一种产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法

摘要

本发明属于动物免疫学技术领域，具体涉及一种产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法。本发明以抗产气荚膜梭菌β毒素的单克隆抗体包被酶标板，以天然产气荚膜梭菌β毒素作为捕获抗原，建立产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法。本发明具有快速简便、特异性强、灵敏度高等特点，适用于产气荚膜梭菌β毒素抗体的检测、流行病学调查及疫苗免疫效果评价等方面。

权利要求

1.一种单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCC NO.14894的杂交瘤细胞株分泌产生。

2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测产气荚膜梭菌β毒素抗体的试剂盒中的应用。

3.一种检测产气荚膜梭菌β毒素抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有保藏编号为CGMCC NO.14894的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体；

所述ELISA试剂盒中还包含有：抗原包被液、封闭液、捕获抗原、二抗、阳性对照血清和阴性对照血清；

所述捕获抗原由如下方法制备而成：

将C型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上进行复苏，厌氧培养，选取厌氧培养后的单个的菌落接种至液体硫乙醇培养基进行増菌培养；然后将増菌液接种于改良的Gordon汤中，45℃培养4‑6h产毒，将培养物离心后过滤除菌，得到除菌后的C型产气荚膜梭菌外毒素；将外毒素进行纯化，即制备得到捕获抗原；

所述的血平板培养基成分为：100ml去离子水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5％体积比脱纤绵羊血；

所述改良的Gordon汤产毒培养基成分为：蛋白胨2g、糊精1g、酵母提取物2g、L‑精氨酸

1.2g、葡萄糖1g，最后PBS定容至100ml，浓盐酸调节pH为7.5，高温灭菌，即得。

4.根据权利要求3所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述抗原包被液为：0.1M碳酸盐缓冲液，pH 9.6。

5.根据权利要求3所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述封闭液的组成为：5g脱脂奶粉溶于100mlPBST中。

6.一种非疾病诊断目的的产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)包被：将保藏编号为CGMCC NO.14894的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体用抗原包被液稀释到0.3μg/ml，每孔100μL，加入到96孔酶标板，4℃密封过夜；

(2)封闭：将包被后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，洗涤后加入封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；

(3)加抗原：将封闭后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，干燥，每孔加入用PBS缓冲液稀释至

2μg/ml的捕获抗原100μL，37℃孵育1h；

(4)加待检血清：将步骤(3)处理后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，干燥，每孔加入用PBS缓冲液以1:160体积比稀释的待检血清，每孔100μL，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照，其中，阴性对照加入阴性对照血清，阳性对照加入阳性对照血清，空白对照加入PBS缓冲液；37℃孵育1h；

(5)加二抗：将步骤(4)处理后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，干燥，加入用PBS缓冲液按

1:8000体积比稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h；

(6)显色：将步骤(5)处理后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，干燥，加入TMB底物显色液100μL/孔，37℃条件下避光反应15min；

(7)终止：每孔加入100μL 2M H2SO4溶液终止反应，450nm处读取吸光值；

(8)结果判定：计算阴性样品平均值 与标准差(SD)，求得 为阳性临界值，为阴性临界值；测定待检血清的OD450nm，若待检血清的 为阳性，为阴性， 为可疑样品。

说明书

一种产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及动物免疫学技术领域，具体涉及一种产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法。

背景技术

[0002] 产气荚膜梭菌(C.perfringens)又称魏氏梭菌(C.welchii)，广泛存在于自然环境中，并见于几乎所有温血动物的消化道内，属于人和动物肠道内正常菌群的成员。产气荚膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犊、仔猪、家兔、雏鸡的坏死性肠炎、肠毒血症等疾病，发病急、死亡率高，是严重危害养殖业的重要疾病，是近年来我国家畜“猝死症”的主要病原，给各国畜牧业发展带来巨大经济损失。C型产气荚膜梭菌主要产生β毒素(CPB)，本菌能引起人类气性坏疽及多种动物的肠毒血症和坏死性肠炎，当家畜被感染后其体内产生β毒素抗体，因此β毒素抗体是诊断C产气荚膜梭菌病的重要依据之一。

[0003] 目前，检测产气荚膜梭菌β毒素抗体的方法主要有中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等，其中，中和试验检测产气荚膜梭菌毒素抗体的经典方法，虽然简单可靠，但费时费工；因此，中和试验不适合大规模样品的检测和基层使用。而ELISA检测具有操作简单快速、成本低廉、可同时检测大量样品等优点，因此，发展产气荚膜梭菌β毒素抗体的ELISA检测方法，能够为产气荚膜梭菌病的诊断、流行病学调查、疫苗免疫效果评价等提供有效工具。

[0004] 叶宝宏等建立了一种产气荚膜梭菌β毒素抗体的间接ELISA检测方法，其将原核表达重组质粒pET‑28α‑β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用IPTG进行诱导表达，表达产物经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后进行Western blot鉴定，用复性的β毒素重组蛋白作为包被抗原，通过优化间接ELISA试验条件，建立产气荚膜梭菌β毒素抗体的间接ELISA检测方法。但是该方法是以原核表达的重组蛋白作为抗原，抗原决定簇的暴露和展现较差，对β毒素抗体的检测敏感性有待进一步的提高。

发明内容

[0005] 针对上述现有技术，本发明的目的是建立一种产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法，用于产气荚膜梭菌β毒素抗体的检测、流行病学调查及疫苗免疫效果评价等。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 本发明的第一方面，提供一种杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC NO.14894。

[0008] 本发明所述杂交瘤细胞株由以下方法制备获得：

[0009] 利用纯化后的天然产气荚膜梭菌β毒素作为抗原免疫Balb/C小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，再进行阳性克隆与亚克隆的筛选，最终筛选出一株能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞2C8A，分类命名为产气荚膜梭菌beta毒素杂交瘤细胞，并于2017年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.14894。

[0010] 本发明的第二方面，提供一种单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC NO.14894的杂交瘤细胞株分泌产生。

[0011] 所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株的培养液中获得；或用杂交瘤细胞株接种到实验动物腹腔产生腹水而获得。

[0012] 采用本发明杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体，其特异性强、敏感性好、效价高。基于此，本发明的第三方面，提供上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备检测产气荚膜梭菌β毒素抗体的试剂盒中的应用。

[0013] 本发明的第四方面，提供一种检测产气荚膜梭菌β毒素抗体的ELISA试剂盒；所述试剂盒包含有保藏编号为CGMCC NO.14894的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

[0014] 进一步的，所述ELISA试剂盒中还包含有：抗原包被液、封闭液、捕获抗原、二抗、阳性对照血清和阴性对照血清。

[0015] 优选的，所述抗原包被液为：0.1M碳酸盐缓冲液，pH 9.6。

[0016] 优选的，所述封闭液的组成为：5g脱脂奶粉溶于100ml PBST中。

[0017] 优选的，所述捕获抗原由如下方法制备而成：

[0018] 将C型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上进行复苏，厌氧培养，选取厌氧培养后的单个的菌落接种至液体硫乙醇培养基进行増菌培养；然后将増菌液接种于改良的Gordon汤中，45℃培养4‑6h产毒，将培养物离心后过滤除菌，得到除菌后的C型产气荚膜梭菌外毒素；将外毒素进行纯化，即制备得到捕获抗原。

[0019] 进一步的，所述的血平板培养基成分为：100ml去离子水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5％体积比脱纤维绵羊血；

[0020] 所述改良的Gordon汤产毒培养基成分为：蛋白胨2g、糊精1g、酵母提取物2g、l‑精氨酸1.2g、葡萄糖1g，最后PBS定容至100ml，浓盐酸调节pH为7.5，高温灭菌，即得。

[0021] 优选的，所述二抗为HRP标记的羊抗兔IgG。

[0022] 本发明的第五方面，提供一种产气荚膜梭菌β毒素抗体捕获ELISA检测方法，包括以下步骤：

[0023] (1)包被：将保藏编号为CGMCC NO.14894的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体用抗原包被液稀释到0.3μg/ml，每孔100μL，加入到96孔酶标板，4℃密封过夜；

[0024] (2)封闭：将包被后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，洗涤后加入封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；

[0025] (3)加抗原：将封闭后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，干燥，每孔加入用PBS缓冲液稀释至2μg/ml的捕获抗原100μL，37℃孵育1h；

[0026] (4)加待检血清：将步骤(3)处理后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，干燥，每孔加入用PBS缓冲液以1:160体积比稀释的待检血清，每孔100μL，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照，其中，阴性对照加入阴性对照血清，阳性对照加入阳性对照血清，空白对照加入PBS缓冲液；37℃孵育1h；

[0027] (5)加二抗：将步骤(4)处理后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，干燥，加入用PBS缓冲液按1:8000体积比稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h；

[0028] (6)显色：将步骤(5)处理后的酶标板用PBST洗涤液洗涤，干燥，加入TMB底物显色液100μL/孔，37℃条件下避光反应15min；

[0029] (7)终止：每孔加入100μL 2M H2SO4溶液终止反应，450nm处读取吸光值；

[0030] (8)结果判定：计算阴性样品平均值 与标准差(SD)，求得 为阳性临界值， 为阴性临界值；测定待检血清的OD450nm，若待检血清的 为阳性，
为阴性， 为可疑样品。

[0031] 本发明的有益效果：

[0032] (1)本发明经多次筛选和克隆得到了一株杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株能够稳定、高效的分泌单克隆抗体，并能实现大规模批量生产。该单克隆抗体的特异性强、敏感性好、效价高，可用于酶联免疫吸附法(ELISA)检测产气荚膜梭菌β毒素抗体，具有样品操作简便、成本低廉、反应快速、灵敏度高、特异性强等特点。

[0033] (2)利用本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体制备的检测产气荚膜梭菌β毒素抗体的ELISA试剂盒具有特异性强、敏感性高和重复性好等优点。其中：本发明的ELISA试剂盒与天然β毒素血清抗体有较强的反应性，与用大肠杆菌、沙门氏菌，鸭疫里默氏杆菌抗体血清检测结果均为阴性，表明无交叉反应，特异性较强；与间接法相比，C型外毒素包被的间接ELISA法，测多种毒素抗体，本发明的ELISA试剂盒只测β毒素抗体，特异性强。

[0034] 将制得阳性血清测其血清滴度与经典小鼠中和实验做比较。将阳性血清按1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640连续倍比稀释后，进行ELISA检测，检测的血清滴度为
1:640。小鼠中和实验结果测得出0.1ml血清能中和400个毒素对小鼠的最小致死量，结果说明所建ELISA方法敏感性较高。

[0035] 分别从3次包被的96孔酶标板中随机抽取1块，检测临床上已知背景的血清10份。每份血清重复做3次，每次分别设1孔阴阳性对照。比较阴阳性血清的OD值，由批内和批间检测样品的重复性结果显示，批内变异系数为1.11％‑6.6％，批间变异系数为1.56％‑
6.85％，两者均小于10％，说明同一样品在同批和不同批试验中变异程度小，说明该方法具有很好的重复性。因为没有动物实验的个体差异，试验的稳定性好，且有利于动物福利保护。

附图说明

[0036] 图1：C型产气荚膜梭菌粗提外毒素蛋白SDS‑PAGE电泳分析图；图中，M为Maker，泳道1、2、3为样品；样品泳道在38KD处有产气荚膜梭菌主要的外毒素(β毒素)的明显条带。

[0037] 图2：小鼠腹水纯化后的SDS‑PAGE分析图；图中，M为Maker，泳道1、2为样品；样品泳道可以看到两条很明显的蛋白条带：53kD左右的重链和23kD左右的轻链，且并无其他杂带，结果表明其纯化的效果较好,其纯度均达到90％以上。

具体实施方式

[0038] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0039] 正如背景技术中所介绍的，现有产气荚膜梭菌β毒素抗体的ELISA检测方法是以原核表达的重组蛋白作为抗原，抗原决定簇的暴露和展现较差，对β毒素抗体的检测敏感性不足。基于此，本发明提供了一种能够稳定分泌识别产气荚膜梭菌β毒素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的特异性强、敏感性好、效价高，可用于酶联免疫吸附法(ELISA)检测产气荚膜梭菌β毒素抗体。

[0040] 在本发明的一个实施方案中，给出了所述杂交瘤细胞株的获得方法：利用纯化后的天然产气荚膜梭菌β毒素作为抗原免疫Balb/C小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，再进行阳性克隆与亚克隆的筛选，最终筛选出一株能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。

[0041] 在杂交瘤细胞株的获得过程中，融合后的杂交瘤的筛选是最为繁琐和复杂的，融合后的杂交瘤经培养一周后，然后将每个孔板中的细胞上清取出来，通过ELISA检测其是否分泌特异性抗体，抗体的分泌能力是否强，若检出阳性且分泌能力强的细胞，则需要将此阳性细胞进行多次亚克隆，才能得到阳性单克隆杂交瘤细胞株。在这一过程中，由于细胞变异和竞争，强阳性细胞很可能会被漏选，因此，获得能够持续、稳定、高效的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株的难度很大，且具有随机性和不可预测性。所以本发明将获得的杂交瘤细胞株进行了生物保藏，保藏编号为CGMCC NO.14894。

[0042] 由杂交瘤细胞株2C8A分泌产生的单克隆抗体能够与产气荚膜梭菌β毒素特异性结合，腹水中单抗的效价最高可达1:102400。

[0043] 采用本发明杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体，其特异性强、敏感性好、效价高，因此，可以用于制备检测产气荚膜梭菌β毒素抗体的试剂盒。

[0044] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

[0045] 实施例中所用的试剂及其来源：弗式完全佐剂与弗式不完全佐剂、Tween 20均购自美国Sigma公司；羊抗兔IgG‑HRP和羊抗小鼠IgG‑HRP均购自杭州华安生物技术有限公司；96孔酶标板购自Solarbio公司；厌氧肉肝汤、液体硫乙醇酸盐培养基购自青岛海博生物；可溶性TMB底物显色液购自天根生化科技有限公司；其他所用化学试剂均为分析纯。

[0046] 实施例中涉及的试剂如下：

[0047] 血平板培养基成分为：100ml去离子水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5％体积比脱纤绵羊血。

[0048] 改良的Gordon汤产毒培养基成分为：蛋白胨2g，糊精1g，酵母提取物2g，L‑精氨酸1.2g，葡萄糖1g，最后PBS定容至100ml，浓盐酸调节pH为7.45，高温灭菌，即得。

[0049] 抗原包被液为：0.1M碳酸盐缓冲液，pH 9.6。

[0050] PBS缓冲液成分为：1L去离子水、磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g、氯化钠(NaCl)：8g、氯化钾(KCl)0.2g，pH 7.4。

[0051] PBST洗涤液成分为：500μL Tween‑20溶解于1L的PBS中。

[0052] 封闭液成分为：5g脱脂奶粉溶于100mlPBST中。

[0053] 终止液(2M H2SO4)为：量取浓H2SO4 27.6ml加入到450ml去离子水中，混匀后定容至1L。

[0054] 实施例1：C型产气荚膜梭菌外毒素的制备与纯化

[0055] C型产气荚膜梭菌菌种(购自于英国微生物菌种保藏中心保藏(National Collection of Type Cultures)，保藏号：NCTC3180)接种于血平板培养基上进行复苏，37℃厌氧培养36h，挑取单个的菌落到硫乙醇酸盐营养肉汤增菌培养基中，在气体浓度为88％N2、7％H2、5％CO2的厌氧环境条件下38℃厌氧培养12h。将5mL C型产气荚膜梭菌增菌液接种到100ml pH7.5的产毒培养基中(每100mL PBS缓冲液溶解2g蛋白胨、1g糊精、2g酵母提取物和1.2gL‑精氨酸，1g葡萄糖)中，在厌氧环境下振荡培养，43℃培养5h高效产毒，然后在4℃
8000r/min离心15min，再用孔径0.22μm的蔡氏滤器中过滤除菌，即得到除菌后的C型产气荚
4.25
膜梭菌的外毒素。最终测得外毒素的LD50＝2 ，即将外毒素稀释19.03倍，腹腔注射1ml，能够使半数小鼠死亡。

[0056] 将除菌后的毒素溶液缓慢加入饱和硫酸铵溶液，最终使混合溶液中硫酸铵的体积浓度达到50％，4℃静置过夜；次日，将溶液8000r/min离心20min，弃掉上清，沉淀用适量0.05M Tris‑HCL缓冲液溶解，缓慢加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的最终浓度达到40％，重复上述操作，最后将沉淀溶解于Tris‑HCL中；接着用Sephadex‑G25柱层析对外毒素进行除盐纯化浓缩；将粗提纯化后的毒素蛋白经SDS‑PAGE电泳，分析蛋白纯度，结果显示分子量
38KD处有明显条带(如图1所示)，为主要致病外毒素β毒素；用分光光度计测定260nm和
280nm下的吸光度值，确定毒素蛋白浓度为：(1.45×A280－0.74×A260)×稀释倍数。

[0057] 实施例2：抗产气荚膜梭菌β毒素杂交瘤细胞的复苏及单克隆抗体的制备纯化；

[0058] 将产气荚膜梭菌β毒素的杂交瘤细胞株2C8A(保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC NO.14894)进行常规复苏、培养；选择6‑8周龄雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注射6
弗式不完全佐剂0.5mL/只致敏，一周后注射阳性杂交瘤细胞株2C8A，剂量0.5‑1×10个/只，7‑10天后收集小鼠腹水，得到大量产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体，腹水经正辛酸‑硫酸铵方法纯化，SDS‑PAGE检测纯化效果，结果如图2所示，图中1、2泳道样品可以看到两条很明显的蛋白条带：53kD左右的重链和23kD左右的轻链，且并无其他杂带，结果表明其纯化的效果较好,其纯度均达到90％以上，用分光光度计测定纯化单克隆抗体260nm和280nm下的吸光度值，确定毒素蛋白浓度为：(1.45×A280－0.74×A260)×稀释倍数。

[0059] 实施例3：抗产气荚膜梭菌β毒素多克隆抗体的制备

[0060] 将实施例1中得到除菌后的C型产气荚膜梭菌的外毒素中加入甲醛使其终浓度为0.3vt％，充分混匀后，37℃灭活96h，期间每隔5‑6h振荡摇晃一次；

[0061] 选取1.0‑1.5Kg健康未接种过疫苗的家兔5只，将灭活的上述β毒素2mL和弗氏完全佐剂按照体积1:1混合乳化，背部皮肤多点注射1mg/只；首免两周后，将灭活的外毒素2mL和弗氏不完全佐剂按照体积1:1混合乳化，注射剂量与方法同上；2周后同种方法进行三免；三免后2周用无佐剂抗原加强免疫，剂量与方法同上，所得高免血清作为捕获ELISA阳性对照血清；对照组注射生理盐水，并保证与实验组采取相同的免疫程序，同步进行实验，所得血清作为捕获ELISA阴性对照血清。

[0062] 实施例4：捕获ELISA检测方法的建立

[0063] 通过方阵滴定法确定包被抗体(实施例2所得)及抗原(实施例1所得)的最佳配对稀释浓度，以及被检抗体的最佳稀释浓度和酶标抗体的最佳稀释浓度，并对ELISA条件进行摸索和优化，最终确定如下体系：

[0064] (1)配对抗体及抗原最佳浓度的确定

[0065] 初步选择实施例2复苏并纯化的抗产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体作为捕获抗体，实施例1所提取纯化的外毒素作为结合抗原。为了确定包被抗体及抗原最佳浓度，先确定待检血清最佳稀释倍数及酶标二抗最佳稀释倍数的情况下，通过方阵实验进行最佳抗体配对的选择。将捕获抗体用包被液按体积比1:100稀释加入96孔酶标板第一列，并用包被液向下1:2倍比稀释至第十列，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。每孔加封闭液200μL，4℃封闭过夜，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。将制备的C型产气荚膜梭菌β毒素蛋白用PBS按体积1:100稀释加入96孔酶标板第一行并用PBS向下1:2倍比稀释至第八行每孔
100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。将阳性抗体血清用PBS缓冲液按体积比1：100稀释加入96孔酶标板每孔100μL并设置阴性对照。37℃孵育1h，PBST溶液洗涤3次，每次3min，拍干。加入用PBS缓冲液按1:8000体积比稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育
1h。加入可溶性TMB底物显色液，避光37℃显色15min，每孔加入100μL 2M H2SO4终止反应，在
450nm处用酶标仪测定每孔OD值。以P/N值作为选择抗体和抗原最佳配对浓度的依据。

[0066] 最终确定捕获抗体：抗产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体最佳稀释倍数为1:800即0.3μg/ml；抗原最佳工作浓度为2μg/mL。

[0067] (2)最佳包被液浓度的选择

[0068] 96孔酶标板第一、二列用0.01mol/L碳酸盐缓冲液，第三、四列用0.05mol/L碳酸盐缓冲液，第五、六列用0.1mol/L碳酸盐缓冲液，第七、八列用0.2mol/L碳酸盐缓冲液分别包被抗体。1、3、5、7行加入阳性样品，2、4、6、8行加入阴性样品对照。根据P/N值确定最佳包被条件。

[0069] 最终确定可得用0.1mol/L的碳酸盐缓冲液作为包被液效果最佳。

[0070] (3)包被抗体最佳孵育时间的确定

[0071] 将抗体用包被液稀释至工作浓度，同时设置阴性对照，分别置于37℃1h+4℃12h,4℃12h，37℃2h条件下孵育。根据P/N值确定抗体最佳包被条件。

[0072] 经比较和分析可得在包被抗体最佳孵育时间为4℃12h。

[0073] (4)最佳封闭条件的确定

[0074] 96孔酶标板第一、二列用5％脱脂奶粉，第三、四列用5％胎牛血清，第五、六列用1％BSA，1、3、5行加入阳性对照，2、4、6行加入阴性血清对照。根据P/N值确定最佳封闭条件。

[0075] 5％的脱脂奶粉作为封闭液效果最佳。

[0076] (5)最佳封闭时间的确定

[0077] 分别包被三个酶标板，每个酶标板的前四行加入阳性对照，后四行加入阴性对照，分别置于4℃12h，37℃2h，37℃1h+4℃12h条件下孵育。根据P/N值确定抗体最佳包封闭时间。

[0078] 最终确定最佳封闭时间为4℃12h。

[0079] (6)抗原最佳孵育时间的确定

[0080] 分别包被三个酶标板，每个酶标板的前四行加入阳性对照，后四行加入阴性对照，分别置于37℃30min，37℃1h，37℃2h条件下孵育。根据P/N值确定抗原最佳孵育时间。

[0081] 最终确定37℃1h是其最佳孵育时间。

[0082] (7)被检血清最佳稀释度的确定

[0083] 为了确定血清的最佳浓度，将阳性血清和阴性血清分别按1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280，1:2560，1:5120，1:10240，1:20480，1:40560分别稀释，各自加到两个96孔板，加入96孔板1‑12列，每个稀释度分别加一列8孔。测OD值，根据P/N值确定被检血清。

[0084] 通过阴阳性比值可确定当被检血清稀释倍数为1:160时P/N最大，而1:320所得数值波动最小，数值最为稳定，数值那么1：160即为它的最佳稀释倍数。

[0085] (8)被检血清最佳反应时间的确定

[0086] 将阳性血清和阴性血清按最佳稀释度稀释后加入包被好的96孔酶标板中，分别置于37℃30min，37℃2h，37℃1h条件下孵育。根据P/N值确定抗体最佳包封闭时间。

[0087] 最终通过阴阳性比值可确定被检血清的最佳孵育时间为37℃1h。

[0088] (9)酶标二抗最佳稀释倍数的确定

[0089] 分别按所摸索的最佳条件进行包板，将阳性血清和阴性血清按最佳稀释度加入到包被好的96孔酶标板孵育后，酶标二抗分别按1:2000，1:4000，1:8000，1:10000进行稀释测OD值，根据P/N值确定抗体最佳包封闭时间。

[0090] 最终通过阴阳性比值可确定酶标二抗最佳稀释倍数为1:8000。

[0091] (10)酶标二抗孵育时间的确定

[0092] 分别按所摸索的最佳条件进行包板，将阳性血清和阴性血清按最佳稀释度加入到包被好的96孔酶标板孵育后，加上最佳稀释倍数的酶标二抗分别置于37℃30min，37℃1h，37℃2h条件下孵育。根据P/N值确定抗体最佳孵育时间。

[0093] 通过阴阳性比值可确定酶标二抗最佳孵育时间为37℃1h。

[0094] (11)最佳显色时间的确定

[0095] 分别按所摸索的最佳条件进行包板孵育等过程，加显色液避光于室温下下孵育10min，15min，20min，37℃条件下孵育10min，15min，20min。并设立阴性对照，根据P/N值确定抗体最佳孵育时间。

[0096] 通过阴阳性比值可确定最佳显色时间为37℃15min.

[0097] 利用方阵滴定实验对捕获ELISA检测条件进行优化，最终确定如下反应体系：

[0098] (1)包被：将上述获得的产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体用抗原包被液稀释到0.3μg/ml，每孔100μL，加入到96孔酶标板，密封4℃过夜；

[0099] (2)封闭：用PBST洗涤液洗涤上述酶标板3次，每次3min，洗涤完成后，加入含5％Tween‑20脱脂奶粉的PBST溶液作为封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；

[0100] (3)加抗原：用PBST溶液洗涤上述酶标板3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS稀释至2μg/ml的捕获抗原100μL，37℃孵育1h；

[0101] (4)加待检血清：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS缓冲液以1:160体积比稀释的被检血清，100μL/孔，同时设置阴阳性和空白对照，PBS缓冲液作为空白对照，37℃孵育1h；

[0102] (5)加二抗：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，加入用PBS缓冲液按1:8000体积比稀释的HRP标记的羊抗兔IgG,37℃孵育1h；

[0103] (6)显色：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，最后加入可溶性TMB底物显色液100μL/孔，37℃条件避光反应15min；

[0104] (7)终止：每孔加100μL 2M H2SO4溶液终止反应，450nm处读取吸光值。

[0105] 实施例5：捕获ELISA检测方法临界值的确定

[0106] 用包被好的96孔板测33份阴性血清，按优化后的条件进行操作，进行ELISA检测。测OD值，计算平均值与标准差，求得 为阳性临界值， 为阴性临界值。运用建
立的捕获ELISA方法测定OD450nm， 为阳性， 为阴性，
为可疑样品。

[0107] 计算其平均值 与标准差SD＝0.018，求得 值为0.281， 值为0.299，所以当被检血清OD450nm<0.281时为阴性，OD450nm>0.299时为阳性，0.281

[0108] 实施例6：捕获ELISA方法性能评价

[0109] (1)特异性试验：运用建立好的捕获ELISA方法，检测产气荚膜梭菌β毒素抗体有较强的反应性，与用大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌分别免疫兔子所得血清进行捕获ELISA检测无交叉反应。

[0110] (2)灵敏度实验：上述所制得阳性血清测其血清滴度，与经典小鼠中和实验做比较。将阳性血清按1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1:1280连续倍比稀释后，进行ELISA检测，检测的血清滴度为1：640。

[0111] 将上述经除盐纯化的β外毒素分别用生理盐水倍比稀释，腹腔注射0.5mL，使全部小鼠死亡的最大稀释倍数时毒素的含量为小鼠的最小致死量。测得制备的毒素对小鼠的MLD为2μL。

[0112] 2倍致死量毒素与0.2mL 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1000稀释的高免血清混合，用生理盐水定容到1mL，放于37℃温箱2h，取0.5mL腹腔注射小鼠，观察小鼠存活情况。结果得出0.1mL血清能中和400个毒素对小鼠的最小致死量。

[0113] 由以上结果可以看出：本发明的ELISA检测方法具有良好的灵敏性。

[0114] (3)重复性实验：分别从3次包被的96孔酶标板中随机抽取1块，检测临床上已知背景的血清10份。每份血清重复做3次，每次分别设1孔阴阳性对照。比较阴阳性血清的OD值，由批内和批间检测样品的重复性结果显示，批内变异系数为1.11％‑6.6％，批间变异系数为1.56％‑6.85％，两者均小于10％，说明同一样品在同批和不同批试验中变异程度小，说明该方法具有很好的重复性。

[0115] 实施例7：具体应用

[0116] 1.运用建立好的捕获ELISA方法对来自山东泰安范镇某兔场内100份血清检测产气荚膜梭菌β毒素抗体，采用间接ELISA检测产气荚膜梭菌外毒素抗体方法作对照(孙佳芝，2014)。检测结果显示：间接ELISA检测85只兔的血清样品检测为阴性，15只为阳性，阳性率为15％；捕获ELISA法检测到90只兔的血清样品为阴性，10只为阳性，阳性率为10％。

[0117] 2.取上述方法所得10份阳性血清测其血清滴度与经典小鼠中和实验做比较。将阳性血清按1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640连续倍比稀释后，进行捕获ELISA检测，检测的血清滴度分1:320，1:320，1:160，1:160，1:160，1:320，1:320，1:320，1:320，1:320。

[0118] 将上述经除盐纯化的β外毒素分别用生理盐水倍比稀释，腹腔注射0.5mL，使全部小鼠死亡的最大稀释倍数时毒素的含量为小鼠的最小致死量。2倍致死量毒素(MLD上述已测得为2ul)与0.2mL 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1000稀释的高免血清混合，用生理盐水定容到1mL，放于37℃温箱2h，取0.5mL腹腔注射小鼠，观察小鼠存活情况。结果得出0.1mL血清分别能中和200个，200个，100个，100个，100个，200个，200个，200个，200个，200个对小鼠的最小致死量。

[0119] 综上说明该方法与间接ELISA方法相比较其检测阳性率稍低,但其特异性检测产气荚膜梭菌β毒素抗体，其阳性率较低是与事实相符的，说明其特异性强，对其他外毒素无反应，而间接ELISA检测产气荚膜梭菌外毒素抗体，且所针对的目标物为多种抗体的混合物，其阳性率高但是特异性差，因此结果是合理的；与经典小鼠中和实验进行比较，其敏感性较高；结果说明：所建立的捕获ELISA检测产气荚膜梭菌β毒素抗体方法可用于大批量样品检测，为畜禽产气荚膜梭菌病的诊断及研究提供了更快速、有效的工具，并为疫苗质量和食品安全监测的研究奠定了坚实的基础。

[0120] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。