一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法

摘要

本发明提供一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，在鱼尾采集血液提取线粒体基因组DNA，将核裂解液加入至血液中均质，再添加装有磁珠的蛋白沉淀液进行旋涡振荡，提取上清液后再进行微波震动，获得石斑鱼线粒体基因组DNA，本发明提取DNA完整度高，效率好，浓度高，优化了提取的步骤，缩短提取时间，操作简单，以获得一种快速、经济、效果良好的提取鱼类基因组的方法。

权利要求

1.一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、采用一次性无菌注射器在鱼的尾部位提取血液0.1mL～0.2mL；

S2、将提取后的血液加入核裂解液，倒入研磨珠均质器中在压力为25～50MPa下裂解80～100s，得血液Ⅰ；

所述核裂解液为血液体积的4～6倍，包括以下重量份原料：氯化钠30～58份，去垢剂22～39份、蛋白酶抑制剂33～68份；

所述去垢剂为质量比1：3～5的地榆多糖、海藻酸钠；

所述蛋白酶抑制剂为质量比1.2～2.8：3.2～5.8：1～3.5的磷酸缓冲液、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸；

S3、将装有磁珠的蛋白沉淀液加入至血液Ⅰ中，蛋白沉淀液和血液Ⅰ的体积比为4～7：1，水浴加热溶解30～50min后进行漩涡振荡20-28h，取上清液为血液Ⅱ，所述蛋白沉淀液由摩尔比为3～5：8～11：5～9的醋酸钾、冰乙酸、醋酸钾；

S4、将血液Ⅱ加入蛋白沉淀液，蛋白沉淀液和血液Ⅱ的体积比为2～5：1，在频率为

500MHz～1000MHz/s下再进行微波震动1～3h，取上清液为血液Ⅲ；

S5、用清水将血液Ⅲ洗涤2～4遍。

2.如权利要求1所述一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，其特征在于：所述S3步骤中水浴加热温度为51～75℃，漩涡振荡的振荡速度为1000～3000rpm，温度为30～40℃。

说明书

一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及DNA提取技术领域，特别涉及一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法。

背景技术

[0002] 石斑鱼，属鲈形目，体长椭圆形稍侧扁。口大，具辅上颌骨，牙细尖，有的扩大成犬牙。体被小栉鳞，有时常埋于皮下。背鳍和臀鳍棘发达，尾鳍圆形或凹形，体色变异甚多，常呈褐色或红色，并具条纹和斑点，为暖水性的大中型海产鱼类。目前，国内外已成功建立从鱼组织、器官中提取高纯度DNA的方法。但是这些方法的缺点很明显，如取材时往往要将研究对象杀死。以鱼类鳍条、鱼血为材料提取DNA虽然不至于使鱼死亡，但由于损伤了鱼类的活动器官使鱼类的正常生活受到影响，对生产造成一定损失，提取操作繁琐，耗时长，且加入过多的有机溶剂，使获取的DNA不够完整。

发明内容

[0003] 鉴以此，本发明提出一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，解决上述技术问题。

[0004] 本发明的技术方案是这样实现的：

[0005] 一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，包括以下步骤：

[0006] S1、采用一次性无菌注射器在鱼的尾部位提取血液0.1mL～0.2mL；

[0007] S2、将提取后的血液加入核裂解液，倒入研磨珠在压力为25～50MPa的均质器中裂解80～100s，得血液Ⅰ；

[0008] S3、将装有磁珠的蛋白沉淀液加入至血液Ⅰ中，蛋白沉淀液和血液Ⅰ的体积比为4～7：1，在温度为51～75℃下水浴加热溶解30～50min后进行漩涡振荡20-28h，振荡速度为
1000～3000rpm，温度为30～40℃，取上清液为血液Ⅱ；

[0009] S4、将体积比为2～5：1的蛋白沉淀液和血液Ⅱ混合，再进行微波震动1～3h，微波震动频率为500MHz～1000MHz/s，取上清液为血液Ⅲ；

[0010] S5、用清水将血液Ⅲ洗涤2～4遍。

[0011] 进一步的，所述核裂解液为血液体积的4～6倍，包括以下重量份原料：氯化钠30～58份，去垢剂22～39份、蛋白酶抑制剂33～68份。

[0012] 进一步的，所述去垢剂为质量比1：3～5的地榆多糖、海藻酸钠。

[0013] 进一步的，所述蛋白酶抑制剂为质量比1.2～2.8：3.2～5.8：1～3.5的磷酸缓冲液、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸。

[0014] 进一步的，所述蛋白沉淀液由摩尔比为3～5：8～11：5～9的醋酸钾、冰乙酸、醋酸钾。

[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0016] (1)本发明的快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，通过全血基因组优化提取方法，提取效率高，操作简单，时间短，且不用杀死鱼类，从尾静脉采血不会对鱼的生存造成威胁；添加核裂解液后进行均质器中裂解，分离鱼类红细胞核基因组与蛋白质，有利于提取线粒体基因组DNA。

[0017] (2)加入蛋白沉淀液，在磁场的作用下旋涡振荡能够快速的吸附鱼类基因组的核酸分子，使磁性颗粒与溶液分离，反应一段时间之后，再次加入蛋白沉淀液，经过微波震动，蛋白质等杂质不被吸附留在溶液，可以得到高纯度的DNA片段，本发明整个提取DNA的过程不需要离心、不需要有机溶剂清洗，优化了提取的步骤，缩短提取时间，操作简单，以获得一种快速、经济、效果良好的提取鱼类基因组的方法。

具体实施方式

[0018] 为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

[0019] 本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0020] 本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0021] 实施例1

[0022] 一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，包括以下步骤：

[0023] S1、采用一次性无菌注射器在鱼的尾部位提取血液0.1mL；

[0024] S2、将提取后的血液加入血液体积5倍的核裂解液，倒入研磨珠在压力为25MPa的均质器中裂解80s，得血液Ⅰ，核裂解液包括以下重量份原料：氯化钠42份，去垢剂31份、蛋白酶抑制剂53份；

[0025] 上述去垢剂为质量比1：4的地榆多糖、海藻酸钠；蛋白酶抑制剂为质量比2.2：4.3：2.5的磷酸缓冲液、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸；

[0026] S3、将装有磁珠的蛋白沉淀液加入至血液Ⅰ中，蛋白沉淀液和血液Ⅰ的体积比为4：1，在温度为51℃下水浴加热溶解30min后进行漩涡振荡20h，振荡速度为1000rpm，温度为30℃，取上清液为血液Ⅱ；

[0027] S4、将体积比为2～5：1的蛋白沉淀液和血液Ⅱ混合，再进行微波震动1h，微波震动频率为500MHz/s，取上清液为血液Ⅲ；

[0028] 上述蛋白沉淀液由摩尔比为4：9：7的醋酸钾、冰乙酸、醋酸钾；

[0029] S5、用清水将血液Ⅲ洗涤2遍。

[0030] 实施例2

[0031] 一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，包括以下步骤：

[0032] S1、采用一次性无菌注射器在鱼的尾部位提取血液0.2mL；

[0033] S2、将提取后的血液加入血液体积5倍的核裂解液，倒入研磨珠在压力为50MPa的均质器中裂解100s，得血液Ⅰ，核裂解液包括以下重量份原料：氯化钠42份，去垢剂31份、蛋白酶抑制剂53份；

[0034] 上述去垢剂为质量比1：4的地榆多糖、海藻酸钠；蛋白酶抑制剂为质量比2.2：4.3：2.5的磷酸缓冲液、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸；

[0035] S3、将装有磁珠的蛋白沉淀液加入至血液Ⅰ中，蛋白沉淀液和血液Ⅰ的体积比为7：1，在温度为75℃下水浴加热溶解50min后进行漩涡振荡28h，振荡速度为3000rpm，温度为40℃，取上清液为血液Ⅱ；

[0036] S4、将体积比为5：1的蛋白沉淀液和血液Ⅱ混合，再进行微波震动3h，微波震动频率为1000MHz/s，取上清液为血液Ⅲ；

[0037] 上述蛋白沉淀液由摩尔比为4：9：7的醋酸钾、冰乙酸、醋酸钾；

[0038] S5、用清水将血液Ⅲ洗涤4遍。

[0039] 实施例3

[0040] 一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，包括以下步骤：

[0041] S1、采用一次性无菌注射器在鱼的尾部位提取血液0.15mL；

[0042] S2、将提取后的血液加入血液体积5倍的核裂解液，倒入研磨珠在压力为37MPa的均质器中裂解90s，得血液Ⅰ，核裂解液包括以下重量份原料：氯化钠42份，去垢剂31份、蛋白酶抑制剂53份；

[0043] 上述去垢剂为质量比1：4的地榆多糖、海藻酸钠，蛋白酶抑制剂为质量比2.2：4.3：2.5的磷酸缓冲液、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸；

[0044] S3、将装有磁珠的蛋白沉淀液加入至血液Ⅰ中，蛋白沉淀液和血液Ⅰ的体积比为5：1，在温度为60℃下水浴加热溶解40min后进行漩涡振荡24h，振荡速度为2000rpm，温度为35℃，取上清液为血液Ⅱ；

[0045] S4、将体积比为3：1的蛋白沉淀液和血液Ⅱ混合，再进行微波震动2h，微波震动频率为700MHz/s，取上清液为血液Ⅲ；

[0046] 上述蛋白沉淀液由摩尔比为4：9：7的醋酸钾、冰乙酸、醋酸钾

[0047] S5、用清水将血液Ⅲ洗涤3遍。

[0048] 实施例4

[0049] S1、采用一次性无菌注射器在鱼的尾部位提取血液0.15mL；

[0050] S2、将提取后的血液加入体积4倍的核裂解液，倒入研磨珠在压力为37MPa的均质器中裂解90s，得血液Ⅰ，核裂解液包括以下重量份原料：氯化钠30份，去垢剂22份、蛋白酶抑制剂33份，

[0051] 上述去垢剂为质量比1：3的地榆多糖、海藻酸钠，蛋白酶抑制剂为质量比1.2：3.2：1的磷酸缓冲液、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸；

[0052] S3、将装有磁珠的蛋白沉淀液加入至血液Ⅰ中，蛋白沉淀液和血液Ⅰ的体积比为5：1，在温度为60℃下水浴加热溶解40min后进行漩涡振荡24h，振荡速度为2000rpm，温度为35℃，取上清液为血液Ⅱ；

[0053] S4、将体积比为3：1的蛋白沉淀液和血液Ⅱ混合，再进行微波震动2h，微波震动频率为700MHz/s，取上清液为血液Ⅲ；

[0054] 上述蛋白沉淀液由摩尔比为3：8：5的醋酸钾、冰乙酸、醋酸钾；

[0055] S5、用清水将血液Ⅲ洗涤3遍。

[0056] 实施例5

[0057] S1、采用一次性无菌注射器在鱼的尾部位提取血液0.15mL；

[0058] S2、将提取后的血液加入体积6倍的核裂解液，倒入研磨珠在压力为37MPa的均质器中裂解90s，得血液Ⅰ；核裂解液包括以下重量份原料：氯化钠58份，去垢剂39份、蛋白酶抑制剂68份；

[0059] 上述去垢剂为质量比1：5的地榆多糖、海藻酸钠；蛋白酶抑制剂为质量比2.8：5.8：3.5的磷酸缓冲液、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸；

[0060] S3、将装有磁珠的蛋白沉淀液加入至血液Ⅰ中，蛋白沉淀液和血液Ⅰ的体积比为5：1，在温度为60℃下水浴加热溶解40min后进行漩涡振荡24h，振荡速度为2000rpm，温度为35℃，取上清液为血液Ⅱ；

[0061] S4、将体积比为3：1的蛋白沉淀液和血液Ⅱ混合，再进行微波震动2h，微波震动频率为700MHz/s，取上清液为血液Ⅲ；

[0062] 上述蛋白沉淀液由摩尔比为5：11：9的醋酸钾、冰乙酸、醋酸钾。

[0063] S5、用清水将血液Ⅲ洗涤3遍。

[0064] 实施例6

[0065] 本实施例与实施例3的区别在于，一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，所述去垢剂为质量比1：8的地榆多糖、海藻酸钠。

[0066] 实施例7

[0067] 本实施例与实施例3的区别在于，一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，所述蛋白酶抑制剂为质量比1：1：1的磷酸缓冲液、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸。

[0068] 实施例8

[0069] 本实施例与实施例3的区别在于，一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，所述蛋白沉淀液和血液Ⅰ的体积比为2：1。

[0070] 实施例9

[0071] 本实施例与实施例3的区别在于，一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，所述蛋白沉淀液和血液Ⅱ的体积比为1：1。

[0072] 对比例1

[0073] 本对比例与实施例3区别在于，一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，未进行均质器裂解。

[0074] 对比例2

[0075] 本对比例与实施例3区别在于，一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，未添加磁珠进行旋涡振荡。

[0076] 对比例3

[0077] 本对比例与实施例3区别在于，一种快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，未进行微波震动。

[0078] 结果测定

[0079] 本发明对上述实施例1～9及对比例1～3所提取的石斑鱼线粒体基因组DNA浓度进行测定，结果如表1所示。

[0080]组别 DNA浓度(ng/μL)
实施例1 766.1
实施例2 762.5
实施例3 783.2
实施例4 773.1
实施例5 775.0
实施例6 758.3
实施例7 757.4
实施例8 742.9
实施例9 751.7
对比例1 563.8
对比例2 553.4
对比例3 542.0

[0081] 由上表可知，本发明的快速提取石斑鱼线粒体基因组DNA的方法，通过全血基因组优化提取方法，提取效率高，操作简单，时间短，通过均质器裂解，能够快速的将鱼类红细胞核基因组和蛋白质分离，有利于提取DNA，对比例1与实施例3相比，显然实施例3获取的DNA浓度较高；加入磁珠进行旋涡振荡，利用磁场的效应使磁性颗粒与溶液分离，提高DNA的纯度，对比例2未添加磁珠进行旋涡振荡所获得的DNA浓度明显不如实施例3；加入蛋白沉淀液经微波震动，能够使得蛋白质等杂质不被吸附留在溶液，进一步提高DNA片段的纯度，实施例3较对比例3的浓度高。

[0082] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。