一种促进青蒿酸积累的方法

摘要

本发明提供了一种促进青蒿酸积累的方法，其通过向培养基中添加外援调控因子和较为便宜易得的植物油脂，并在可产青蒿酸的酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加镁盐和氨基酸，并对发酵温度及发酵溶氧进行阶段调控，从而在确保酿酒酵母工程菌中质粒稳定性的基础上，极大地促进了青蒿酸的积累，使青蒿酸发酵产量最高可以提高50％以上，且发酵周期也有效缩短，效果显著。本发明所提供的技术方案简单易行，进一步提高了青蒿酸的生产效率，易于青蒿酸的工业化生产应用。

权利要求

1.一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于：1）在发酵开始前，向酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加外源调控因子和植物油脂；2）在酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加镁盐和氨基酸；3）在酿酒酵母工程菌的整个发酵培养过程中，对发酵温度及发酵溶氧进行阶段调控；

其中，所述酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加的外源调控因子为异戊酸、异丁酸和2-甲基丁酸的一种或几种，所述外源调控因子添加使其在发酵培养基中的浓度为0.5-5 g/L；

所述酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加的植物油脂为豆油、玉米油、菜籽油和棉籽油的一种或几种，所述植物油脂的添加体积为发酵培养基初始体积的5-35%；

所述酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加的镁盐为硝酸镁和硫酸镁的一种或两种，所述镁盐的添加时间为发酵的第30-45h，所述镁盐的添加使其在发酵培养基中的浓度为2-10g/L；所述酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加的氨基酸为缬氨酸，所述氨基酸的添加时间为发酵的第30-45 h，所述氨基酸的添加使其在发酵培养基中的浓度为0.2-5 g/L；

所述酿酒酵母工程菌发酵过程中温度的调控为：发酵开始时，发酵温度为28-32℃，发酵第40-55 h后，发酵温度降至22-25℃，直至发酵结束；所述酿酒酵母工程菌发酵过程中溶氧的调控为：发酵开始时，发酵溶氧为30-50%，发酵第40-55 h后，发酵溶氧降至10-20%，直至发酵结束。

2.如权利要求1所述的一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于，所述植物油脂的添加时间为发酵开始前加入，添加方式为一次性添加。

3.如权利要求1所述的一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌发酵培养周期为65-75 h。

4.如权利要求1所述的一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌的发酵培养基为：葡萄糖15 -30 g/L；半乳糖 2-10 g/L；硫酸铵8-15 g/L；磷酸二氢钾5-8 g/L；七水硫酸镁2-5.2 g/L；维生素溶液8-12 ml/L；金属离子溶液6-10 ml/L；CuSO4 ·5H2O 

20-40 ug/L，其余为水，用含氨13-14.5 mol/L的水溶液调控pH至5.0-5.5。

5.如权利要求4所述的一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于，所述金属离子溶液成分为：ZnSO4·7H2O 5.75 g/L；MnCl2·4H2O 0.32 g/L；CoCl2·6H2O 0.47 g/L；NaMoO4·2H2O 

0.48 g/L；CaCl2·2H2O 2.9 g/L；FeSO4·7H2O 2.8 g/L；0.5 M EDTA 80 ml/L，其余为水。

6.如权利要求4所述的一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于，所述维生素溶液成分为：生物素0.05 g/L；泛酸钙1 g/L；烟酸 1 g/L；肌醇25 g/L；维生素B1 1 g/L；吡哆醛1 g/L；对氨基苯甲酸0.2 g/L，其余为水。

7.如权利要求1-6任一项所述的一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于，所述发酵培养过程中还包括流加碳源，所述流加碳源的时间为从发酵10-18 h开始，直至发酵结束，所述流加碳源为葡萄糖水溶液和乙醇水溶液中的一种或两种。

8.如权利要求6所述的一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于，所述葡萄糖水溶液的浓度为40%-70%，单位为g/L；所述乙醇水溶液的浓度为80%-99%，单位为L/L；所述流加碳源的速率为发酵培养基初始体积的0.2%-2%/每小时。

说明书

一种促进青蒿酸积累的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及工业微生物发酵技术领域，具体涉及一种促进青蒿酸积累的方法。

背景技术

[0002] 青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物，分子式为C15H22O5，由中国药学家屠呦呦在1971年发现。青蒿素是继乙氨嘧啶、氯喹、伯喹之后
最有效的抗疟特效药，尤其是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾，具有速效和低毒的特点，曾被世
界卫生组织称做是“世界上唯一有效的疟疾治疗药物”。其抗疟疾作用机理主要在于在治疗
疟疾的过程通过青蒿素活化产生自由基，自由基与疟原蛋白结合，作用于疟原虫的膜系结
构，使其泡膜、核膜以及质膜均遭到破坏，线粒体肿胀，内外膜脱落，从而对疟原虫的细胞结
构及其功能造成破坏。

[0003] 青蒿素自发现至今的近50年中，在治疗疟疾等相关疾病领域得以广泛使用，近些年，随着各国科学家的持续研究发现，青篙素在抗血吸虫、调节或抑制体液的免疫功能、提
高淋巴细胞的转化率，利胆，祛痰，镇咳，平喘等其他疾病的治疗中也显示出诱人的前景，同
时，据统计数据显示，每年全世界对于青蒿素及其衍生物的销售额便多达数十亿美元，因
此，青蒿素市场前景非常广阔。

[0004] 目前，青蒿素可通过三种方法获得，一种是传统的从青蒿植物中提取获得，该方法受到气候、地域的影响大，产量不稳定，导致青蒿素原料价格逐年波动较大；二是通过化学
全合成获得，此方法难度极大，反应过程复杂，反应条件苛刻，同时，反应成本高昂；第三种
方法是通过基因工程技术，借助微生物发酵培养获得青蒿酸，再将发酵获得的青蒿酸经化
学合成，最终获得青蒿素，该生物发酵加化学半合成的方法与植物提取和化学全合成相比
较而言，具有反应条件温和，产量高，生产稳定，易于工业化生产等优点。鉴于上述优点，通
过微生物发酵的方法得到青蒿酸，然后经过化学合成生产青蒿素的方法已被广泛接受并得
到推广应用，2013年，WHO也批准通过了该工艺生产的青蒿素应用于临床。

[0005] 微生物发酵加化学半合成制备青蒿素的方法中，青蒿酸的发酵成本、工艺可行性及发酵产量等因素是青蒿素能否高效、低成本获得的关键影响因素。青蒿酸的微生物发酵
方法开发始于2004年盖茨基金会的支持项目，国内外所采用的技术均是以此为基础发展而
来。现目前，通过基因工程手段构建的可产青蒿酸的酿酒酵母工程菌在发酵过程中，仍然存
在发酵成本偏高、发酵生产过程中用到大量有机溶剂等有毒有害物质，且发酵周期较长等
问题，最终导致生物合成青蒿素的成本仍然无法与通过植物提取方法获得的青蒿素相抗衡
而导致生物加化学半合成方法获得的青蒿素最终未能形成大规模的产业化生产与应用。文
章High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin
(CJ Paddon，PJ Westfall，DJ Pitera,et.al.Nature,2013,496(7446):528-532)中采用有
机溶剂肉豆蔻酸异丙酯(IPM)的大量添加，不利于成本的控制，且菌种遗传稳定性差，产量
不稳定，发酵周期较长，不利于工业化大规模生产。文章Production of amorphadiene in 
yeast,and its conversion to dihydroartemisinic acid,precursor to the 
antimalarial agent artemisinin(PJ Westfall,DJ  Pitera,JR  Lenihan,
et.al.Proceedings of the National Academy of Sciences.2012,109(3):E111-E118)
中描述一种通过对酿酒酵母工程菌基因改造的方式，实现紫穗槐-4,11-二烯的高产，最高
产量可达40g/L，但是，从紫穗槐-4,11-二烯到青蒿酸，再到青蒿素，中间依然需要多步化学
合成，且收率较低，因此，其实际工业化应用较差。专利CN101338309A公开了一种通过将
GYP71AV1 P450基因和P450还原酶CPR基因导入酿酒酵母细胞来获得青蒿酸基因工程菌从
而生产青蒿酸的方法，该方法对青蒿酸发酵产量的工艺优化及产量描述较少；专利
CN105316372A公开了一种发酵生产青蒿酸的方法，其通过向发酵液中大量添加正己烷、正
庚烷、甲苯、二甲苯或间二甲苯等有机溶剂，实现发酵液中青蒿酸的萃取，从而提高青蒿酸
的产量，但是，该技术中所用的正己烷或正庚烷等有机试剂具有沸点低，易挥发的缺点，甲
苯或二甲苯等有机试剂则有强烈的致癌性，因此，实际发酵生产可操作性差，且不符合环境
友好型和可持续性发展的理念。

[0006] 我公司在为了克服青蒿酸发酵技术中存在的菌种性状不稳定而导致批次间发酵产量波动较大，发酵过程中半乳糖和有机溶剂的大量添加导致青蒿酸发酵成本居高不下、
且由于大量有机溶剂的使用也不利于环境保护，难以实现清洁绿色可持续化生产等缺点，
因此，我们开发了一种提高青蒿酸发酵产量的方法，具体公开在CN108611383A,该方法具备
菌种遗传稳定性高、彻底摒弃了有毒有害有机溶剂的使用、通过乳糖水解有效降低了发酵
成本、且发酵产量提高明显等优势，但该技术仍然存在发酵周期较长、乳糖水解工艺复杂、
培养基中依旧添加有机溶剂、发酵成本依然较高等问题。

发明内容

[0007] 针对青蒿酸发酵现有技术中存在的发酵工艺复杂、生产成本高、发酵周期长，以及发酵过程中添加有机溶剂等缺点，本发明提供了一种促进青蒿酸积累的方法。

[0008] 一种促进青蒿酸积累的方法，包括以下步骤：

[0009] 1)在发酵开始前，向酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加外援调控因子和植物油脂；

[0010] 2)在酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加镁盐和氨基酸；

[0011] 3)在酿酒酵母工程菌的整个发酵培养过程中，对发酵温度及发酵溶氧进行阶段调控。

[0012] 在优选的实施方案中，所述向酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加的外援调控因子为异戊酸、异丁酸和2-甲基丁酸的一种或几种，所述外援调控因子的添加使其在发酵培养
基的浓度为0.5-5g/L。

[0013] 在优选的实施方案中，所述酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加的植物油脂为豆油、玉米油、菜籽油和棉籽油的一种或几种，更优选的，所述植物油脂的添加体积为发酵培
养基初始体积的5-35％。

[0014] 在优选的实施方案中，所述植物油脂的添加时间为发酵开始前加入，添加方式为一次性添加。

[0015] 在优选的实施方案中，所述酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加的镁盐为硝酸镁、硫酸镁中的一种或两种，更优选的，所述镁盐的添加时间为发酵的第30-
45h，所述镁盐的添加使其在发酵培养基中的浓度为2-10g/L。

[0016] 在优选的实施方案中，所述酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加的氨基酸为缬氨酸，更优选的，所述氨基酸的添加时间为发酵的第30-45h，所述氨基酸的添加
使其在发酵培养基中的浓度为0.2-5g/L。

[0017] 在优选的实施方案中，所述发酵过程中温度的调控为：发酵开始时，发酵温度为28-32℃，发酵第40-55h后，发酵温度降至22-25℃，直至发酵结束。

[0018] 在优选的实施方案中，所述发酵过程中溶氧的调控为：发酵开始时，发酵溶氧为30-50％，发酵第40-55h后，发酵溶氧降至10-20％，直至发酵结束。

[0019] 在优选的实施方案中，所述酿酒酵母工程菌发酵周期为65-75h。

[0020] 在优选的实施方案中，所述酿酒酵母工程菌的发酵培养基为：葡萄糖15-30g/L；半乳糖2-10g/L；硫酸铵8-15g/L；磷酸二氢钾5-8g/L；七水硫酸镁2-5.2g/L；维生素溶液8-
12ml/L；金属离子溶液6-10ml/L；CuSO4·5H2O 20-40ug/L，其余为水，用含氨13-14.5mol/L
的水溶液调控pH至5.0-5.5。

[0021] 其中，所述金属离子溶液成分为：ZnSO4·7H2O 5.75g/L；MnCl2·4H2O 0.32g/L；CoCl2·6H2O 0.47g/L；NaMoO4·2H2O 0.48g/L；CaCl2·2H2O 2.9g/L；FeSO4·7H2O 2.8g/L；
0.5M EDTA 80ml/L，其余为水。

[0022] 其中，所述维生素溶液成分为：生物素0.05g/L；泛酸钙1g/L；烟酸1g/L；肌醇25g/L；维生素B1 1g/L；吡哆醛1g/L；对氨基苯甲酸0.2g/L，其余为水。

[0023] 在优选的实施方案中，所述发酵培养过程中还包括流加碳源，所述流加碳源的时间为从发酵10-18h开始，直至发酵结束，所述流加碳源为葡萄糖水溶液和乙醇水溶液中的
一种或两种。

[0024] 在进一步优选的实施方案中，所述葡萄糖水溶液的浓度为40％-70％(单位为g/L)，所述乙醇水溶液的浓度为80％-99％(单位为L/L)；所述流加碳源的速率为发酵培养基
初始体积的0.2％-2％/每小时。

[0025] 按照本发明发酵工艺，极大增加了酿酒酵母工程菌体内质粒的稳定性，也显著缩短了发酵周期，且明显促进了青蒿酸的积累，使青蒿酸的产量提高近50％以上，且廉价植物
油脂的使用，取代了有机溶剂的使用，在降低成本的同时，也避免了有毒有害试剂的使用，
本发明的发酵工艺技术绿色环保，便于工业化应用。

[0026] 本发明中青蒿酸的发酵工艺较现有技术中青蒿酸的生产工艺的优势，主要体现在以下几个方面：

[0027] (1)本发明通过添加外援调控因子异戊酸、异丁酸、2-甲基丁酸和缬氨酸，显著提高了青蒿酸发酵产量，最高可提高50％以上。

[0028] (2)本发明通过廉价植物油脂的使用，彻底摒弃各种有机溶剂的添加，在显著降低发酵成本的同时，也引领了技术的升级，使整个发酵过程绿色环保，从源头解决了工艺可能
对产品及环境带来的污染。

[0029] (3)本发明在发酵过程中，通过对发酵温度、发酵溶氧的分阶段调控，以及向培养基中添加镁盐，保证了酿酒酵母工程菌中质粒的稳定性，进而保证了青蒿酸的稳定高产。

[0030] (4)同时，外援调控因子的添加、廉价植物油脂的使用以及对发酵温度、发酵溶氧等的联合调控，也有效缩短了酿酒酵母工程菌的发酵周期，显著提高了生产效率，进而降低
了青蒿酸的发酵成本。

具体实施方式

[0031] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通
技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。

[0032] 本发明所用菌种为任意可产青蒿酸的酿酒酵母工程菌，可商购或在实验室自行构建，例如以购买自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)保藏号CCTCC AY 92011的酿酒酵母
菌为出发菌株，利用基因工程手段构建甲戊二羟酸途径(MVA)基因、ADH1(青蒿醇脱氢酶基
因)和ALDH1(青蒿醛脱氢酶基因)，过表达tHMGR和ERG20基因增加了酵母体内半萜类物质共
同前体法尼基焦磷酸FPP的积累量，并通过过表达酿酒酵母MVA路径基因和ADS基因，抑制鲨
烯合酶表达，实现青蒿二烯的大量合成，进一步的，导入外源基因CYP71AV1(细胞色素P450
酶基因)，从而实现青蒿酸的合成，具体菌种构建方法可参照文献Ro D K,Paradise E M,
Ouellet M,et al.Production of the antimalarial drug precursor artemisinic 
acid in engineered yeast[J].Nature,2006,440(7086):940-943和Paddon CJ,Westfall 
PJ,Pitera DJ,et al.High-level semi-synthetic production of the potent 
antimalarial artemisinin[J].Nature,2013,496(7446)：528-532中的Methods部分描述
的详细方法或公告号为CN101338309B的中国专利公开的可以生产青蒿酸的酿酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)，优选生物保藏号为CGMCC NO.1861的酿酒酵母。

[0033] 本发明实施例中用到的菌种为购买自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)保藏号CCTCC AY 92011的酿酒酵母菌为出发菌株，通过利用基因工程手段构建的可发酵产青蒿
酸的酿酒酵母工程菌，具体菌种构建方法参照文献Ro D K,Paradise E M,Ouellet M,et 
al.Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in 
engineered yeast[J].Nature,2006,440(7086):940-943和Paddon CJ,Westfall PJ,
Pitera DJ,et al.High-level semi-synthetic production of the potent 
antimalarial artemisinin[J].Nature,2013,496(7446)：528-532中的Methods部分描述
的详细方法。

[0034] 除特别说明外，本发明实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域种常用的材料和试剂，均可以通过常规的商业途径获得。

[0035] 本发明青蒿素效价检测所用的液相检测方法条件如下：色谱柱：Diamonsil C18(250mm×460mm,5μm)，流动相：乙腈:0.2％(质量体积比，单位为g/L)磷酸水溶液＝65:35
(v/v)，梯度洗脱，保留时间：25min，流速：1mL/min，进样量：10μL，检测波长：212nm，柱温：
(30±1)℃。

[0036] 本发明实施例中所用的种子培养基为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO4 15g/L，KH2PO4 8g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/
L，琥珀酸缓冲液(0.5M，pH 5.0)100ml/L，其余为水，PH＝5.0。

[0037] 本发明实施例中种子培养基、平板固体培养基与发酵培养基中用到的维生素溶液与金属离子溶液具体配方如下：

[0038] 维生素溶液为：生物素0.05g/L；泛酸钙1g/L；烟酸1g/L；肌醇25g/L；维生素B1 1g/L；吡哆醛1g/L；对氨基苯甲酸0.2g/L，其余为水。

[0039] 金属离子溶液为：ZnSO4·7H2O 5.75g/L；MnCl2·4H2O 0.32g/L；CoCl2·6H2O 0.47g/L；NaMoO4·2H2O 0.48g/L；CaCl2·2H2O 2.9g/L；FeSO4·7H2O 2.8g/L；0.5M EDTA 
80ml/L，其余为水。

[0040] 实施例1：

[0041] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0042] (2)菌种的筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0043] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0044] (3)种子培养：从平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0045] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(V/V)的接种量接种至发酵培养基中；

[0046] 发酵培养基的配方为：葡萄糖25g/L；半乳糖10g/L；硫酸铵10g/L；磷酸二氢钾6g/L；七水硫酸镁5g/L；维生素溶液10ml/L；金属离子溶液8ml/L；CuSO4·5H2O 30ug/L，其余为
水。

[0047] 发酵开始前，发酵培养基中额外添加异戊酸，使其在发酵培养基中的浓度为0.5g/L；添加玉米油的体积为发酵培养基初始体积的5％(V/V)。

[0048] 发酵过程中，用含氨14mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。

[0049] 发酵第30h时，向发酵培养基中添加硝酸镁和缬氨酸，使其在发酵培养基中的浓度分别为2g/L和0.2g/L。同时，在发酵前40h，发酵温度设定为28℃，溶氧设定为30％，发酵第
40h直至发酵结束，发酵温度则设定为22℃，溶氧设定为10％。

[0050] 另，从发酵培养15h开始直至发酵结束，持续性流加70％(单位为g/L)葡萄糖水溶液，每小时的流加量为发酵液初始体积的2％，发酵培养75h后，结束发酵，获得含青蒿酸的
发酵液。

[0051] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为33.7g/L。

[0052] 对比实施例1：

[0053] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0054] (2)菌种的筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0055] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0056] (3)种子培养：从平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0057] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(V/V)的接种量接种至不添加外源因子的发酵培养基中；

[0058] 发酵培养基的配方为：葡萄糖25g/L；半乳糖10g/L；硫酸铵10g/L；磷酸二氢钾6g/L；七水硫酸镁5g/L；维生素溶液10ml/L；金属离子溶液8ml/L；CuSO4·5H2O 30ug/L，其余为
水。发酵开始前，向培养基中添加肉豆蔻酸异丙酯5％。

[0059] 发酵过程中，用含氨14mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。发酵过程中，发酵温度设定为28℃，溶氧设定为30％。

[0060] 从发酵培养15h开始直至发酵结束，持续性流加70％(单位为g/L)葡萄糖水溶液，每小时的流加量为发酵液初始体积的2％，发酵培养120h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发
酵液。

[0061] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为21.5g/L。

[0062] 表1实施例1和对比例1结果对比

[0063]

[0064] 通过对比可知，发酵开始前外援调控因子的添加、玉米油的添加，及发酵过程中硝酸镁和缬氨酸的添加，再加上发酵过程中对温度和溶氧的阶段调控等发酵技术的应用，促
使青蒿酸发酵产量比对照组高出56.74％，青蒿酸发酵产量提高显著，同时，发酵周期也由
120h缩短至75h，周期缩短也较为显著，进而发酵成本得到有效降低。

[0065] 实施例2：

[0066] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0067] (2)菌种的筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0068] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0069] (3)种子培养：从平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0070] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(V/V)的接种量接种至发酵培养基中；

[0071] 发酵培养基为：葡萄糖15g/L；半乳糖2g/L；硫酸铵8g/L；磷酸二氢钾5g/L；七水硫酸镁2g/L；维生素溶液8ml/L；金属离子溶液6ml/L；CuSO4·5H2O 20ug/L，其余为水。

[0072] 发酵开始前，发酵培养基中额外添加异戊酸、异丁酸和2-甲基丁酸，使其在发酵培养基中的浓度各为1g/L；分别添加豆油、玉米油和菜籽油，使其添加体积均为发酵培养基初
始体积的10％(V/V)。

[0073] 发酵过程中，用含氨14.5mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。

[0074] 发酵第45h时，向发酵培养基中添加硝酸镁和硫酸镁，使其在培养基中的浓度各为5g/L，以及添加缬氨酸，使其在发酵培养基中的浓度为5g/L。同时，在发酵前55h，发酵温度
设定为32℃，溶氧设定为50％，发酵第55h直至发酵结束，发酵温度则设定为25℃，溶氧设定
为20％。

[0075] 另，从发酵培养10h开始直至发酵结束，持续性流加40％(单位为g/L)葡萄糖水溶液和80％(单位为L/L)的乙醇水溶液，每小时的流加量分别为发酵液初始体积的1％，发酵
培养70h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。

[0076] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为45.1g/L。

[0077] 对比实施例2：

[0078] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0079] (2)菌种的筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0080] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0081] (3)种子培养：从平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0082] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(V/V)的接种量接种至不添加外源因子的发酵培养基中；

[0083] 发酵培养基为：葡萄糖15g/L；半乳糖2g/L；硫酸铵8g/L；磷酸二氢钾5g/L；七水硫酸镁2g/L；维生素溶液8ml/L；金属离子溶液6ml/L；CuSO4·5H2O20ug/L，其余为水。

[0084] 发酵开始前，发酵培养基中额外添加肉豆蔻酸异丙酯30％(V/V)，发酵过程中，用含氨14mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。发酵过程中，发酵温
度设定为32℃，溶氧设定为50％。

[0085] 另，从发酵培养10h开始直至发酵结束，持续性流加40％(单位为g/L)葡萄糖水溶液和80％(单位为g/L)的乙醇水溶液，每小时的流加量分别为发酵液初始体积的1％，发酵
培养100h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。

[0086] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为26.3g/L。

[0087] 表2实施例2和对比例2结果对比

[0088]

[0089] 通过对比可知，发酵开始前外援调控因子的添加、植物油的添加，及发酵过程中镁盐和缬氨酸的添加，再加上发酵过程中对温度和溶氧的阶段调控等发酵技术的应用，发酵
周期由100h缩短至70h的基础上，青蒿酸发酵产量比对照组高出71.48％，青蒿酸发酵产量
提高显著的同时，周期缩短也较为显著，进而发酵成本得到有效降低。

[0090] 实施例3：

[0091] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0092] (2)菌种的筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0093] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0094] (3)种子培养：从平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0095] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(V/V)的接种量接种至发酵培养基中；

[0096] 发酵培养基为：葡萄糖30g/L；半乳糖5g/L；硫酸铵15g/L；磷酸二氢钾8g/L；七水硫酸镁5.2g/L；维生素溶液12ml/L；金属离子溶液10ml/L；CuSO4·5H2O 40ug/L，其余为水。

[0097] 发酵开始前，发酵培养基中额外添加异丁酸，使其在发酵培养基中的浓度为5g/L；添加棉籽油的体积为发酵培养基初始体积的35％(V/V)。

[0098] 发酵过程中，用含氨13mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。

[0099] 发酵第35h时，向发酵培养基中添加硫酸镁，使其在发酵培养基中的浓度为10g/L，以及添加缬氨酸，使其在发酵培养基中的浓度为1g/L。同时，在发酵前45h，发酵温度设定为
30℃，溶氧设定为30％，发酵第45h直至发酵结束，发酵温度则设定为22℃，溶氧设定为
20％。

[0100] 另，从发酵培养18h开始直至发酵结束，持续性流加60％(单位为g/L)葡萄糖水溶液和90％(单位为L/L)的乙醇水溶液，每小时的流加量分别为发酵液初始体积的0.5％，发
酵培养65h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。

[0101] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为44.7g/L。

[0102] 对比实施例3：

[0103] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0104] (2)菌种的筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0105] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0106] (3)种子培养：从平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0107] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(V/V)的接种量接种至不添加外源因子的发酵培养基中；

[0108] 发酵培养基为：葡萄糖30g/L；半乳糖5g/L；硫酸铵15g/L；磷酸二氢钾8g/L；七水硫酸镁5.2g/L；维生素溶液12ml/L；金属离子溶液10ml/L；CuSO4·5H2O 40ug/L，其余为水。

[0109] 发酵开始前，发酵培养基中额外添加棕榈酸异丙酯35％(V/V)，发酵过程中，用含氨13mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。发酵过程中，发酵温度
设定为30℃，溶氧设定为30％。

[0110] 从发酵培养18h开始直至发酵结束，持续性流加60％(单位为g/L)葡萄糖水溶液和90％(单位为L/L)的乙醇水溶液，每小时的流加量分别为发酵液初始体积的0.5％，发酵培
养95h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。

[0111] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为20.8g/L。

[0112] 表3实施例3和对比例3结果对比

[0113]

[0114] 通过对比可知，发酵开始前外援调控因子的添加、植物油的添加，及发酵过程中镁盐和缬氨酸的添加，再加上发酵过程中对温度和溶氧的阶段调控等发酵技术的应用，发酵
周期由95h缩短至65h的基础上，青蒿酸发酵产量比对照组高出114.9％，青蒿酸发酵产量提
高显著的同时，周期缩短也较为显著，进而发酵成本得到有效降低。

[0115] 实施例4：

[0116] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0117] (2)菌种的筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0118] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0119] (3)种子培养：从平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0120] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(V/V)的接种量接种至发酵培养基中；

[0121] 发酵培养基为：葡萄糖20g/L；半乳糖3g/L；硫酸铵9g/L；磷酸二氢钾7g/L；七水硫酸镁4g/L；维生素溶液9ml/L；金属离子溶液7ml/L；CuSO4·5H2O25ug/L，其余为水。

[0122] 发酵开始前，发酵培养基中额外添加2-甲基丁酸，使其在发酵培养基中的浓度为3g/L；分别添加豆油、玉米油、菜籽油和棉籽油，使其添加体积均为发酵培养基初始体积的
7％(V/V)。

[0123] 发酵过程中，用含氨13.5mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。

[0124] 发酵第40h时，向发酵培养基中添加硝酸镁，使其在发酵培养基中的浓度为8g/L，以及添加缬氨酸，使其在发酵培养基中的浓度为3g/L。同时，在发酵前50h，发酵温度设定为
32℃，溶氧设定为50％，发酵第50h直至发酵结束，发酵温度则设定为22℃，溶氧设定为
10％。

[0125] 另，从发酵培养15h开始直至发酵结束，持续性流加99％(单位为L/L)的乙醇水溶液，每小时的流加量为发酵液初始体积的0.2％，发酵培养68h后，结束发酵，获得含青蒿酸
的发酵液。

[0126] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为47.4g/L。

[0127] 对比实施例4：

[0128] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0129] (2)菌种的筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0130] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0131] (3)种子培养：从平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0132] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(V/V)的接种量接种至不添加外援调控因子的发酵培养基中；

[0133] 发酵培养基为：葡萄糖20g/L；半乳糖3g/L；硫酸铵9g/L；磷酸二氢钾7g/L；七水硫酸镁4g/L；维生素溶液9ml/L；金属离子溶液7ml/L；CuSO4·5H2O 25ug/L，其余为水。

[0134] 发酵开始前，发酵培养基中额外添加棕榈酸异丙酯28％(V/V)，发酵过程中，用含氨13.5mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。发酵过程中，发酵温
度设定为32℃，溶氧设定为50％。

[0135] 从发酵培养15h开始直至发酵结束，持续性流加99％(单位为L/L)的乙醇水溶液，每小时的流加量为发酵液初始体积的0.2％，发酵培养108h后，结束发酵，获得含青蒿酸的
发酵液。

[0136] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为29.3g/L。

[0137] 表4实施例4和对比例4结果对比

[0138]

[0139] 通过对比可知，发酵开始前外援调控因子的添加、植物油的添加，及发酵过程中镁盐和缬氨酸的添加，再加上发酵过程中对温度和溶氧的阶段调控等发酵技术的应用，发酵
周期由108h缩短至68h的基础上，青蒿酸发酵产量比对照组高出61.77％，青蒿酸发酵产量
提高显著的同时，周期缩短也较为显著，进而发酵成本得到有效降低。

[0140] 实施例5：

[0141] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0142] (2)菌种的筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0143] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0144] (3)种子培养：从平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0145] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(V/V)的接种量接种至发酵培养基中；

[0146] 发酵培养基为：葡萄糖18g/L；半乳糖6g/L；硫酸铵12g/L；磷酸二氢钾5g/L；七水硫酸镁3g/L；维生素溶液11ml/L；金属离子溶液9ml/L；CuSO4·5H2O 35ug/L，其余为水。

[0147] 发酵开始前，发酵培养基中额外添加异丁酸和2-甲基丁酸，使其在发酵培养基中的浓度各为2.5g/L；添加菜籽油，添加体积为发酵培养基初始体积的30％(V/V)。

[0148] 发酵过程中，用含氨14mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。

[0149] 发酵第38h时，向发酵培养基中添加硝酸镁和硫酸镁，使其在发酵培养基中的浓度各为4g/L，以及添加缬氨酸，使其在发酵培养基中的浓度为4g/L。同时，在发酵前55h，发酵
温度设定为28℃，溶氧设定为40％，发酵第55h直至发酵结束，发酵温度则设定为23℃，溶氧
设定为20％。

[0150] 另，从发酵培养14h开始直至发酵结束，持续性流加70％(单位为g/L)葡萄糖水溶液和80％(单位为L/L)的乙醇水溶液，每小时的流加量分别为发酵液初始体积的0.8％，发
酵培养72h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。

[0151] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为43.5g/L。

[0152] 对比实施例5：

[0153] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0154] (2)菌种的筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0155] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0156] (3)种子培养：从平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0157] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(V/V)的接种量接种至不添加外援调控因子的发酵培养基中；

[0158] 发酵培养基为：葡萄糖18g/L；半乳糖6g/L；硫酸铵12g/L；磷酸二氢钾5g/L；七水硫酸镁3g/L；维生素溶液11ml/L；金属离子溶液9ml/L；CuSO4·5H2O35ug/L，其余为水。

[0159] 发酵开始前，发酵培养基中额外添加十二烷酸30％(V/V)，发酵过程中，用含氨14mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。发酵过程中，发酵温度设
定为28℃，溶氧设定为40％。

[0160] 从发酵培养14h开始直至发酵结束，持续性流加70％(单位为g/L)葡萄糖水溶液和80％(单位为L/L)的乙醇水溶液，每小时的流加量分别为发酵液初始体积的0.8％，发酵培
养100h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。

[0161] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为28.2g/L。

[0162] 表5实施例5和对比例5结果对比

[0163]

[0164] 通过对比可知，发酵开始前外援调控因子的添加、植物油的添加，及发酵过程中镁盐和缬氨酸的添加，再加上发酵过程中对温度和溶氧的阶段调控等发酵技术的应用，发酵
周期由100h缩短至72h的基础上，青蒿酸发酵产量比对照组高出54.25％，青蒿酸发酵产量
提高显著的同时，周期缩短也较为显著，进而发酵成本得到有效降低。

[0165] 实施例6：

[0166] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0167] (2)菌种的筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0168] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0169] (3)种子培养：从平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0170] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(V/V)的接种量接种至发酵培养基中；

[0171] 发酵培养基为：葡萄糖28g/L；半乳糖8g/L；硫酸铵13g/L；磷酸二氢钾6g/L；七水硫酸镁2.5g/L；维生素溶液10ml/L；金属离子溶液10ml/L；CuSO4·5H2O 40ug/L，其余为水。

[0172] 发酵开始前，发酵培养基中额外添加异戊酸和2-甲基丁酸，使其在发酵培养基中的浓度各为1.5g/L；添加豆油，添加体积为发酵培养基初始体积的25％(V/V)。

[0173] 发酵过程中，用含氨13.5mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。

[0174] 发酵第40h时，向发酵培养基中添加硫酸镁，使其在发酵培养基的浓度为8g/L，以及添加缬氨酸，使其在发酵培养基中的浓度为3.5g/L。同时，在发酵前48h，发酵温度设定为
29℃，溶氧设定为40％，发酵第48h直至发酵结束，发酵温度则设定为24℃，溶氧设定为
10％。

[0175] 另，从发酵培养16h开始直至发酵结束，持续性流加50％(单位为g/L)葡萄糖水溶液和95％(单位为L/L)的乙醇水溶液，每小时的流加量分别为发酵液初始体积的1％，发酵
培养74h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。

[0176] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为46.6g/L。

[0177] 对比实施例6：

[0178] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0179] (2)菌种的筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0180] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0181] (3)种子培养：从平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0182] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％(V/V)的接种量接种至不添加外援调控因子的发酵培养基中；

[0183] 发酵培养基为：葡萄糖28g/L；半乳糖8g/L；硫酸铵13g/L；磷酸二氢钾6g/L；七水硫酸镁2.5g/L；维生素溶液10ml/L；金属离子溶液10ml/L；CuSO4·5H2O 40ug/L，其余为水。

[0184] 发酵开始前，发酵培养基中额外添加十二烷酸25％(V/V)，发酵过程中，用含氨13.5mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。发酵过程中，发酵温度
设定为29℃，溶氧设定为40％。

[0185] 从发酵培养16h开始直至发酵结束，持续性流加50％(单位为g/L)葡萄糖水溶液和95％(单位为L/L)的乙醇水溶液，每小时的流加量分别为发酵液初始体积的1％，发酵培养
96h后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。

[0186] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为22.8g/L。

[0187] 对比实施例7：

[0188] (1)菌种的活化：将-80℃冻存的酿酒酵母工程菌菌种按接种量0.5％(V/V)接种到种子培养基中，培养16h，得菌种液；

[0189] (2)菌种的抗性筛选：将步骤(1)中所得的菌种液稀释10-7倍后，吸取100μL涂至含有200μL潮霉素B的平板固体培养基上，培养40h，得单菌落；

[0190] 平板固体培养基配方为：葡萄糖19.5g/L，(NH4)2SO415g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O 6.2g/L，维生素溶液12ml/L，金属离子溶液10ml/L，CuSO4·5H2O 40ug/L，琥珀酸缓冲
液100ml/L(0.5M，pH 5.0)，琼脂20g/L，其余为水。

[0191] (3)种子培养：从含有抗生素的平板固体培养基上挑取单菌落，并接种至种子培养基中，培养24h得种子液；

[0192] (4)发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液按照10％的接种量接种至含有甲羟戊酸和柠檬醛的发酵培养基中培养，其中甲羟戊酸和柠檬醛在培养基中的浓度各为0.1g/L；

[0193] 发酵培养基的配方为：乳糖水解液(取1200g乳糖溶解于2L水中，12g解于半乳糖苷酶在pH为4.0，53℃水解4h，水解率在93％，将所有的乳糖水解液混入发酵培养基中，并定容
至20L，使乳糖水解液中葡萄糖和半乳糖与发酵培养基的质量体积比分别为28:1(g/L))；硫
酸铵10g/L；磷酸二氢钾6g/L；七水硫酸镁5g/L；维生素溶液10ml/L；金属离子溶液8ml/L；
CuSO4·5H2O 30ug/L，其余为水。

[0194] 发酵过程中，用含氨14mol/L的水溶液调控pH，使其发酵过程中pH维持在5.0-5.5之间。发酵过程中，发酵温度设定为29℃，溶氧设定为40％。

[0195] 从发酵培养15h开始直至发酵结束，持续性流加70％(单位为g/L)蔗糖水溶液，每小时的流加量为发酵液初始体积的2％，从发酵培养40h开始直至发酵结束，持续性流加
30％(单位为g/L)谷氨酸钠水溶液，每小时的流加量为发酵液初始体积的0.2％，发酵培养
52h后，一次性补加棕榈酸异丙酯和油酸，补加量为发酵液初始体积的15％；发酵培养74h
后，结束发酵，获得含青蒿酸的发酵液。

[0196] (5)效价检测：用9.5ml甲醇萃取0.5ml含有青蒿酸的发酵液，超声震荡30min后，过滤，经HPLC检测得青蒿酸发酵产量为29.6g/L。

[0197] 表6实施例6和对比例6结果对比

[0198]

[0199] 通过实施例6和对比实施例6可知，发酵开始前外援调控因子的添加、植物油的添加，及发酵过程中镁盐和缬氨酸的添加，再加上发酵过程中对温度和溶氧的阶段调控等发
酵技术的应用，发酵周期由96h缩短至74h的基础上，青蒿酸发酵产量比对照组高出
104.38％，青蒿酸发酵产量提高显著的同时，周期缩短也较为显著，进而发酵成本得到有效
降低。

[0200] 对比实施例7为CN108611383A中所述方法的实施例，通过与本发明中的实施例6相比，在相同的发酵时间74h前提下，本发明所述的方法最终获得的青蒿酸产量为46.6g/L，而
CN108611383A所述的方法在相同的发酵条件下，最终青蒿酸产量仅29.6g/L，因此，本发明
专利对青蒿酸效价提升明显。