一种降低镉积累并增加植物镉耐受的功能基因及应用

摘要

本发明涉及一种降低镉积累并增加植物镉耐受的功能基因及应用。所述降低镉积累并增加植物镉耐受的功能基因如序列表SEQ ID No：l所示。本发明将降低镉积累并增加植物镉耐受的功能基因转入植物中，使其在植物中过量表达，植物表现为耐镉。

权利要求

1.一种降低镉积累并增加植物镉耐受的功能基因的应用，其特征在于：将序列表SEQ ID No：l所示的降低镉积累并增加植物镉耐受的功能基因转入植物中，所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将所述序列表SEQ ID No：l所示的降低镉积累并增加植物镉耐受的功能基因的DNA序列通过浸花法转入野生型植株，使其在野生型中过量表达，植物表现为镉积累及耐受。

说明书

一种降低镉积累并增加植物镉耐受的功能基因及应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种植物耐镉相关的功能基因及利用该功能基因增强植物对镉毒害耐受的应用。

背景技术

[0002] 随着人类活动在地球上的增强，尤其是现代工业的发展，有毒重金属包括镉、铅、汞和类金属的砷等向生物圈中的排放不断加剧，由于不能被分解，只能以各种形式相互转化和分散，对人类和环境都造成了很大的毒害作用。其中镉作为重要的重金属污染物，主要来自冶炼、电镀、蓄电池等产业，是已知的最易在体内蓄积的IA级致癌物，镉的累积可导致多种病变。植物作为初级生产者，位于能量金字塔的基部，重金属的胁迫不仅影响初级生产者提供能量的能力，而且影响食物的安全品质，给人类身体健康、生产生活带来极为不利的影响，例如发生在日本的著名公害事件痛痛病就是由于当地居民食用镉米导致的；我国某些地区水稻、蔬菜等农作物镉含量严重超标，有的地区已经出现了镉污染所致慢性早期健2
康危害的个体。我国目前受镉、砷、铅等重金属污染的耕地面积近2000万hm ,约占耕地总面积的20%，其中工业“三废”污染耕地约1000万hm2，每年造成粮食减产达1000万t,重金属污染粮食达1200万t，合计农业损失至少在两百亿元以上。所以提高作物对重金属的耐受和降低对重金属的吸收已经成为关系民生的大事,已经成为农业生产和食品安全进一步研究的重点，倍受世界各国政治界和学术界的关注，也是当前生命科学研究的热点。

[0003] 拟南芥作为一种模式植物,被广泛应用于植物遗传学、作物生物学、发育生物学和分子生物学等研究领域。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到,有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究；拟南芥的基因组小，全基因组测序已完成，基因克隆非常简单；此外还具有结构简单、形体小、生长周期较短、繁殖系数高、生活力强、自花授粉和易于转化等特点，因此将拟南芥作为研究对象能够更快更好的达到实验预期目标，可以很大程度上缩短实验时间和简化实验条件。利用模式生物拟南芥研究植物抗重金属毒害分子生物学机制将对特定区域提高作物的产量和增加食品安全性具有十分重要的理论与经济意义。根据拟南芥测序数据库（www.arabidopsis.org）寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一，也是不同国家之间科技竞争的焦点。

发明内容

[0004] 面对日益严重的环境污染问题，寻找耐受重金属并且能降低作物中重金属含量的功能基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义，为此，本发明提供一种降低镉积累并增加植物镉耐受的功能基因，同时，提供所述功能基因在增强植物耐镉及降低植物中镉含量方面的应用。

[0005] 本发明所述的一种降低镉积累并增加植物镉耐受的功能基因的名称与基因编号来源于拟南芥测序数据库（www.arabidopsis.org），具体来源于哥伦比亚野生型的拟南芥，其DNA序列如序列表SEQ ID No：l所示。

[0006] 所述功能基因的DNA序列包括与序列表SEQ ID No：1 所示的DNA序列具有90%以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

[0007] 含有本发明ATL31的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增ATL31中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

[0008] 含有本发明ATL31的表达载体: 35S:ATL31过量表达载体，含有35S:ATL31过量表达载体的宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增ATL31的引物对：

[0009] 引物1：F 5' GCTCTAGATTTGGGACTCCAGAACTAATAATG3'，

[0010] 引物 2：R 5' CCCAAGCTTACAAAACATCACCGAACACT 3'也属于本发明的保护范围。

[0011] 本发明所述的功能基因在增强植物耐镉及降低植物中镉含量方面的应用，是使植物中的上述植物耐镉及降低植物中镉含量相关蛋白编码基因过量表达。

[0012] 本发明中携带有ATL31基因的表达载体通过大肠杆菌DH5ɑ转化、农杆菌GV3101介导的方法转化入植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

[0013] 本发明所述的功能基因在增强植物耐镉及降低植物中镉含量方面的应用，是利用基因工程技术构建35S:ATL31过量表达载体，通过浸花法转入野生型植株，使其在野生型中过量表达，植物表现为耐镉。

[0014] 浸花法的具体步骤为：将已确定的含有过表达载体的阳性农杆菌GV3101菌液接种于 5 ml 含有载体和农杆菌抗性（本实验室为壮观霉素和庆大霉素）的LB培养基中，28℃，2000rpm，振荡过夜,以1:50比例转接到200 ml LB培养基中，28℃，2000rpm培养至OD600=
1.2-1.6，4000rpm，离心15min，收集菌体后重悬于渗透缓冲液(1/2 MS培养基+5%蔗糖)配方，调节溶液OD600=0.8-1.0之间，加终浓度0.02-0.03% SilwettL-77，混匀； 将已授粉的野生型拟南芥花的果荚用消毒剪去除，倒置于装有渗透缓冲液的合适大小的容器上侵染
20s，使植株表面浸有一层水膜即可，盖上保鲜膜保湿；将整盆侵完后，植株避光培养24h后取下保鲜膜，于室温中继续培养。所收的第一代种子在含有卡那霉素抗性的½MS固体培养基上抗性筛选并鉴定阳性植株，阳性植株收种后继续繁殖并单株收种，进行纯合体鉴定，在基因表达水平上确定过表达植株的获得。

[0015] 被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如:水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。

[0016] 本发明的有益技术效果体现在以下方面：

[0017] 1.AtATL31，是拟南芥E3泛素化连接酶中RING结构域家族中的一员，申请人发现镉处理AtATL31基因过表达植株表现为对镉耐受，这表明该ATL31基因涉及镉耐受性的调控。为此，我们研究了该基因功能，进一步研究结果表明，AtATL31基因过表达植株体内镉含量与野生型植株相比较少，这说明基因AtATL31可以通过降低拟南芥对镉的吸收，导致拟南芥体内的镉含量下降，进而表现为对镉耐受。

[0018] 2.本发明的降低镉积累并增加植物镉耐受的功能基因可为农作物耐镉育种和降低农作物中的镉积累提供基因资源和技术支持。

附图说明

[0019] 图1为ATL31基因过表达载体构建图。

[0020] 图1中，（A）ATL31基因克隆；（B）35S: ATL31重组质粒转化的阳性菌落；（C）35S: ATL31重组质粒转化的阳性菌落PCR鉴定。

[0021] 图2为过表达植株的筛选及mRNA表达水平图。

[0022] 图2中，（A）转基因阳性植株筛选；（B）35S: ATL31过表达转基因株系的基因表达水平半定量分析；（C）35S: ATL31转基因阳性植株PCR鉴定（C中Marker分子量为2000bp）。

[0023] 图3为35S: ATL31过表达导致植株对Cd胁迫耐受性增加。

[0024] 35S: ATL31过表达植株与野生型植株在培养皿上垂直培养，将三种材料直接点种于½ MS培养基上，经春化三天后于16h光照、8h黑暗，22℃条件下培养三天，再分别转移至½ MS 、50 μM CdCl2、75 μM CdCl2的培养基上垂直培养2周的比较照片，其中½MS培养基为对照。

[0025] 图3中A为野生型和35S: ATL31过表达植株在正常情况、生长情况；B为野生型和35S: ATL31过表达植株在正常和50 μM CdCl2、75μM CdCl2下下根长。

[0026] 图4为野生型与35S: ATL31过表达植株根、茎中的镉含量比较。

[0027] 转基因植株35S:ATL31-过表达1、35S:ATL31-过表达2与野生型植株分别在含有50 μM CdCl2的½MS培养基上垂直生长2周后体内镉含量的比较。

具体实施方式

[0028] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

[0029] 实施例1、ATL31及其编码基因的获得

[0030] 根据公开的拟南芥测序数据库（www.arabidopsis.org），查询ATL31 (AT5G27420)，获得该基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：l所示，根据这一序列设计下文中cDNA全长扩增引物1、引物2。本实验室的具体实施方法为：以野生型哥伦比亚生态型拟南芥的幼苗约50-100mg为材料，用Trizol提取其总RNA，用紫外分光光度计检测RNA浓度。按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）试剂盒说明书，以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一条链。以提取出来的第一条链cDNA为模板，进行如下PCR反应：20μl反应体系，内含10×PCR缓冲液2 μl，dNTPs（10mM）混合物0.4 μl，引物1和引物2各2 μl，其中引物带有XbaⅠ和HindⅢ酶切位点以便于后期过量表达载体构建；Taq 酶(5U/μl) 0.2 μl，其余加双蒸水至20 μl。其中，

[0031] 引物1：F 5' GCTCTAGATTTGGGACTCCAGAACTAATAATG3'

[0032] 引物 2：R 5' CCCAAGCTTACAAAACATCACCGAACACT 3'。

[0033] 在基因扩增仪上扩增：先94℃预变性5 min，再94℃ 30 sec，58℃30 sec，72℃90 sec, 共计35个循环，最后72 ℃延伸 10 min，将获得的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，见图1A。进行测序鉴定, 结果表明PCR得到的cDNA片段具有序列表中序列SEQ ID No：1的DNA序列，为ATL31的cDNA 基因，由1107个碱基组成，其编码序列具有编码序列表中序列SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

[0034] 实施例2、培育耐镉及降低镉含量的拟南芥

[0035] 1、ATL31基因过量表达载体宿主菌的获得

[0036] 为进一步验证该基因在植物重金属镉胁迫调控中的功能，我们构建了ATL31基因过量表达载体（35S: ATL31）。将扩增获得的ATL31全长cDNA产物与载体pART27进行酶切(XbaⅠ和HindⅢ)、回收纯化，再将回收纯化好的目的DNA片段和pART27载体用T4 DNA连接酶连接过夜。将上述连接液转入DH5a中，见图1中B，检测筛选出阳性克隆，见图1中C。测序结果确定无误后，在含有壮观霉素的LB培养液中扩培并抽提质粒，得到含有目的片段的载体pART27-ATL31，然后利用电击转化法转入农杆菌GV3101。

[0037] 2、ATL31基因过量表达拟南芥株系的获得

[0038] 电击转化后的农杆菌GV3101，经活化后涂布于含双抗（Spec，Gen）的LB培养基平板。随机挑取单菌落，转移到含双抗（Spec，Gen）的LB培养基扩培，采用浸花法转化拟南芥野生型植株，所收的第一代种子在含有卡那霉素抗性的½MS固体培养基上抗性筛选并鉴定阳性植株，见图2中A和图2中C。阳性植株进行后续抗性分离鉴定出纯合体株系，将所鉴定的纯合体株系提取RNA反转后进行基因水平半定量分析，对相关基因表达水平进行测定，选取相对于野生型中ATL31表达量最高的两个株系进行繁殖，图2中B，从而获得ATL31基因过表达转基因株系35S:ATL31-过表达1、35S:ATL31-过表达2。

[0039] 3、35S:ATL31过表达转基因植株与野生型植株的耐镉性比较

[0040] 将野生型与35S:ATL31-过表达1、35S:ATL31-过表达2三种材料直接点种于½ MS培养基上，经春化三天后于16h光照、8h黑暗，22℃条件下垂直培养三天，再分别转移至½ MS 、50 μM CdCl2、75 μM CdCl2的培养基上垂直培养2周，两周后，可以观察到：在½MS培养基上生长的野生型和35S:ATL31-过表达1、35S:ATL31-过表达2在根长等方面均无显著差异。在植株移栽后在含有不同浓度镉的培养基上培养，35S:ATL31-过表达1、35S:ATL31-过表达2都表现出明显的镉耐受的性状，见图3中A。在50 μM CdCl2,75 μMCdCl2胁迫下，35S:ATL31-过表达1、35S:ATL31-过表达2的根长值明显比野生型高，见图3中B。上述结果表明，35S:
ATL31-过表达1、35S:ATL31-过表达2较野生型对镉毒害表现出明显耐受。

[0041] 4、ATL31过表达转基因植株与野生型植株中镉积累比较

[0042] 对在含有50μMCdCl2的½MS培养基上垂直生长2周后的野生型植株和35S:ATL31-过表达1、35S:ATL31-过表达2植株体内（分为根和茎）的镉含量进行测定，发现转基因植株体内镉含量明显低于野生型，见图4。表明转基因植株对镉积累明显低于野生型植株。