分泌抗马铃薯M病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

摘要

本发明公开了一种分泌抗马铃薯M病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用。以提纯的PVM病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能分泌抗PVM单抗的杂交瘤细胞株1E1，其保藏号为CGMCC No.17284。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10‑7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与PVM有特异性免疫反应，而不与马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒反应。利用1E1单抗建立检测马铃薯植株中PVM的ACP‑ELISA、dot‑ELISA和Tissue print‑ELISA检测方法，其中ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测病叶的灵敏度分别达到1:163840和1:10240倍稀释(w/v,g/mL)。

权利要求

1.一种分泌抗马铃薯M病毒单抗杂交瘤细胞株1E1，其特征在于能分泌抗马铃薯M病毒单抗，所述的杂交瘤细胞株1E1于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17284。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃薯M病毒单抗，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单克隆抗体与马铃薯M病毒34kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染PVM马铃薯病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:163840和1:10240倍稀释；

所述的单抗能与马铃薯M病毒有特异性反应，而不与马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒和健康的马铃薯植物组织粗提液反应。

3.一种如权利要求2所述的抗马铃薯M病毒单抗在马铃薯M病毒检测上的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于以权利要求2所述的抗马铃薯M病毒单抗为核心建立各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

说明书

分泌抗马铃薯M病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗马铃薯M病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

[0002] 1923年美国首次报道了马铃薯M病毒(Potato virus M,PVM)，其可引起马铃薯产量损失15％至45％。PVM属于乙型线型病毒科(Betaflexiviridae)麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)的成员，病毒颗粒呈610-700nm×12-15nm的弯曲细丝状。其基因组是一条约8500bp的单链正义RNA分子，其5'末端含有帽子结构，在3'末端有poly(A)尾，并含有6个开放阅读框(ORF)。ORF 1编码含有甲基转移酶、解旋酶和聚合酶结构域的多肽，对于PVM RNA复制重要。重叠的ORF 2、3和4编码与病毒移动相关的三基因连锁结构(TGB)编码蛋白。ORF 
5和ORF 6编码34kDa病毒衣壳蛋白(CP)和11kDa富含半胱氨酸的核酸结合蛋白(NABP)。

[0003] PVM自然寄主范围较窄，主要侵染茄科植物，包括马铃薯、番茄、洋金花及人参果等。该病毒通过蚜虫以非持久的方式传播，并可通过机械接种传播。PVM感染的田间寄主植物主要表现为潜隐花叶、叶片皱缩、小叶畸形、植株顶端卷曲、叶柄和茎部坏死以及植物发育迟缓等症状。但在许多情况下，PVM的症状难以与PVS、PVX、PVY等其它病毒引起的症状区分开来。此外，PVM在不同的马铃薯品种或在不同条件下生长的相同马铃薯品种中引起的症状通常差别很大。

[0004] 为了调查我国马铃薯上PVM的发病情况、强化我国PVM检测和诊断技术及科学指导防控，急需建立检测PVM经济、高通量的检测技术。与常规的指示植物接种、电镜观察、分子检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可大规模检测等优点，是植物病毒检测和调查最实用的方法。但血清学的方法的建立依赖于特异性高质量的病毒抗体。本发明以纯化的PVM病毒粒子作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌PVM特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测PVM的高通量的血清学方法及试剂盒，从而为我国PVM的检测和诊断、流行病学的调查、无毒种薯的生产、病毒基因组功能的分析及科学防控体系的建立提供物质和技术支持。

发明内容

[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗马铃薯M病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

[0006] 分泌抗马铃薯M病毒单抗的杂交瘤细胞株1E1，它能分泌抗马铃薯M病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株1E1于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17284。

[0007] 一种所述的杂交瘤细胞分泌的抗马铃薯M病毒单克隆抗体，抗马铃薯M病毒单克隆7
抗体腹水间接ELISA效价达10- ，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与马铃薯M病毒34kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，单抗检测感染PVM马铃薯病叶组织粗提液的灵敏度达到1:163840和1:10240倍稀释(w/v,g/mL)。

[0008] 抗马铃薯M病毒单克隆抗体能与马铃薯M病毒有特异性反应，而不与马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒和健康的马铃薯植物组织粗提液反应。

[0009] 抗马铃薯M病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

[0010] 本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗马铃薯M病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue print-ELISA血清学检测方法和免疫学试剂盒能高度特异、灵敏、准确地检测马铃薯M病毒；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测马铃薯M病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体可有效地用于田间马铃薯M病毒的检测和诊断，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、脱毒种薯生产、抗性育种、科学防控等方面。

附图说明

[0011] 图1 dot-ELISA方法检测PVM的特异性分析；

[0012] 图2 dot-ELISA方法检测PVM的灵敏度分析；

[0013] 图3 dot-ELISA(A)和ACP-ELISA(B)田间检测PVM代表性结果；a1-10、b1-8分别是马铃薯样品，b9和b10分别为感染PVM病叶的阳性对照和健康马铃薯叶的阴性对照。

[0014] 图4 RT-PCR对田间疑似发病马铃薯样品检测代表性结果；a1-10、b1-8分别是马铃薯样品，b9和b10分别为感染PVM病叶的阳性对照和健康马铃薯叶的阴性对照[0015] 图5 Tissue print-ELISA田间检测PVM代表性结果。a1-10、b1-8分别是马铃薯样品，b9和b10分别为感染PVM病叶的阳性对照和健康马铃薯叶的阴性对照

[0016] 生物保藏

[0017] 分泌抗马铃薯M病毒单抗杂交瘤细胞株1E1于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.17284。

具体实施方式

[0018] 分泌抗马铃薯M病毒单抗杂交瘤细胞株1E1于2019年1月25日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17284，它能分泌抗马铃薯M病毒的单抗。

[0019] 一种所述的杂交瘤细胞分泌抗马铃薯M病毒单克隆抗体，抗马铃薯M病毒单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与马铃薯M病毒34kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，单抗检测感染PVM马铃薯病叶组织粗提液的灵敏度达到1:163840和1:10240倍稀释(w/v,g/mL)。

[0020] 抗马铃薯M病毒单克隆抗体能与马铃薯M病毒有特异性反应，而不与马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒和健康马铃薯植物组织粗提液反应。

[0021] 抗马铃薯M病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

[0022] 本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗马铃薯M病毒单抗，且该细胞株分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好、灵敏度高。以该单抗为核心建立检测PVM的高通量的血清学方法可成功应用于田间PVM的检测，从而为我国PVM病检测和诊断、脱毒种薯的生产、科学防控提供物质和技术支持。

[0023] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

[0024] 一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备

[0025] 1.免疫原及检测抗原的制备

[0026] 用以下操作步骤提纯病毒粒子：

[0027] 1)将组织匀浆器在冰上预冷；

[0028] 2)称取感染PVM的马铃薯病叶组织200g，加入400mL 0.5M磷酸盐缓冲液即PB缓冲液(含0.01M Na-EDTA和0.1％巯基乙醇，pH7.5)，在组织匀浆器中匀浆5-10min使马铃薯植物组织充分匀浆，用双层棉纱布过滤匀浆液，滤液6 000rpm离心20min去除植物残渣；

[0029] 3)所得的上清液在搅拌中加至终浓度为2.5％Triton X-100、4％PEG(分子量为6 000)和0.1M NaCl，然后4℃搅拌4h以上；

[0030] 4)11 000rpm离心15min后去上清；

[0031] 5)用pH 7.5的0.5M PB(含0.01M MgCl2和0.5M脲)将沉淀充分悬浮，6 000rpm离心15min后将上清收集于烧杯中于4℃放置，沉淀再悬浮、离心，重复3次；

[0032] 6)将上述离心上清液合并，33 000rpm超速离心100min；

[0033] 7)所得沉淀用PB悬浮后8 000rpm离心15min，收集上清液，沉淀再悬浮、离心，重复3次；

[0034] 8)将合并上清液加到超离管中，用注射器针头吸取30％蔗糖加到超离管的底部形成蔗糖垫，33 000rpm超速离心100min；

[0035] 9)所得沉淀用适量的0.01M PB(含0.01M MgCl2，pH 7.5)悬浮，33000rpm超速离心100min，去除蔗糖垫；

[0036] 10)所得沉淀用0.01M PB悬浮，所得悬浮液即为病毒提纯液；

[0037] 11)病毒提纯液经3％磷钨酸(pH 6.7)负染后，置于JEOL JEM-1200EX电镜下观察发现大量高纯度的PVM粒子。

[0038] 2.免疫动物

[0039] 用提纯的PVM病毒粒子免疫6周龄BALB/c雌性小鼠：PVM病毒粒子100μL/只与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后经腹腔加皮下注射200μL每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射200μL每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

[0040] 3.细胞融合

[0041] 取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按11:1的比例在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1 500rpm离心5min后去除培养基，含有细胞的离心管在37℃水浴中加入1mL 50％PEG(分子量1500)融合剂，融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1 500rpm离心5min，吸去上清后沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞板中，于37℃5％CO2的细胞培养箱中培养。

[0042] 4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及细胞克隆

[0043] 细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第12天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10％以上时，以感染PVM的马铃薯病叶粗提液为包被抗原用间接ELISA方法筛选阳性孔，共获263个阳性孔。对263孔进行特异性分析，筛选出10个呈特异性的细胞株，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌PVM特异性单抗的杂交瘤细胞株1E1。经4个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

[0044] 5.单克隆抗体腹水制备及纯化

[0045] 取8周龄左右BALB/c小鼠，腹腔注射0.3-0.5mL降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入7×105个杂交瘤细胞，注射杂交瘤细胞后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，用针头采取腹水，
8000rpm离心3min，收集上清液即为单克隆抗体腹水。

[0046] 取1倍体积腹水加2倍体积0.85％生理盐水稀释，室温下边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液(pH 7.0)，4℃过夜，10,000rpm离心20min，2mL 0.85％生理盐水悬浮沉淀，在4℃透析24h后即获纯化的单抗，-80℃保存。

[0047] 6.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

[0048] 将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果分析1E1单抗亚类为IgG1、kappa轻链。以提纯的病毒粒子为抗原，用间接ELISA方法检测单抗腹水效价，分析结果表明单抗腹水效价达10-7。7.单克隆抗体的特异性检测

[0049] 用感染马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)和马铃薯卷叶病毒(PLRV)的病叶粗提液包被ELISA板，以马铃薯健康叶片粗提液作阴性对照，以感染PVM的马铃薯病叶粗提液为阳性对照，用间接ELISA方法分析单抗的特异性。间接ELISA方法的步骤：上述病毒感染的病叶和健康叶片分别在研钵中研磨，按1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液匀浆，5 000rpm离心3min后上清100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2h；PBST洗涤3次后用3％的脱脂奶粉封闭30-60min；加入1:5 000倍稀释的单抗
100μL/孔，37℃孵育1-2h；PBST洗涤3次后加:1:8 000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100μL/孔，37℃孵育1-2h；PBST洗涤4次后用PNPP底物显色30-
60min，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD405的值，与阴性OD值比值大于3.1的样品为阳性。结果发现，1E1单抗对PVM有强阳性免疫反应，而与感染PVS、PVA、PVX、PVY和PLRV的病叶和健康马铃薯组织粗提液均无任何免疫反应。

[0050] 二、检测PVM血清学方法的建立

[0051] 1检测PVM的ACP-ELISA检测方法

[0052] 1.1 ACP-ELISA方法的步骤：

[0053] 1)叶片在研钵中研磨后按1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液继续匀浆3min，5 000rpm离心3min后上清100μL/孔包被ELISA板，以感染PVM的马铃薯叶片组织作为阳性对照，以健康马铃薯叶片组织作阴性对照，4℃包被过夜或37℃包被2h；

[0054] 2)用PBST洗ELISA板3次，每次3min，之后每孔加入250μL封闭液(含3％脱脂奶的PBS)，37℃封闭0.5-1h；

[0055] 3)弃板中封闭液，PBST洗涤3次后，用封闭液适当稀释的单抗腹水100μL/孔，37℃孵育1-2h；

[0056] 4)弃板中单抗稀释液，PBST洗涤3次后加入适当稀释的AP标记羊抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL/孔，37℃反应1-2h；

[0057] 5)PBST洗涤4次，每次3min。加PNPP底物于室温显色30-60min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或2M氢氧化钠终止反应后用Bio-Rad 680酶标仪测OD405，以P/N>3.1作为阳性判断标准。1.2检测PVM ACP-ELISA方法的建立

[0058] 采用方阵试验确定ACP-ELISA方法中抗体的最适工作浓度，即用1:20倍稀释的(w/v,g/mL)PVM病叶粗提液作为抗原包被ELISA板；ELISA版横向每列加入1:1000-1:512000倍比稀释的PVM单抗反应1h，PBST洗涤后ELISA板纵向每行加入1:1000-1:512000倍比稀释的AP标记的羊抗鼠IgG二抗，健康马铃薯植物稀释粗提液作为阴性对照，每个处理设3次重复，确定ACP-ELISA的最适抗体工作浓度。结果显示1E1单抗以1:5000倍稀释和AP标记的羊抗鼠IgG二抗以1:8000倍稀释为最适工作浓度，根据最适工作浓度建立检测PVM的ACP-ELISA方法。

[0059] 1.3 ACP-ELISA方法及PVM单抗的特异性和灵敏度

[0060] 以感染PVM的马铃薯病叶和健康马铃薯叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，取感染PVS马铃薯病叶、感染PVA马铃薯病叶、感染PVX马铃薯病叶、感染PVY马铃薯病叶、感染PLRV马铃薯病叶和健康马铃薯叶片作为检测样品，加到ELISA板中，重复实验三次，分析PVM单抗及建立的ACP-ELISA方法的特异性。在抗体最适工作浓度下，该方法检测感染PVM的马铃薯病叶均呈强阳性反应，而检测感染PVS、PVA、PVX、PVY、PLRV植物叶片和健康马铃薯叶片粗提液呈阴性反应，且OD值差异极显著，说明该方法和单抗的特异性好。

[0061] 将感染PVM的马铃薯病叶和健康马铃薯叶片分别用PBS缓冲液从1:10倍至1:163840倍(w/v,g/mL)倍比稀释，依次加到ELISA板，实验重复三次，分析ACP-ELISA方法检测PVM的灵敏度。结果表明，ACP-ELISA检测病叶的灵敏度达到1:163840倍稀释(w/v,g/mL)，说明制备的单抗和建立的方法具有很好的灵敏度。

[0062] 2 dot-ELISA检测方法的建立及其田间样品检测

[0063] 2.1方法步骤

[0064] 1)在研钵中研磨马铃薯植物组织，按1:20(w/v,g/mL)比例加入0.01M PBS缓冲液匀浆，5000rpm离心3min，上清即为植物组织粗提液；

[0065] 2)点样：取2-3μL粗提液点到硝酸纤维素(NC)膜上，同时设置健康和感染PVM的马铃薯叶片粗提液分别作为阴性和阳性对照，37℃恒温箱烘干10min；

[0066] 3)NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育1h；

[0067] 5)洗膜：用PBST洗膜3次，每次3min；

[0068] 6)NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育1h后洗膜4-5次，每次3min；

[0069] 7)显色：66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10ml底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)混匀，用吸水纸把膜吸干，膜放入底物液中反应，室温避光显色15-20min。肉眼观察结果，当阳性对照显现紫色斑点，而阴性对照无变化时膜在自来水中漂洗终止反应，拍照并记录结果。

[0070] 2.2检测PVM dot-ELISA方法的建立

[0071] 从1:1000倍开始分别进行倍比稀释PVM单克隆抗体和AP标记的羊抗鼠IgG二抗，用方阵实验确定dot-ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适工作浓度。实验结果表明，单抗和酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:8000倍稀释，以上述抗体的最适工作浓度建立检测病叶中PVM的dot-ELISA方法。

[0072] 2.3 dot-ELISA方法检测PVM的特异性和灵敏度

[0073] 以感染PVM的马铃薯病叶和健康马铃薯叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，取来自黑龙江和云南感染PVM的马铃薯病叶，以及感染PVS马铃薯病叶、感染PVA马铃薯病叶、感染PVX马铃薯病叶、感染PVY马铃薯病叶和感染PLRV马铃薯病叶作为检测样品，进行dot-ELISA方法的特异性分析。该方法检测来自黑龙江和云南感染PVM的马铃薯病叶粗提液均呈强阳性反应，而检测PVS马铃薯病叶、感染PVA马铃薯病叶、感染PVX马铃薯病叶、感染PVY马铃薯病叶和感染PLRV马铃薯病叶和健康马铃薯植物叶片粗提液均呈阴性反应(图1)，说明该方法和单抗的特异性好。

[0074] 取感染PVM的马铃薯病叶在研钵中研磨匀浆，用0.01M PBS从1:10至1:10240倍倍比稀释(w/v,g/mL)，同样对健康马铃薯叶片粗提液作相同处理。用dot-ELISA方法检测感染PVM病叶的灵敏度。灵敏度分析表明，当PVM病叶粗提液稀释到1:10240倍(w/v,g/mL)时，用建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:10240倍稀释(图2)。

[0075] 用建立的dot-ELISA方法和ACP-ELISA方法对2017-2018年采自黑龙江和云南的田间疑似发病马铃薯样品进行检测(检测顺序一致)，结果发现，50个马铃薯检测样品中有12个样品产生紫色的阳性斑点，图3为18个代表性样品的检测结果。样品同时用RT-PCR方法进行分析，结果表明所有dot-ELISA阳性样品中均扩增到PVM特异性的基因片段，而所有dot-ELISA检测阴性的样品中均未扩增到基因片段(图4)，PCR产物核酸测序表明阳性样品确实感染PVM。说明该dot-ELISA方法和ACP-ELISA方法能准确、可靠地用于马铃薯样品中马铃薯M病毒的检测。

[0076] 3.检测PVM的Tissue print-ELISA方法的建立及其田间样品检测

[0077] 3.1 Tissue print-ELISA操作步骤:

[0078] 1)样品准备：取马铃薯的叶片(将嫩叶卷成圆筒状)或茎或马铃薯块茎，用刀片切一个横断面；

[0079] 2)点样：将横断面在NC膜上按压3sec，同时将健康和感染PVM组织分别作为阴性和阳性对照，37℃烘箱干燥5min；

[0080] 3)封闭：NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭1h；

[0081] 4)一抗孵育：NC膜放入适当稀释的PVM单抗中室温孵育1h；

[0082] 5)二抗孵育：用PBST洗膜3次后NC膜放入适当稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG中室温孵育1h；

[0083] 6)PBST洗膜4-5次，每次3min；

[0084] 7)加底物显色：10ml显色缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH 9.5)中加入66μl NBT和33μl BCIP底物(Promega)混匀，将膜浸入显色液中进行显色反应，直至阳性显色明显、阴性对照没有背景时将膜在去离子水中漂洗终止反应，记录显色结果。

[0085] 3.2 Tissue print-ELISA最适抗体工作浓度的确定及其田间样品检测[0086] 通过常规方阵实验确定单抗和酶标二抗的最适工作浓度。选择检测灵敏度和特异性最高时一抗、酶标二抗稀释度组合为Tissueprint-ELISA的最适工作浓度。结果发现单抗1E1和AP标记的羊抗鼠二抗分别稀释1:5000和1:8000倍时Tissue print-ELISA方法的检测灵敏度和特异性最佳，根据抗体最适工作浓度建立Tissue print-ELISA方法，并利用该方法对2017-2018年采自黑龙江和云南的田间疑似发病马铃薯样品进行检测，结果发现，50个马铃薯检测样品中有12个样品产生紫色的阳性斑点，图5为18个代表性样品的检测结果。样品进一步用RT-PCR检测，结果表明所有Tissue print-ELISA检测阳性样品均扩增到PVM特异性PCR产物，而所有Tissue print-ELISA检测阴性样品均未扩增到任何特异性PCR产物(图4)。PCR产物核酸测序表明阳性样品确实感染PVM，说明该Tissue print-ELISA方法能准确、可靠地用于马铃薯样品中马铃薯M病毒的检测。

[0087] 4.马铃薯M病毒dot-ELISA检测试剂盒

[0088] 1)试剂盒主要成分：

[0089]

[0090] 以上试剂均保存于4℃

[0091] 硝酸纤维素膜(NC)10张

[0092] 2)检测马铃薯样品的操作步骤：

[0093] a.马铃薯植物组织称重、在研钵中研磨，按1:10-30比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后匀浆；

[0094] b.匀浆液5 000rpm离心3min；

[0095] c.取2.5μl上清点样于NC膜上，同时设置健康和感染PVM的马铃薯组织分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；

[0096] d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01MPBS)封闭液中室温封闭30min；

[0097] e.NC膜放入1:4000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；

[0098] f.用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入1:5000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；

[0099] g.PBST洗膜4-5次，每次3min；

[0100] h.66μl NBT和33μl BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M TrisCl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中，混匀后膜放入底物液中显色，肉眼观察结果，待阳性对照显明显紫色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。

[0101] 3)保存及有效期：

[0102] 于2-8℃避光保存，有效期12个月。

[0103] 4)缓冲液配方：

[0104] 磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)：

[0105]

[0106]

[0107] 加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000mL

[0108] ELISA洗涤液(0.01M PBST)：1000mL 0.01M PBS中加0.5mLTween-20[0109] ELISA封闭液：0.01M PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％(w/v,g/mL)。

[0110] 5.马铃薯M病毒Tissue print-ELISA检测试剂盒

[0111] 1)试剂盒主要成分：

[0112]

[0113] 以上试剂均保存于4℃

[0114] 硝酸纤维素膜(NC)10张

[0115] 2)检测马铃薯样品的操作步骤：

[0116] a.样品准备：取马铃薯的叶片或茎，将嫩叶卷成圆筒状用刀片切一个横断面，嫩茎直接切成横断面；

[0117] b.点样：将横断面在NC膜上按压3sec，同时将健康和感染PVM组织分别作为阴性和阳性对照，37℃烘箱干燥5min；

[0118] c.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01MPBS)封闭液中室温封闭30min；

[0119] d.NC膜放入1:4000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；

[0120] e.用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入1:5000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；

[0121] f.PBST洗膜4-5次，每次3min；

[0122] g.66μl NBT和33μl BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M TrisCl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中，混匀后膜放入底物液中显色，肉眼观察结果，待阳性对照显明显紫色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。

[0123] 3)保存及有效期：

[0124] 于2-8℃避光保存，有效期12个月。

[0125] 4)缓冲液配方：

[0126] 磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)：

[0127]

[0128] 加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000mL

[0129] ELISA洗涤液(0.01M PBST)：1000mL 0.01M PBS中加0.5mLTween-20[0130] ELISA封闭液：0.01M PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％(w/v,g/mL)。