一种基于Nafion引发原子转移自由基聚合反应信号放大的肺癌早期诊断试剂盒转让专利
申请号 : CN201910587483.2
文献号 : CN110257519B
文献日 : 2022-07-08
发明人 : 杨怀霞 , 张京玉 , 刘艳菊 , 巴妍妍 , 赵利营 , 郭壮壮
申请人 : 河南中医药大学
摘要 :
本发明公开了一种基于Nafion引发原子转移自由基聚合反应信号放大的肺癌早期诊断试剂盒，包括氨基Fe3O4磁珠溶液、Sulfo‑SMCC溶液、PNA溶液、ZrClO2溶液、Nafion溶液、荧光素O‑丙烯酸酯溶液、AA溶液、CuBr2/Me6TREN溶液、PBS缓冲液、DMF。本发明利用Nafion的聚合特性将其应用于ATRP反应中，作为引发剂以提高单体聚合能力，大量荧光单体通过ATRP反应连接聚合，最后，通过荧光光谱仪测定的荧光信号强度与靶DNA(tDNA)浓度呈正相关，成功构建了基于Nafion引发原子转移自由基聚合反应信号放大的肺癌生物标志物CYFRA21‑1的检测试剂盒。本发明试剂盒具有灵敏度高，稳定性高，抗干扰性强，检测限低等特点，为肺癌DNA的临床检测开辟了新的途径。
权利要求 :
1.一种基于Nafion引发原子转移自由基聚合反应信号放大的肺癌早期诊断试剂盒，其特征在于，包括氨基Fe3O4磁珠溶液、Sulfo‑SMCC溶液、PNA溶液、ZrClO2溶液、Nafion溶液、荧光素 O‑丙烯酸酯溶液、抗坏血酸溶液、CuBr2/Me6TREN溶液、PBS缓冲液、DMF。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，氨基Fe3O4磁珠溶液浓度为10 mg/mL，Sulfo‑SMCC溶液浓度为100 μM，PNA溶液浓度为0.5 μM，ZrClO2溶液浓度为5 mM，Nafion溶液为Nafion® 117溶液，荧光素O‑丙烯酸酯溶液浓度为10 mM，抗坏血酸溶液浓度为2 mM，IICu Br/Me6TREN溶液浓度为10mM。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，PNA的序列为5'‑SH‑(CH2)11(O Linker)3‑GAAGGGAGGAATGGTGTCAGGGGCG‑3'。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，CuBr2/Me6TREN溶液的制备方法为：20 mM IICuBr2溶液与20 mM Me6TREN溶液以体积比为1:1的比例混合，制得浓度为10mM 的Cu Br/Me6TREN溶液，4℃保存备用。
说明书 :
一种基于Nafion引发原子转移自由基聚合反应信号放大的肺
癌早期诊断试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基于Nafion引发原子转移自由基聚合反应信号放大的肺癌早期诊断试剂盒，属于生物分析技术领域。
背景技术
[0002] 全氟磺酸(Nafion)是一种人工合成的具有离子特性的聚合物，被称为离子交联聚合物。它开启了一种全新的聚合物种类，多用于膜材料、燃料电池以及电极的修饰等。由于Nafion的离子特性是通过增加磺酸基至聚合物矩阵上形成的，磺酸基是有着非常强的离子性化学成分，Nafion中部分C‑F键能较低，可产生自由基，在聚合反应下易自由基聚合。全氟磺酸聚合物具有优良的离子导电性、优异的化学稳定性和良好的热稳定性。
[0003] 原子转移自由基聚合(ATRP)通常利用引发剂(有机卤化物)、载体(过渡金属配合物)，经过氧化还原反应，使活性种与休眠种之间建立一种动态平衡，从而达到对聚合反应的控制。其具有反应进程可控、反应单体广泛、灵敏性高等的特点。因此，随着纳米材料逐渐在生物分子检测中被越来越广泛应用的同时，基于ATRP的生物核酸探针信号放大策略在生物检测方面也得到了极大的推广。
[0004] 肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其发病率呈现不断上升的趋势。由于缺乏早期发现与诊断疾病的有效技术和手段，大部分肺癌被发现时已处于中晚期，治疗只能以姑息治疗为主，预后差，其诊断主要依赖于细胞学，影像等其他测试，但这些常规方法难以检测癌细胞中的微转移，以至于其扩散至晚期。因此，当今社会十分需要一种超灵敏生物检测器应用于肺癌DNA检测。CYFRA21‑1细胞角蛋白片段被认为是诊断非小细胞肺癌最重要的生物标志物，当肿瘤细胞发生溶解或坏死时便将细胞角质蛋白释放入体液中，在血液中的升高多见于NSCLC，目前被认为是检测肺鳞癌的首选。Mei Chen等已利用CYFRA21‑1细胞角质蛋白的部分DNA片段(5'‑
CGCCCCTGACACCATTCCTCCCTTC‑3')实现了对CYFRA21‑1的检测(Three‑dimensional electrochemical DNA biosensor based on 3D graphene‑Ag nanoparticles for sensitive detection of CYFRA21‑1in non‑small cell lung cancer)。
CGCCCCTGACACCATTCCTCCCTTC‑3')实现了对CYFRA21‑1的检测(Three‑dimensional electrochemical DNA biosensor based on 3D graphene‑Ag nanoparticles for sensitive detection of CYFRA21‑1in non‑small cell lung cancer)。
[0005] 为了提高检测的灵敏度以及选择性，利用Nafion聚合特性将其应用于ATRP反应中，作为引发剂，可提高聚合能力。与传统的抗体‑抗原反应法相比，该方法大大提高遗传学检测和医疗诊断的效率及灵敏度，以高特异性、强抗干扰性及良好的选择性优势胜出，可用于低浓度的CYFRA21‑1tDNA检测。
发明内容
[0006] 针对目前存在检测肺癌DNA的问题，本发明的目的是提供一种基于Nafion引发原子转移自由基聚合反应信号放大的肺癌早期诊断试剂盒。
[0007] 为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
[0008] 一种基于Nafion引发原子转移自由基聚合反应信号放大的肺癌早期诊断试剂盒，包括氨基Fe3O4磁珠溶液、Sulfo‑SMCC溶液、PNA溶液、ZrClO2溶液、Nafion溶液、荧光素O‑丙烯酸酯溶液、AA溶液、CuBr2/Me6TREN溶液、PBS缓冲液、DMF。
[0009] 氨基Fe3O4磁珠溶液浓度为10mg/mL，Sulfo‑SMCC溶液浓度为100μM，PNA溶液浓度为0.5μM，ZrClO2溶液浓度为5mM，Nafion溶液为 117溶液，荧光素O‑丙烯酸酯溶液浓度II
为10mM，AA溶液浓度为2mM，Cu Br/Me6TREN溶液浓度为10mM。
为10mM，AA溶液浓度为2mM，Cu Br/Me6TREN溶液浓度为10mM。
[0010] PNA的序列为5'‑SH‑(CH2)11(O Linker)3‑GAAGGGAGGAATGGTGTCAGGGGCG‑3'。
[0011] CuBr2/Me6TREN溶液的制备方法为：20mM CuBr2溶液与20mM Me6TREN溶液以体积比II为1:1的比例混合，制得浓度为10mM的Cu Br/Me6TREN溶液，4℃保存备用。
[0012] 一种上述试剂盒在肺癌早期诊断中的应用。
[0013] 一种上述试剂盒诊断肺癌的方法，包括以下步骤：
[0014] (1)氨基磁珠的处理及修饰：
[0015] ①量取一定量的氨基Fe3O4磁珠溶液，磁性分离，去上清液，用PBS缓冲液洗涤，磁性分离，去上清液，加入PBS缓冲液重悬并恢复至量取的磁珠溶液体积；
[0016] ②量取20μL磁珠重悬液，加20μL Sulfo‑SMCC溶液和160μL PBS缓冲液，混匀后，在恒温摇床37℃条件下避光反应2h；
[0017] ③将步骤(1)‑②所得混合液磁性分离，去上清液，用PBS缓冲液洗涤，磁性分离，去上清液；
[0018] ④加入195μL PBS缓冲液和5μL PNA溶液，混匀后，在恒温摇床37℃条件下避光反应过夜；
[0019] (2)tDNA杂交：
[0020] ①将步骤(1)所得反应液磁性分离，去上清液，用PBS缓冲液洗涤；
[0021] ②加入20μL待测样品和180μL PBS缓冲液，混匀后，在恒温摇床37℃条件下避光反应2h；
[0022] (3)基于DNA的磁珠修饰：
[0023] ①将步骤(2)所得反应液磁性分离，去上清液，用PBS缓冲液洗涤；
[0024] ②加入20μL的ZrClO2溶液和180μL PBS缓冲液，混匀后，在恒温摇床37℃条件下避光反应0.5h；
[0025] ③将步骤(3)‑②所得反应液磁性分离，去上清液，用PBS缓冲液洗涤；
[0026] ④加入10μL的Nafion溶液和190μL PBS缓冲液，混匀后，在恒温摇床37℃条件下避光反应40‑60min；
[0027] (4)原子转移自由基聚合(ATRP)反应：
[0028] ①将步骤(3)所得反应液磁性分离，去上清液，用PBS缓冲液洗涤；加入10μL荧光素IIFA溶液、150μL PBS缓冲液、20μL AA溶液、20μL Cu Br/Me6TREN溶液，在恒温摇床37℃条件下避光反应100‑120min；
[0029] ②将步骤(4)‑①所得反应液磁性分离，去上清液，依次用DMF和PBS缓冲液洗涤；然后将磁珠重新分布在700μL PBS缓冲液中，混匀后，混合液作为样品进行荧光检测，判定结果。
[0030] 步骤(1)～(4)中反应的转速为200r/s。
[0031] 步骤(4)中荧光检测的激发波长为489nm，狭缝宽度为2nm。
[0032] 本发明试剂盒及检测方法的示意图如图1所示。
[0033] 本发明的有益效果：
[0034] 1、与传统的ATRP聚合法相比，本发明在ATRP聚合体系中加入适量的溴化铜，CuⅡ通0 Ⅰ
过与Cu之间的电子转移再生为Cu ，使“休眠种”向生成“活性种”的方向移动，使得聚合效率获得显著提高，从而提高该生物检测器的稳定性和重现性。
过与Cu之间的电子转移再生为Cu ，使“休眠种”向生成“活性种”的方向移动，使得聚合效率获得显著提高，从而提高该生物检测器的稳定性和重现性。
[0035] 2、Nafion作为ATRP体系中的引发剂，可利用聚合物的特征作为自由基聚合反应活性中心，Nafion中的C‑F键部分键能较低，在催化剂的作用下断裂，产生自由基，通过自由基对荧光素(FA)C＝C双键中C的撞击产生新的自由基，一系列的聚合，使最终检测的荧光信号强度得到放大。由于C‑F键的存在增加了自由基的聚合速率和稳定性，在放大荧光信号提高检测灵敏度的同时，其稳定性也相对提高。
[0036] 3、利用Nafion的聚合特性将其应用于ATRP反应中，作为引发剂以提高单体聚合能力，大量荧光单体通过ATRP反应连接聚合，最后，通过荧光光谱仪测定的荧光信号强度与靶DNA(tDNA)浓度呈正相关，成功构建了基于Nafion引发原子转移自由基聚合反应信号放大的肺癌生物标志物CYFRA21‑1的检测试剂盒。结果表明，最优条件下，在0.1fM～1nM范围内的tDNA浓度与荧光信号强度呈良好线性关系，线性方程为F(au)＝2178.67×LogCtDNA+2
35838.62(R ＝0.9975)，检出限低至35.5aM。同时该试剂盒在实际样品人血清中测定DNA也表现出较高的抗干扰性(90.63％)。综上所述，本试剂盒对肺癌生物标志物CYFRA21‑1DNA的检测具有灵敏度高，稳定性高，抗干扰性强等特点，为肺癌DNA的临床检测开辟了新的途径。
35838.62(R ＝0.9975)，检出限低至35.5aM。同时该试剂盒在实际样品人血清中测定DNA也表现出较高的抗干扰性(90.63％)。综上所述，本试剂盒对肺癌生物标志物CYFRA21‑1DNA的检测具有灵敏度高，稳定性高，抗干扰性强等特点，为肺癌DNA的临床检测开辟了新的途径。
附图说明
[0037] 图1为试剂盒及检测方法的示意图。
[0038] 图2为不同修饰氨基磁珠的荧光信号的强度。
[0039] 图3为荧光信号强度与ATRP时间的关系。
[0040] 图4为荧光信号强度与FA用量的关系。
[0041] 图5为荧光信号强度与Nafion时间的关系。
[0042] 图6为荧光信号强度与Nafion用量的关系。
[0043] 图7为不同tDNA浓度对荧光信号强度的影响。图中tDNA的浓度从上到下依次为1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、10fM、1fM、0.1fM。
[0044] 图8为荧光信号强度与tDNA浓度C的关系；图中tDNA的浓度从右到左依次为1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、10fM、1fM、0.1fM。
[0045] 图9为荧光信号强度与不同错配tDNA的关系。
[0046] 图10为荧光信号强度与5％NHS和0.1nM PBS的关系。
具体实施方式
[0047] 以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0048] 氨基Fe3O4磁珠购自普睿迈格生物科技有限公司(厦门)。
[0049] PNA的序列为：5'‑SH‑(CH2)11(O Linker)3‑GAAGGGAGGAATGGTGTCAGGGGCG‑3'(SEQ ID NO.1)。
[0050] tDNA的序列(CYFRA21‑1部分序列)为：5'‑CGCCCCTGACACCATTCCTCCCTTC‑3'(SEQ ID NO.2)。
[0051] SBM的序列为：5’‑CGCCCCTAACACCATTCCTCCCTTC‑3’(SEQ ID NO.3)。
[0052] TBM的序列为5’‑CGCCCATGACACTATTCCTCGCTTC‑3’(SEQ ID NO.4)。
[0053] Control的序列为：5’‑TATTATCCGTCAGTGGAAAGGACCG‑3’(SEQ ID NO.5)。
[0054] 实施例1、诊断试剂盒的构建
[0055] 该试剂盒包括氨基Fe3O4磁珠溶液(10mg/mL)、Sulfo‑SMCC溶液(100μM)、PNA溶液(0.5μM)、ZrClO2溶液(5mM)、Nafion溶液( 117溶液)、荧光素O‑丙烯酸酯(FA)溶液II(10mM)、AA溶液(2mM)、Cu Br/Me6TREN溶液(10mM)、PBS缓冲液、DMF(N,N‑二甲基甲酰胺)。
[0056] PBS缓冲液的制备方法为：称取5.8g Na2HPO4.12H2O、0.592g NaH2PO4.2H2O、2.34g NaCl和200μL超纯水混合，即得；其浓度为0.1M，pH为7.4。
[0057] 抗坏血酸(AA)溶液的制备方法为：将AA与体积分数70％的乙醇溶液混合，制得浓度为2mM的AA溶液，4℃保存备用。
[0058] 荧光素FA溶液的制备方法为：将FA与DMF混合，制得浓度为10mM的荧光素FA溶液，4℃保存备用。
[0059] CuIIBr/Me6TREN溶液的制备方法为：20mM CuBr2溶液(溶解在DMF中)与20mMMe6TRENII溶液(溶解在DMF中)以体积比为1:1的比例混合，制得浓度为10mM的Cu Br/Me6TREN溶液，4℃保存备用。
[0060] 实施例2、试剂盒的检测方法
[0061] (1)氨基磁珠的处理及修饰：
[0062] ①量取一定量的氨基Fe3O4磁珠溶液(10mg/mL)，磁性分离，去上清液，用PBS缓冲液洗涤，磁性分离，去上清液，加入PBS缓冲液重悬并恢复至量取的磁珠溶液体积；
[0063] ②量取20μL磁珠重悬液，加20μL Sulfo‑SMCC溶液和160μL PBS缓冲液，混匀后，在恒温摇床37℃、200r/s条件下避光反应2h，使交联剂SMCC一端与氨基磁珠以酰胺键结合；
[0064] ③将步骤(1)‑②所得混合液磁性分离，去上清液，用PBS缓冲液洗涤，磁性分离，去上清液；
[0065] ④加入195μL PBS缓冲液和5μL PNA溶液，混匀后，在恒温摇床37℃、200r/s条件下避光反应过夜，使PNA与交联剂另一端键合；
[0066] (2)tDNA杂交：
[0067] ①将步骤(1)所得反应液磁性分离，去上清液，用PBS缓冲液洗涤；
[0068] ②加入20μL的tDNA溶液(0.1nM)和180μL PBS缓冲液，混匀后，在恒温摇床37℃、200r/s条件下避光反应2h，使PNA与待测样品中的tDNA特异性识别；
[0069] (3)基于DNA的磁珠修饰：
[0070] ①将步骤(2)所得反应液磁性分离，去上清液，用PBS缓冲液洗涤；
[0071] ②加入20μL的ZrClO2溶液和180μL PBS缓冲液，混匀后，在恒温摇床37℃、200r/s4+
条件下避光反应0.5h，使Zr 与磷酸根通过化学反应相连；
条件下避光反应0.5h，使Zr 与磷酸根通过化学反应相连；
[0072] ③将步骤(3)‑②所得反应液磁性分离，去上清液，用PBS缓冲液洗涤；
[0073] ④加入10μL的Nafion溶液和190μL PBS缓冲液，混匀后，在恒温摇床37℃、200r/s4+
条件下避光反应40‑60min，Nafion中的磺酸根与Zr 和磷酸根化学反应形成磷酸锆磺酸盐；
条件下避光反应40‑60min，Nafion中的磺酸根与Zr 和磷酸根化学反应形成磷酸锆磺酸盐；
[0074] (4)原子转移自由基聚合(ATRP)反应：
[0075] ①将步骤(3)所得反应液磁性分离，去上清液，用PBS缓冲液洗涤；加入10μL荧光素IIFA溶液、150μL PBS缓冲液、20μL AA溶液、20μL Cu Br/Me6TREN溶液，在恒温摇床37℃、
200r/s条件下避光反应100‑120min；
200r/s条件下避光反应100‑120min；
[0076] ②将步骤(4)‑①所得反应液磁性分离，去上清液，加入DMF清洗2次，PBS缓冲液洗涤3次；然后将磁珠重新分布在700μL PBS缓冲液中，混匀后，混合液作为样品在荧光分光光度仪上进行荧光检测(激发波长为489nm，狭缝宽度为2nm)。根据荧光信号强度计算tDNA浓度。
[0077] 实施例3、可行性验证
[0078] 首先，通过使用荧光光谱仪对不同修饰状态的氨基磁珠进行荧光强度检测。如图2所示，只加入PBS缓冲液(0.1M，pH7.4)没有检测到任何荧光强度。相反，加入SMCC/PNA/4+ II 6
tDNA/Zr /Nafion/Cu Br/MeTREN后经过多次洗涤仍然可以观察到明显的荧光发射峰，这是因为大量的FA通过ATRP被引入到磁珠上，产生了极大的荧光信号。同时，在分别未加入
4+ II
Zr 、Cu Br/Me6TREN、Nafion、PNA、tDNA的条件下，仅检测到相对较弱的荧光信号，这表明实验具有较高的灵敏度。通过对比实验，充分证明了基于ATRP聚合用于荧光信号放大策略应用于tDNA的检测是可行的。
tDNA/Zr /Nafion/Cu Br/MeTREN后经过多次洗涤仍然可以观察到明显的荧光发射峰，这是因为大量的FA通过ATRP被引入到磁珠上，产生了极大的荧光信号。同时，在分别未加入
4+ II
Zr 、Cu Br/Me6TREN、Nafion、PNA、tDNA的条件下，仅检测到相对较弱的荧光信号，这表明实验具有较高的灵敏度。通过对比实验，充分证明了基于ATRP聚合用于荧光信号放大策略应用于tDNA的检测是可行的。
[0079] 实施例4、ATRP检测条件优化
[0080] (1)反应时间的优化
[0081] 通过检测不同ATRP反应时间的氨基磁珠的荧光强度，反应出了ATRP的反应时间与荧光强度的关系。结果如图3所示，荧光信号强度随着ATRP反应时间的延长逐渐增大并在100min达到了稳定。这可能是因为引发聚合物链生长的自由基失去了其活性或是其空间位阻过大阻碍了自身的增长。因此，ATRP最佳反应时间为100min。
[0082] (2)荧光素用量的优化
[0083] 荧光素的多少可影响聚合物链的长度进而影响检测性能。显然，当体系中荧光素FA含量不足时，荧光信号强度达不到最大。结果如图4所示，分别在ATRP体系中加入荧光素FA的用量为2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、15μL、20μL，FA的浓度为10mM，当加入FA量为10μL时磁珠的荧光信号强度达到最大，此后继续将荧光素的用量增大，荧光信号强度并未明显增大，因此，荧光素的最佳用量为10μL。
[0084] 综上所述，ATRP体系最佳优化条件为：ATRP反应时间为100min，荧光素用量为10μL。
[0085] 实施例5、引发剂Nafion条件优化
[0086] (1)Nafion反应时间的优化
[0087] Nafion可影响聚合物链的长度进而影响检测性能。当体系中Nafion反应不充分时，荧光强度达不到最大。结果如图5所示，分别测定Nafion反应时间为0min、20min、40min、60min、80min时的磁珠荧光信号强度，当Nafion时间为40min时磁珠的荧光强度达到最大，因此选择Nafion反应时间为40min用于以后的实验中。
[0088] (2)Nafion用量的优化
[0089] Nafion的用量不仅对聚合物链有影响，而且影响检测性能。结果如图6所示，分别测定Nafion用量分别为2μL、4μL、8μL、10μL、15μL、20μL，当加入Nafion为10μL时氨基磁珠的荧光信号强度达到最大，此后继续增大Nafion的用量，荧光信号强度并未明显增大，因此选择Nafion用量为10μL应用于以下实验中。
[0090] 综上所述，Nafion最佳优化条件为：Nafion的反应时间为40min，用量为10μL。
[0091] 实施例6、对tDNA的检测性能分析
[0092] 根据实施例4、5条件优化所得出的最佳实验条件，检测不同浓度的tDNA(0.1fM、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM)产生的荧光信号强度大小，来研究本发明对于tDNA的检测性能。如图7、8所示，磁珠的荧光信号强度随着tDNA的浓度增加而增加，这是因为
4+
tDNA浓度越大，导致与Zr 反应的磷酸根越多，从而使引入磁珠的荧光素越多，产生的荧光强度越强。荧光最大发射峰强度与tDNA浓度的对数值在0.1fM到1nM范围呈现良好的线性关
2
系，线性方程为F(au)＝2178.67×LogCtDNA+35838.62(R＝0.9975)，检测限为35.5aM，结果表明实验方法具有较高的检测灵敏度，较低的检测限，性能优异。
4+
tDNA浓度越大，导致与Zr 反应的磷酸根越多，从而使引入磁珠的荧光素越多，产生的荧光强度越强。荧光最大发射峰强度与tDNA浓度的对数值在0.1fM到1nM范围呈现良好的线性关
2
系，线性方程为F(au)＝2178.67×LogCtDNA+35838.62(R＝0.9975)，检测限为35.5aM，结果表明实验方法具有较高的检测灵敏度，较低的检测限，性能优异。
[0093] 实施例7、选择性实验
[0094] 通过实施例4、5条件优化所得出的最佳实验条件，研究tDNA类似物，SBM、TBM、Control使用本检测方法产生的荧光信号强度。具体是通过对比同浓度下的tDNA、TBM、Control、SBM(0.1nM)的荧光信号强度。如图9所示，不同错配tDNA(Control、TBM、SBM)所对应的荧光信号强度分别为tDNA的8.93％、22.17％、30.66％，干扰物产生的荧光信号相对于目标物较小，这是由于PNA与tDNA特异性识别互补配对，结果证明本发明方法具有较高的选择性。
[0095] 实施例8、干扰性实验
[0096] 根据实施例4、5条件优化所得出的最佳实验条件，通过将分别加入5％(10/200)的正常人血清(NHS)和0.1nM PBS(pH 7.4)的氨基磁珠的荧光信号强度进行对比，如图10所示，当两者tDNA的浓度分别为0.1fM、0.1pM、0.1nM时，所测得5％的正常人血清(NHS)的氨基磁珠的荧光信号强度分别为PBS(pH 7.4)的89.67％、88.48％、90.63％。结果表明，本发明在方法实际血清样品中具有较强的抗干扰能力，可用于实际样品的检测。