利用生物传感器检测土壤中可提取态四环素类抗生素的试纸条及方法

摘要

本发明公开的是一种利用生物传感器检测土壤中可提取态四环素类抗生素的试纸条及方法。该试纸条包括滤纸条、固定液、敏化剂以及四环素生物传感器细菌菌剂，所述试纸由市场购买的普通滤纸裁剪组成，所述四环素生物传感器细菌菌剂为Escherichia coli BL21菌株携带pMTLacZ质粒(即Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌株)。pMTLacZ质粒为本发明人自主设计的可受多种四环素类抗生素诱导标的合成质粒，pMTLacZ质粒可在不同浓度的四环素的诱导下产生不同量的β半乳糖苷酶，可降解试纸条上固定的X‑gal显色剂，直观显示样品中四环素类抗生素的浓度。用本发明试纸条同时检测土壤中可提取态六种四环素类药物的方法简便、快速、直观、准确、便于携带、环保、适用范围广、成本低、易推广使用。

权利要求

1.一种利用生物传感器检测土壤中可提取态四环素类抗生素的试纸条，其特征在于，包括：滤纸条、固定液、敏化剂以及四环素生物传感器细菌菌剂；所述四环素生物传感器细菌菌剂为Escherichia coliBL21/pMTLacZ菌株；所述固定液和敏化剂包裹Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌株固定负载在所述滤纸条上，所述Escherichia coliBL21/pMTLacZ菌株的制备方法为：(1)用PCR法从质粒pMTmCherry中克隆到Staphylococcus rostri RST11:Tn916和转座子Tn10上的四环素介导调控系统的pMT片段的基因序列；

所述pMT引物的正向引物序列和反向引物序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示：SEQ ID No.1：TCGTGCCAGCTGCATTAAT；

SEQ ID No.2：TTCACTTTTCTCTATCACTGATAGG；

(2)将利用PCR法从pCU19质粒上克隆LacZ368bp报告基因片段的基因序列，从质粒pMTmCherry中克隆到T7片段220bp的基因序列，结合融合LacZ和T7终止子序列得到LacZ-T7融合片段568bp；

所述LacZ引物的正向引物序列和反向引物序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示，SEQ ID No.3：CTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAATGACCATGATTACGCCAAGCSEQ ID No.4：GTGGCAGCAGCCTAGGTTAACTATGCGGCATCAGAGCAG；

所述T7引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，SEQ ID No.5：TTAACCTAGGCTGCTGCCSEQ ID No.6：TCATTAATGCAGCTGGCACGATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC；

融合LacZ-T7所用引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，SEQ ID No.7：CTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAASEQ ID No.8：TCATTAATGCAGCTGGCAC；

(3)将所述的LacZ-T7和pMT通过同源重组酶连接，得到目的DNA；取Escherichia coli BL21感受态细胞加入所述目的DNA中，加入不含抗生素的无菌LB培养基，混匀、复苏；吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含Amp抗生素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；

(4)在培养基上挑点，使用无菌的10μL移液枪头在含氨苄青霉素抗生素的LB培养基和含氨苄青霉素、20mg/L X-gal和四环素抗生素的LB培养基上分别画线，筛选可以在两个培养基上生长，并在含氨苄青霉素、20mg/L X-gal和四环素抗生素的LB培养基上长出蓝色斑点的菌株，使用引物PCR鉴定重组后的质粒，验证质粒的核心片段为3590bp；

鉴定所用引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，SEQ ID No.9：ACTGTCAATTTGATAGCGGGSEQ ID No.10：ATTAATGCAGCTGGCACGA；

并测序验证所得含重组质粒菌种Escherichia coli BL21/pMTLacZ；

所述敏化剂为PMB的1/4LB培养基；

所述固定液为10％乳糖；

所述的利用生物传感器检测土壤中可提取态四环素类抗生素的试纸条的制备方法如下:(a)准备滤纸条基底，裁剪成需要的尺寸；

(b)将Escherichia coliBL21/pMTLacZ细菌和10％乳糖和PMB的1/4LB培养基按比例混合；

(c)将Escherichia coliBL21/pMTLacZ细菌和10％乳糖和PMB的1/4LB培养基的混合物滴加于试纸基底上；

(d)将试纸置于冷冻干燥机固定。

2.根据权利要求1所述的利用生物传感器检测土壤中可提取态四环素类抗生素的试纸条，其特征在于，所述试纸在冷冻干燥机固定时间为4h。

3.利用权利要求1所述试纸条检测土壤中四环素类抗生素的方法，其特征在于：将Escherichia coliBL21/pMTLacZ细菌试纸投入待测100μL土壤提取液和900μLLB培养基混合液，检测生物传感器试纸上的蓝色强度。

说明书

利用生物传感器检测土壤中可提取态四环素类抗生素的试纸

条及方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物分析检测技术领域，具体是涉及利用生物传感器检测土壤中可提取态四环素类抗生素的试纸条及方法。

背景技术

[0002] 随着工业化程度的升高以及各类化工产品污染土壤事件的突发，各种化学物质数量猛增，给人类生存环境造成很大影响，迫切需要对日益增多的环境污染物进行急性毒性鉴定。

[0003] 四环素类药物具有广谱高效的杀菌抗生功效，可以与大多数药物或饲料添加剂混用，已被广泛应用于畜禽生产中。但过量使用不可避免的造成了畜禽粪便中严重的药物残留，通过粪便施肥进入土壤环境，成为严重危害人类健康的食品安全隐患之一。为此世界各国对四环素类药物残留的检测十分关注。四环素类药物残留的检测方法中理化检测主要有薄层色谱法毛细管电泳法、高效液相色谱法、化学发光法和液相色谱-质谱联用技术等。生物学检测方法主要分为微生物法和免疫分析法等。但这些方法有的需要昂贵的仪器设备，需要熟练的专业人员操作，操作过程复杂，需要时间较长，限制了其应用范围，难以在生产实际中推广应用。免疫试纸法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度高，分析过程简单，是需要优先发展的检测技术，以便于检测土壤中四环素的含量。其中细菌生物传感器因其独特的生理特性，与现代光电检测手段完美匹配的特点而倍受关注。

[0004] 试纸以其独特的检测成本低、操作简单等特点在各个领域中应用广泛，例如:实验室所用的pH试纸、淀粉碘化钾试纸；工业所用的温度热敏试纸、废水检测试纸；生活所用的血糖试纸等。由于制作试纸的材料和方法不同，试纸的检测领域和检测灵敏度也不同。目前，尚未发现利用全细胞生物传感器制备试纸条评估土壤中四环素类抗生素的方法。

发明内容

[0005] 本发明旨在填补应用全细胞生物传感器制备试纸条检测土壤中四环素类抗生素的空白，提供一种利用全细胞生物传感器检测土壤中四环素类抗生素的试纸条及检测方法。

[0006] 本发明的技术方案如下：

[0007] 一种利用生物传感器检测土壤中可提取态四环素类抗生素的试纸条，包括：滤纸条、固定液、敏化剂以及四环素生物传感器细菌菌剂；所述四环素生物传感器细菌菌剂为Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌株；所述固定液和敏化剂包裹Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌株固定负载在所述滤纸条上。

[0008] 进一步地，在上述方案中，所述Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌株的制备方法为：

[0009] (1)利用引物聚合酶链反应(PCR)从质粒pMTmCherry中克隆到Staphylococcus rostri RST11:Tn916和转座子Tn10上的四环素介导调控系统的pMT片段(5256bp)的基因序列，退火温度为55℃；所用质粒如表1所示。

[0010] 所述pMT引物的正向引物序列和反向引物序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示，

[0011] SEQ ID No.1：TCGTGCCAGCTGCATTAAT

[0012] SEQ ID No.2：TTCACTTTTCTCTATCACTGATAGG；

[0013] 表1所使用菌种和质粒

[0014]

[0015] (2)将利用引物聚合酶链反应(PCR)从pCU19质粒上克隆LacZ(368bp)报告基因片段的基因序列，退火温度为65℃；质粒pMTmCherry中克隆到T7片段(220bp)的基因序列，退火温度为60℃；从并结合融合LacZ和T7终止子序列得到LacZ-T7融合片段(568bp)，需在设计引物的时，添加同源片段；

[0016] 所述LacZ引物的正向引物序列和反向引物序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示，

[0017] SEQ ID No.3：CTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAATGACCATGATTACGCCAAGC[0018] SEQ ID No.4：GTGGCAGCAGCCTAGGTTAACTATGCGGCATCAGAGCAG；

[0019] 所述T7引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，[0020] SEQ ID No.5：TTAACCTAGGCTGCTGCC

[0021] SEQ ID No.6：TCATTAATGCAGCTGGCACGATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC；

[0022] 融合LacZ-T7所用引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，

[0023] SEQ ID No.7：CTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAA

[0024] SEQ ID No.8：TCATTAATGCAGCTGGCAC；

[0025] (3)将所述的LacZ-T7和pMT通过同源重组酶连接，将基因片段添加到PCR管中，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部。载体用10-100ng。载体与插入片段的摩尔比1:1～1:10。多片段连接时各片段之固摩尔比为1:1。

[0026] pmols＝(质量ng×1000)/(片段长度bp×650daltons)；

[0027] 混合液在50℃反应15min。对于多片段克隆可延长反应时间，但总长不要超过60min。

[0028] 取100μL冰浴上融化的Escherichia coli BL21感受态细抱，加入目的DNA(质粒或使用；连接产物)，轻轻混匀，冰上静置25min。42℃水浴热激30-45s,迅速转移至冰浴中，静置2min。向离心管中加入500μL不含抗生素的无茵LB培养基，混匀后37℃,200rpm复苏1h。吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含Amp抗生素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；

[0029] (4)在培养基上挑点，使用无菌的10μL移液枪头在含氨苄青霉素抗生素的LB培养基和含氨苄青霉素、20mg/L X-gal和四环素抗生素的LB培养基上分别画线，筛选可以在两个培养基上生长，并在含氨苄青霉素、20mg/L X-gal和四环素抗生素的LB培养基上长出蓝色斑点的菌株，使用引物PCR鉴定重组后的质粒，退火温度为53℃；验证质粒的核心片段为3590bp。

[0030] 鉴定所用引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，

[0031] SEQ ID No.9：ACTGTCAATTTGATAGCGGG

[0032] SEQ ID No.10：ATTAATGCAGCTGGCACGA；

[0033] 并测序验证所得含重组质粒菌种Escherichia coli BL21/pMTLacZ。

[0034] 进一步地，在上述方案中，所述固定液为10％乳糖。

[0035] 进一步地，在上述方案中，所述敏化剂为PMB的1/4LB培养基。

[0036] 本发明还提供了上述试纸条的制备方法：

[0037] (a)准备滤纸条基底，裁剪成需要的尺寸；优选大小为l cm×4cm；

[0038] (b)将Escherichia coli BL21/pMTLacZ细菌和10％乳糖和PMB的1/4LB培养基按比例混合；

[0039] (c)将Escherichia coli BL21/pMTLacZ细菌和10％乳糖和PMB的1/4LB培养基的混合物滴加于试纸基底上；

[0040] (d)将试纸置于冷冻干燥机固定。

[0041] 进一步地，所述Escherichia coli BL21/pMTLacZ细菌和10％乳糖和PMB的1/4LB培养基混合物的用量比例范围为：3～4mg菌粉对应100μL 10％乳糖和PMB的1/4LB培养基混合。

[0042] 进一步地，所述在冷冻干燥机固定时间为4h。

[0043] 本发明还提提供了一种上述试纸条检测土壤中四环素类抗生素的方法：

[0044] 将待测100μL土壤提取液和900μL LB培养基混合液进行复苏，(约13-18min)复苏完毕后，投入所述试纸，检测试纸上的蓝色强度。

[0045] 进一步地，根据初始显色和1.5h后的颜色强度，对比得出颜色强度，从而实现对该土壤中六种四环素类抗生素的检测。

[0046] 进一步地，可选择便携式手提色度计来检测蓝色颜色强度。

[0047] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

[0048] (1)本发明的pMTLacZ质粒为发明人自主设计的可受多种四环素类抗生素诱导标的合成质粒，pMTLacZ质粒可在不同浓度的四环素的诱导下产生不同量的β半乳糖苷酶，可降解试纸条上固定的X-gal显色剂，直观显示样品中四环素类抗生素的浓度。

[0049] (2)本发明的试纸条能够同时有效检测土壤体中六种四环素类抗生素(四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、米诺环素和甲烯土霉素)的含量且并不引入任何有机化学试剂。

[0050] (3)本发明的检测方法简便、快速、直观、准确、便于携带、环保、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

[0051] 图1是基因片段的凝胶电泳图；其中，图a为重组质粒所用基因片段，图b为重组质粒验证片段；

[0052] 图2是Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌显色原理和效果；其中，图a为重组质粒显色原理，图b为x-gal化学反应，图c为显色结果图；

[0053] 图3是pMTLacZ质粒基因图谱；

[0054] 图4是Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌试纸制备流程；

[0055] 图5是Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌试纸测试六种四环素类抗生素色卡；

[0056] 图6是Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌试纸测试土壤中六种四环素类抗生素。

[0057] 图7是本发明的检测方法流程图。

具体实施方式

[0058] 1、Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌株的制备：

[0059] (1)利用引物聚合酶链反应(PCR)从质粒pMTmCherry中克隆到Staphylococcus rostri RST11:Tn916和转座子Tn10上的四环素介导调控系统的pMT片段(5256bp)的基因序列，退火温度为55℃(图1)。所用质粒如表1所示。

[0060] 表1所使用菌种和质粒

[0061]

[0062] 所述pMT引物的正向引物序列和反向引物序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示，

[0063] SEQ ID No.1：TCGTGCCAGCTGCATTAAT

[0064] SEQ ID No.2：TTCACTTTTCTCTATCACTGATAGG；

[0065] (2)将利用引物聚合酶链反应(PCR)从pCU19质粒上克隆LacZ(368bp)报告基因片段的基因序列，退火温度为65℃；质粒pMTmCherry中克隆到T7片段(220bp)的基因序列，退火温度为60℃；从并结合融合LacZ和T7终止子序列得到LacZ-T7融合片段(568bp)，需在设计引物的时，添加同源片段(图1)。

[0066] 所述LacZ引物的正向引物序列和反向引物序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示，

[0067] SEQ ID No.3：CTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAATGACCATGATTACGCCAAGC[0068] SEQ ID No.4：GTGGCAGCAGCCTAGGTTAACTATGCGGCATCAGAGCAG；

[0069] 所述T7引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，[0070] SEQ ID No.5：TTAACCTAGGCTGCTGCC

[0071] SEQ ID No.6：TCATTAATGCAGCTGGCACGATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC；

[0072] 融合LacZ-T7所用引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，

[0073] SEQ ID No.7：CTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAA

[0074] SEQ ID No.8：TCATTAATGCAGCTGGCAC；

[0075] (3)将所述的LacZ-T7和pMT通过同源重组酶连接，将基因片段添加到PCR管中，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部。载体用10-100ng。载体与插入片段的摩尔比1:1～1:10。多片段连接时各片段之固摩尔比为1:1。

[0076] pmols＝(质量ng×1000)/(片段长度bp×650daltons)；

[0077] 混合液在50℃反应15min。对于多片段克隆可延长反应时间，但总长不要超过60min。

[0078] 取100μL冰浴上融化的Escherichia coli BL21感受态细抱，加入目的DNA(质粒或使用；连接产物)，轻轻混匀，冰上静置25min。42℃水浴热激30-45s,迅速转移至冰浴中，静置2min。向离心管中加入500μL不含抗生素的无茵LB培养基，混匀后37℃,200rpm复苏1h。吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含Amp抗生素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

[0079] (4)在培养基上挑点，使用无菌的10μL移液枪头在含氨苄青霉素抗生素的LB培养基和含氨苄青霉素、20mg/L X-gal和四环素抗生素的LB培养基上分别画线，筛选可以在两个培养基上生长，并在含氨苄青霉素、20mg/L X-gal和四环素抗生素的LB培养基上长出蓝色斑点的菌株(图2)，使用引物PCR鉴定重组后的质粒，退火温度为53℃；验证质粒的核心片段为3590bp(图1)。

[0080] 鉴定所用引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，

[0081] SEQ ID No.9：ACTGTCAATTTGATAGCGGG

[0082] SEQ ID No.10：ATTAATGCAGCTGGCACGA；

[0083] 并测序验证所得含重组质粒菌种Escherichia coli BL21/pMTLacZ。pMTLacZ质粒图谱如图3所示。

[0084] 2、试纸的制备：

[0085] 将上述菌种Escherichia coli BL21/pMTLacZ接种于含100mg/L氨苄青霉素抗生素的LB培养基，生物传感器细胞在37℃ LB培养基中培养约4-5h，150r/min剧烈振荡，OD600nm为0.450-0.500。以4000×g离心10min收集细菌细胞，加入到10％乳糖和PMB的1/4LB培养基中复苏。生物传感器细胞悬液(50μL)被滴加在纸滤纸条(1cm×4cm)，在室温下风干10min，随后冷冻干燥。纸带保存于-20℃备用(图4)。

[0086] 3、四环素比色卡制备：

[0087] 需要进行土壤中六种四环素检测时，需要四环素比色卡，以黄棕壤为例，其土壤的理化性质如表2所示，土壤提取液通过土壤和25mmol/L EDTA比1：1浸出1h获得，使用土壤提取液配制不同浓度(0,10,25,50,75,100,250,500,750,1000,2500,5000,7500,和10000μg/L)的四环素溶液，来模拟土壤可提取态。将固定有生物传感器细菌的试纸放入不同浓度的四环素溶液土壤提取液测试，使用相机获取显色照片，传入电脑上用ImageJ软件处理得到显色强度(图5)。

[0088] 4、四环素检测：

[0089] 将复苏后的Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌试纸放入待测水样中，反应150min立即读取发光量，然后滴加X-gal等待150min，待生物传感器与土壤浸出液中四环素类抗生素物质反应完毕，再次读取显色，然后根据构建的四环素比色卡的色度计算，从而评估出该土壤浸出液的四环素的含量(图7)。为了佐证该新型试纸的准确性和可靠性，我们利用25mmol/L EDTA从土壤中分别进行了Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌试纸测试。结果证明该测试试纸结果为稳定且具重现性。因此可以认定该方法可靠可行，具有实际应用价值(图6)。

[0090] 表2供试土壤的理化性质

[0091]

[0092] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。