载体，可以达到药物缓释和控释的目的，提高药物的稳定性，减少药物的不良反应（Anish B, Rajagopal R. Multifaceted Applications of Chitosan in Cancer Drug Delivery and Therapy[J]. Marine Drugs, 2017, 15(4):96.）。但壳聚糖不溶于水，仅溶于稀醋酸等部分酸性溶液，限制了其进一步应用，需对壳聚糖的结构进行修饰。“点击化学”反应为聚合物的表面修饰提供了效率高、操作简单的方法，越来越多研究人员利用点击化学反应将活性分子或药物偶联在壳聚糖链上，得到功能性的壳聚糖。本发明专利申请人通过“点击化学”反应将季胺盐修饰到壳聚糖上可大大提高壳聚糖的水溶性（Gao Y, Zhang Z, Chen L, Gu W, Li Y. Synthesis of 6-N,N,N-trimethyltriazole chitosan via "click chemistry" and evaluation for gene delivery. Biomacromolecules. 2009, 10(8):2175-82.）。此外，本发明专利申请人前期也合成出Cy7和Er修饰的壳聚糖（高瑜，张慧娟，张英英，陈海军，贾力。一种具有肿瘤靶向性的厄洛替尼-Cy7-壳聚糖聚合物。授权号：
ZL 201710133540.0。），但其水溶性欠佳。在其基础上引入季胺盐，可有望提高该聚合物的水溶性，进一步拓宽其应用范围。

[0005] 基于上述研究背景，我们开发了一种新型壳聚糖纳米材料，用于肺癌的高效治疗。通过点击化学反应将季铵盐、厄洛替尼和七甲川菁染料偶联在壳聚糖链上，得到兼具分子靶向治疗和光热治疗功能的纳米材料CE7Q。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料及其制备方法。本发明的壳聚糖纳米材料能通过自组装形成纳米粒，联合光热治疗克服分子靶向药物厄洛替尼的耐药，实现肺癌的高效治疗。

[0007] 为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案：

[0008] 一种用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料，该壳聚糖纳米材料为厄洛替尼-季铵盐-七甲川菁染料-壳聚糖CE7Q，其结构式为：

[0009]

[0010] 其中x为Cy7修饰的壳聚糖重复单元的个数，y为Q-amine修饰的壳聚糖重复单元的个数，z为Er修饰的壳聚糖重复单元的个数。

[0011] 上述壳聚糖纳米材料CE7Q 中Er的接枝率为10%～40%， Cy7的接枝率为10%～40%， Q-amine的接枝率为20～80%。

[0012] 一种用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料CE7Q的制备方法，其反应式如下：

[0013]

[0014] 反应式中，1为N-4-叠氮-邻苯二甲酰亚胺基-壳聚糖（CS-N3）； 2为壳聚糖纳米材料CE7Q。

[0015] 一种用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料是N-4-叠氮-邻苯二甲酰亚胺基-壳聚糖CS-N3与Q-amine，Cy7和Er在无水硫酸铜和维生素C钠盐的催化作用下进行“点击化学”反应，得到壳聚糖纳米材料CE7Q。

[0016] 所述叠氮基修饰的壳聚糖CS-N3，是通过“点击化学”反应将季胺盐修饰到壳聚糖反应得到的，具体见参考文献：Gao Y, Zhang Z, Chen L, Gu W, Li Y. Synthesis of 6-N,N,N-trimethyltriazole chitosan via "click chemistry" and evaluation for gene delivery. Biomacromolecules. 2009, 10(8):2175-82.。Q-amine是由三甲胺和三溴丙炔经过一系列反应得到，具体见参考文献：Nguyen H K, Fournier O, Asseline U, et al. Smoothing of the thermal stability of DNA duplexes by using modified nucleosides and chaotropic agents[J]. Nucleic Acids Research, 1999, 27(6):1492.；Cy7是由苯肼和3-甲基-2-丁酮经过一系列反应得到，具体见参考文献： Yang Z, Lee J H, Jeon  H M, et al. Folate-Based  Near-Infrared  Fluorescent TheranosticGemcitabine Delivery[J]. Journal of the American Chemical Society, 
2013, 135(31):11657-11662.。

[0017] 一种用于肺癌治疗的壳聚糖纳米材料CE7Q的制备方法，包括如下具体步骤：

[0018] （1）将CS-N3加入到装有二甲亚砜的烧瓶中，使CS-N3的终浓度为10 mg/mL，搅拌至完全溶解，然后加入Cy7、Q-amine和Er。

[0019] （2）步骤（1）所得混合液置于氮气气氛中，将五水硫酸铜和维生素C钠盐分别溶于水，之后慢慢滴入烧瓶，室温条件下避光搅拌反应24-72小时。

[0020] （3）反应结束后将反应液用透析袋在二次水中透析三天，透析后，将产物冻干，得到CE7Q。

[0021] 上述步骤（1）中CS-N3与Q-amine，Er，Cy7的质量比为：2:0.6:0.7:1～7:9:1:1；

[0022] 优选的，步骤（1）中CS-N3与Q-amine，Er，Cy7的质量比为：5:4:1:1。

[0023] 上述步骤（2）中五水硫酸铜和维生素C钠盐的水溶液浓度分别为： 20 mg/mL和15 mg/mL，用量分别为200 μL。

[0024] 上述步骤（3）中透析袋截留分子量为8-14 KDa。

[0025] 本发明中所述的纳米材料CE7Q通过自组装形成纳米粒CE7Qs，其制备方法具体如下：称取CE7Q放入离心管中，加入二甲基亚砜配成1～5毫克/毫升溶液，然后用注射器吸取1毫升，缓慢滴入装有10 20毫升二次水的烧杯中，避光搅拌10 min后，室温静置30～60 min，~CE7Q通过自组装形成CE7Qs，即得所述的纳米粒CE7Qs。

[0026] 本发明的CE7Qs纳米粒能够用于肿瘤细胞的分子靶向治疗、光热治疗和近红外荧光成像。

[0027] 本发明的有益效果为：

[0028] 本发明的CE7Qs纳米粒以生物相容性较好的壳聚糖Cs为纳米载体，将季铵盐、分子靶向药物Er和光热试剂Cy7修饰到Cs上，通过自组装形成纳米粒，既解决Er溶解度差的问题，又得到一种新型光热纳米材料，通过光热治疗和分子靶向治疗的协同作用克服Er的耐药，同时对肺癌细胞进行荧光成像。

附图说明

[0029] 图1为本发明实施例1制备的Er，Cy7，Q-amine，CS-N3和CE7Q的红外图谱。

[0030] 图2为本发明实施例7中CQ，CEQ，C7Q和CE7Q的紫外图谱。

[0031] 图3为本发明实施例8中CQ，CEQ，C7Q和CE7Q的荧光图谱。

[0032] 图4为本发明实施例9中Cy7，CQ，CEQ，C7Q和CE7Q的温度效应。

[0033] 图5为本发明实施例10中不同浓度CE7Q的温度效应。

[0034] 图6为本发明实施例11的CQs，实施例12的CEQs，实施例13的C7Qs和实施例14的CE7Qs对H1975细胞的体外细胞毒性。

具体实施方式

[0035] 下面结合具体实施例，对本发明进行进一步说明，有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

[0036] 实施例1

[0037] 将20 mg N-4-叠氮-邻苯二甲酰亚胺基-壳聚糖CS-N（3 由购于上海伯奥生物科技有限公司、分子量为60 KDa、脱乙酰度为90%的壳聚糖为原料制备得到）加入到2 mL二甲亚砜中，搅拌至完全溶解，再在烧瓶中加入4 mg Er、16 mg Q-amine和4 mg的Cy7。上述体系置于氮气气氛中，用1 mL注射器往烧瓶中依次滴加200 μL五水硫酸铜的水溶液（20 mg/mL）和200 μL维生素C钠的水溶液（15 mg/mL）。用锡箔纸将烧瓶包住，室温搅拌三天。取出反应液，放入透析袋（8000～14000 Da）透析三天。取出透析液进行冷冻干燥，得到CE7Q。对CE7Q进行红外图谱分析，如图1所示，Cs-N3在2100 cm-1处有很强的叠氮基团的吸收峰，而CE7Q中此处吸收峰明显减弱，这表明Er、Cy7和季铵盐已成功通过“点击化学”反应连接到壳聚糖链上，经计算得出CE7Q中Er、Cy7和Q-amine的接枝率分别为27%、15%和58%。

[0038] 实施例2

[0039] 将21 mg N-4-叠氮-邻苯二甲酰亚胺基-壳聚糖CS-N3（由购于上海伯奥生物科技有限公司、分子量为60 KDa、脱乙酰度为90%的壳聚糖为原料制备得到）加入到2 mL二甲亚砜中，搅拌至完全溶解，再在烧瓶中加入3 mg Er、27 mg Q-amine和3 mg的Cy7。上述体系置于氮气气氛中，用1mL注射器往烧瓶中依次滴加200 μL五水硫酸铜的水溶液（20 mg/mL）和200 μL维生素C钠的水溶液（15 mg/mL）。用锡箔纸将烧瓶包住，室温搅拌三天。取出反应液，放入透析袋（8000～14000 Da）透析三天。取出透析液进行冷冻干燥，得到CE7Q，经计算得出CE7Q中Er、Cy7和Q-amine的接枝率分别为10%、10%和80%。

[0040] 实施例3

[0041] 将20 mg N-4-叠氮-邻苯二甲酰亚胺基-壳聚糖CS-N（3 由购于上海伯奥生物科技有限公司、分子量为60 KDa、脱乙酰度为90%的壳聚糖为原料制备得到）加入到2 mL二甲亚砜中，搅拌至完全溶解，再在烧瓶中加入7 mg Er、6 mg Q-amine和10 mg的Cy7。上述体系置于氮气气氛中，用1 mL注射器往烧瓶中依次滴加200 μL五水硫酸铜的水溶液（20 mg/mL）和200 μL维生素C钠的水溶液（15 mg/mL）。用锡箔纸将烧瓶包住，室温搅拌三天。取出反应液，放入透析袋（8000～14000 Da）透析三天。取出透析液进行冷冻干燥，得到CE7Q，经计算得出CE7Q中Er、Cy7和Q-amine的接枝率分别为40%、40%和20%。

[0042] 实施例4

[0043] 将20 mg N-4-叠氮-邻苯二甲酰亚胺基-壳聚糖CS-N3加入到2 mL二甲亚砜中，搅拌至完全溶解，再在烧瓶中加入4 mg Er、16 mg季铵盐。上述体系置于氮气气氛中，用1 mL注射器往烧瓶中依次滴加200 μL五水硫酸铜的水溶液（20 mg/mL）和200 μL维生素C钠的水溶液（15 mg/mL）。用锡箔纸将烧瓶包住，室温搅拌三天。取出反应液，放入透析袋（8000～14000 Da）透析三天。取出透析液进行冷冻干燥，得到CEQ。

[0044] 实施例5

[0045] 将20 mg N-4-叠氮-邻苯二甲酰亚胺基-壳聚糖CS-N3加入到2 mL二甲亚砜中，搅拌至完全溶解，再在烧瓶中加入16 mg Q-amine和4 mg 的Cy7。上述体系置于氮气气氛中，用1 mL注射器往烧瓶中依次滴加200 μL五水硫酸铜的水溶液（20 mg/mL）和200 μL维生素C钠的水溶液（15 mg/mL）。用锡箔纸将烧瓶包住，室温搅拌三天。取出反应液，放入透析袋（8000～14000 Da）透析三天。取出透析液进行冷冻干燥，得到C7Q。

[0046] 实施例6

[0047] 将20 mg N-4-叠氮-邻苯二甲酰亚胺基-壳聚糖CS-N3加入到2 mL二甲亚砜中，搅拌至完全溶解，再在烧瓶中加入16 mg Q-amine。上述体系置于氮气气氛中，用1 mL注射器往烧瓶中依次滴加200 μL五水硫酸铜的水溶液（20 mg/mL）和200 μL维生素C钠的水溶液（15 mg/mL）。用锡箔纸将烧瓶包住，室温搅拌三天。取出反应液，放入透析袋（8000～14000 Da）透析三天。取出透析液进行冷冻干燥，得到CQ。

[0048] 实施例7

[0049] 将CQ、C7Q、CEQ和CE7Q分别溶于二甲亚砜中，测其紫外吸收，如图2所示，Er在330 nm处有紫外特征吸收峰，Cy7在781 nm处有紫外特征吸收峰，CQ在300-900 nm无紫外吸收，CE7Q和CEQ在330 nm出现Er的紫外特征吸收峰吸收，表明Er已成功通过“点击化学”反应连接到壳聚糖链上；C7Q和CE7Q在785 nm出现Cy7的紫外特征吸收峰，证明Cy7已成功通过“点击化学”反应连接到壳聚糖链上。

[0050] 实施例8

[0051] 将CQ、C7Q、CEQ和CE7Q分别溶于二甲亚砜中，然后在激发波长633 nm下，测其荧光强度。如图3所示，CE7Q和C7Q在808 nm处有Cy7的特征峰，而CEQ和CQ没有荧光，表明CE7Q和C7Q中的Cy7已连接到壳聚糖链上，并且荧光特性没有被破坏。

[0052] 实施例9

[0053] 取Cy7浓度一致的Cy7，C7Q，CE7Q的二甲亚砜溶液，平行配置100 μg/mL 的CQ和CEQ的二甲亚砜溶液，分别暴露在808 nm激光（1.0 W/cm2）下照射0-5 min，用近红外成像仪观察溶液的温度变化。如图4所示，随着照射时间延长，CQ和CEQ溶液的温度没有明显变化，说明CQ和CEQ没有光热效果。Cy7、C7Q和CE7Q溶液的温度都随激光照射时间的增加而增加，其中CE7Q温度变化的速率最快。在照射3 min后，溶液温度的变化趋于平缓；在照射5 min后，Cy7溶液的温度达到40℃，而CE7Q溶液的温度达到57.5℃，这可能是因为CE7Q中的Cy7相比于游离的Cy7，具有更高的热转化效率。

[0054] 实施例10

[0055] 用DMSO配制一系列浓度梯度的CE7Q溶液，其中含Cy7量为0、5、10、15、20、25 μg/mL，分别暴露在808 nm激光下（1.0 W/cm2）照射0-5 min，用近红外成像仪观察溶液的温度变化。如图5所示，随着Cy7浓度的升高，照射相同时间下的CE7Q溶液的温度也升高。

[0056] 实施例11

[0057] 称取CQ放入离心管中，加入二甲基亚砜配成1～5毫克/毫升溶液，然后用注射器吸取1毫升，缓慢滴入装有10 20毫升纯水的烧杯中，搅拌10 min后，室温静置30 60 min，CQ通~ ~过自组装形成CQs。

[0058] 实施例12

[0059] 称取CEQ放入离心管中，加入二甲基亚砜配成1～5毫克/毫升溶液，然后用注射器吸取1毫升，缓慢滴入装有10～20毫升纯水的烧杯中，搅拌10 min后，室温静置30 60 min，~CEQ通过自组装形成CEQs。

[0060] 实施例13

[0061] 称取C7Q放入离心管中，加入二甲基亚砜配成1～5毫克/毫升溶液，然后用注射器吸取1毫升，缓慢滴入装有10～20毫升纯水的烧杯中，搅拌10 min后，室温静置30～60 min，C7Q通过自组装形成C7Qs。

[0062] 实施例14

[0063] 称取CE7Q放入离心管中，加入二甲基亚砜配成1～5毫克/毫升溶液，然后用注射器吸取1毫升，缓慢滴入装有10 20毫升纯水的烧杯中，搅拌10 min后，室温静置30～60 min，~CE7Q通过自组装形成CE7Qs。

[0064] 实施例15

[0065] 以H1975细胞（EGFR的L858R和T790M突变，Er突变耐药型）为测试细胞系（细胞购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心）。

[0066] 细胞培养方法：将H1975细胞的保种管从液氮罐中取出，迅速将保种管底部放入37℃水浴锅中，不断摇动，待冻存液融化后，在1000转/min的条件下离心5 min；弃去冻存液，用1 mL培养液将细胞沉淀吹打均匀后转移至培养瓶中，再向培养瓶中补加3 mL 培养基，将培养瓶置于37℃，5% CO2培养箱中培养。

[0067] 细胞毒性实验：选取对数期生长且状态良好的H1975细胞，经胰蛋白酶消化后，配5
制成细胞悬液（0.5-1×10个/mL）。按每孔100 µL细胞悬液的量接种到96孔板，置于含5% CO2，37℃培养箱中孵育24 h后，加入含有CEQs、C7Qs、CQs和CE7Qs的培养基。培养2小时后，照射组给予808 nm激光照射（功率：1.0 W/cm2，时间：5 min）。继续培养24 h后，吸弃旧培养基，用PBS洗两遍，每孔加入100 uL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），继续培养4 h后终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入100 uL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570 nm 处测量各孔的吸光值。并按下式计算细胞的存活率。

[0068] 存活率（%）=（实验组吸收值-溶剂对照组吸收值）/（空白组吸收值-溶剂对照组吸收值）。

[0069] 细胞毒性结果如图6所示。从图6 中看出，不同纳米粒对H1975细胞的增殖均具有抑制作用。与游离的Er相比，CEQs和CE7Qs对细胞的毒性增大。在NIR激光照射下，C7Qs+NIR比C7Qs有着更高的细胞毒性，这表明Cy7可用于光热治疗，升高的温度可以直接杀死细胞；CE7Qs+NIR比CE7Qs有着更高的细胞毒性，这表明升高的温度提高了耐药细胞对Er的敏感性，利用升高的温度和化疗药物联合能逆转细胞对Er的耐药。

[0070] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。