甲型流感通用型病毒样颗粒及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种甲型流感通用型病毒样颗粒及其制备方法和应用，该病毒样颗粒是将3种融合蛋白分别嵌合在流感病毒M1表面制备成的，分别记作sHA‑VLPs、mHA‑VLPs、cHA‑VLPs，融合蛋白分别由流感病毒HA蛋白、M2e蛋白、NP蛋白和PBI蛋白的高度保守性序列或部分重组而成；该病毒样颗粒能用于预防特异性流感、虎流感同源病毒和异源病毒等方面；本发明病毒样颗粒的制备方法简单、成本低，病毒样颗粒免疫原性好、交叉保护性好，能满足大批量流感疫苗的制备需求，生物安全性、能激发基体对多种流感病毒的免疫。

权利要求

1.甲型流感通用型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，通过PCR法获得流感病毒M1蛋白的编码基因，对M1蛋白的编码基因与pFastBacdual载体的基因进行多克隆位点分析，选择pFastBacdual载体上提供而目的片段上没有的两个限制性内切酶位点，设计目的片段的引物，经过目的片段扩增、双酶切后回收目的片段，将目的片段插入pFastBacdual载体p10启动子后的多克隆位点中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pFastBacdual-M1质粒；

所述M1蛋白与pFastBacdual载体的酶切位点为SmaI和NsiI；

步骤2，通过基因合成技术获得sHA蛋白的编码基因，将sHA蛋白的编码基因与pFastBacdual-M1质粒的基因进行多克隆位点分析，选择pFastBacdual-M1质粒上提供而目的片段上没有的两个限制性内切酶位点，双酶切后回收目的片段，将目的片段插入pFastBacdual-M1质粒PH启动子后的多克隆位点，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pFastBacdual-M1-sHA蛋白穿梭质粒；

所述sHA蛋白的编码基因与pFastBacdual-M1质粒的酶切位点为EcoRI和NotI，所述sHA蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示，sHA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

步骤3，将pFastBacdual-M1-sHA蛋白穿梭质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组杆状病毒质粒Bacmid，使用重组杆状病毒质粒Bacmid转染Sf9昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，转染时Sf9昆虫细胞的汇合度达到80%以上；

步骤4，令Sf9昆虫细胞的浓度为2×106/mL以上，将重组杆状病毒按照MOI=3接种Sf9昆虫细胞，三天后收获上清得到甲型流感通用型病毒样颗粒。

2.根据权利要求1所述的甲型流感通用型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤3中获得重组杆状病毒质粒Bacmid的具体步骤如下：将10ng pFastBacdual-M1-sHA蛋白穿梭质粒加入DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min后在42℃下热激45s，然后冰浴2min，加入无抗LB培养基在37℃、转速200rpm下摇床振荡4h，取100µL振荡溶液涂布到含X-gal、IPTG的三抗LB平板上，在37℃下培养48h，蓝白斑筛选到的白斑即为重组杆状病毒质粒Bacmid。

3.根据权利要求1所述的甲型流感通用型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述甲型流感通用型病毒样颗粒的纯化选用蔗糖密度梯度离心法，具体过程如下：将接种重组杆状病毒的昆虫细胞培养72h后，收集悬浮细胞培养液在4℃、5000rpm转速下离心20min获得上清，将上清在4℃、30000rpm转速下超速离心1h进行浓缩，使用PBS重悬浓缩液并在4℃下过夜溶解，最后在20%-30%-60%的蔗糖中以转速30000rpm离心1h，经去蔗糖步骤后取30%-

60%梯度间的溶液30000rpm离心1h，沉淀重悬后为纯化的甲型流感通用型病毒样颗粒。

4.如权利要求1～3任一项所述甲型流感通用型病毒样颗粒的制备方法制备的甲型流感通用型病毒样颗粒，其特征在于，用于制备预防甲型流感病毒的疫苗。

说明书

甲型流感通用型病毒样颗粒及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物制药技术领域，特别是涉及一种甲型流感通用型病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 季节性流感在温带地区最冷的季节流行，在热带和亚热带地区全年流行，全球每年约有十亿人感染流感病毒，其中3-5百万人出现严重并发症，30-50万人死亡，同时流感病毒不断变异，当一种新型流感病毒出现时，大多数人没有免疫力，尤其是幼儿、老人、孕妇和免疫系统低下的易感群体，新型流感病毒避开机体免疫系统，很容易使人感染并在人与人之间传播形成大流行性疾病，历史上曾经出现多次世界范围内的流感大流行；1918年西班牙H1N1流感大流行曾导致4000万人受影响，1933年首次鉴定出人流感的病原，1957年H2N2亚洲流感，1968年H3N2香港流感，2009年H1N1都曾导致流感病毒大流行，2017-18年美国国立疾病预防控制中心报道了美国达3万人次流感发病，171人因流感死亡，与2003-2004年度相比，2017-2018年度每个年龄段的病人都出现受感程度加重，流感病毒的发病率和死亡率大幅上升。

[0003] 因此不断改进当前的流感疫苗，提高疫苗的保护力、广谱性和多季覆盖率，是当前流感疫苗研究的重点，为了应对随时可能出现的大规模流行流感，现在亟需研制出一针多防、具有广谱保护活性的通用型流感疫苗。

[0004] 为了应对流感病毒抗原的不断变化，世界卫生组织建立了全球流感监测和应对系统（GISRS），每年世界卫生组织咨询委员会根据全球流感监测应对系统监测到的数据预测出抗原漂移，决定疫苗的侯选株是否更新；目前市场上批准的流感病毒疫苗主要包括：灭活流感病毒裂解疫苗、重组流感疫苗和冷适应减毒活疫苗，无论哪种疫苗均包括3个/4个候选毒株即H1N1，H3N2，IBV的Victoria系或/和Yanagata系，灭活流感疫苗是将鸡胚繁殖出的完全病毒用福尔马林或β-丙内酯灭活，将灭活后的完全病毒进一步裂解纯化，去掉外来抗原和非特异性抗原，制成裂解疫苗，但目前市场上使用的灭活流感疫苗具有响应时间长、对鸡胚依赖性高、引入过敏原病毒易突变、高致病性毒株无法增殖等缺点，且目前的流感疫苗侯选毒株是预测得到的，可能与实际流行流感毒株不匹配，导致疫苗效力低等问题；利用昆虫杆状病毒表达系统表达的流感病毒样颗粒制备流感疫苗成为当前研发热点，昆虫杆状病毒表达系统可同时表达流感病毒的几种结构蛋白并完成装配形成病毒样颗粒，病毒样颗粒由病毒的特异蛋白组装而成，但不含该病毒核酸成份，在外表面抗原构象上与本体病毒相似，因而引起了体液和细胞免疫刺激，具有生物安全性高、成本低、产量高的优点。

[0005] 目前流感病毒样颗粒中包含的流感结构蛋白成份均为完整的天然蛋白结构，比如HA蛋白和M1蛋白共表达或HA-NA-M1共感染的病毒样颗粒，这样的病毒样颗粒免疫原性高，但产生的免疫保护力为窄谱的，对异源毒株不能起到交叉保护作用。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种甲型流感通用型病毒样颗粒及其制备方法和应用，以提高甲型流感通用型病毒样颗粒的产量、降低生产成本，通过合理选择融合蛋白片段，提高病毒样颗粒的免疫原性和交叉保护作用，能够应用于预防特异性流感、虎流感同源病毒及异源病毒方面，适应性强。

[0007] 本发明所采用的技术方案是，甲型流感通用型病毒样颗粒是将3种融合蛋白分别嵌合展示在流感病毒M1蛋白表面制成的，分别记作sHA-VLPs、mHA-VLPs、cHA-VLPs；

[0008] 3种融合蛋白分别是sHA蛋白、mHA蛋白和cHA蛋白；

[0009] 所述sHA蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示，sHA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

[0010] 所述mHA蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示，mHA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

[0011] 所述cHA蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示，cHA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0012] 甲型流感通用型病毒样颗粒的制备方法包括以下步骤：

[0013] 步骤1，通过PCR法获得流感病毒M1蛋白的编码基因，对M1蛋白的编码基因与pFastBacdual载体的基因进行多克隆位点分析，选择pFastBacdual载体上提供而目的片段上没有的两个限制性内切酶位点，设计目的片段的引物，经过目的片段扩增、双酶切后回收目的片段，将目的片段插入pFastBacdual载体p10启动子后的多克隆位点中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pFastBacdual-M1质粒；

[0014] 步骤2，通过基因合成技术获得sHA蛋白、mHA蛋白和cHA蛋白的编码基因，将sHA蛋白、mHA蛋白和cHA蛋白的编码基因与pFastBacdual-M1质粒的基因进行多克隆位点分析，选择pFastBacdual-M1质粒上提供而目的片段上没有的两个限制性内切酶位点，双酶切后回收目的片段，将目的片段插入pFastBacdual-M1质粒PH启动子后的多克隆位点，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pFastBacdual-M1-融合蛋白穿梭质粒；

[0015] 步骤3，将pFastBacdual-M1-融合蛋白穿梭质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组杆状病毒质粒Bacmid，使用重组杆状病毒质粒Bacmid转染Sf9昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，转染时Sf9昆虫细胞的汇合度达到80%以上；

[0016] 步骤4，将重组杆状病毒按照MOI=3接种Sf9昆虫细胞，三天后收获上清得到甲型流感通用型病毒样颗粒。

[0017] 进一步的，所述M1蛋白与pFastBacdual载体的酶切位点为SmaI和NsiI，融合蛋白sHA、mHA和cHA的编码基因与pFastBacdual-M1质粒的酶切位点为EcoRI和NotI。

[0018] 进一步的，所述步骤3中获得重组杆状病毒的具体步骤如下：将10ng pFastBacdual-M1-融合蛋白穿梭质粒加入DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min后在42℃下热激45s，然后冰浴2min，加入无抗LB培养基在37℃、转速200rpm下摇床振荡4h，取100µL振荡溶液涂布到含X-gal、IPTG的三抗LB平板上，在37℃下培养48h，蓝白斑筛选到的白斑即为重组杆状病毒质粒Bacmid。

[0019] 进一步的，所述步骤4接种重组杆状病毒时Sf9昆虫细胞的浓度为2×106/mL以上。

[0020] 进一步的，所述甲型流感通用型病毒样颗粒的纯化选用蔗糖密度梯度离心法，具体过程如下：将接种重组杆状病毒的昆虫细胞培养72h后，收集悬浮细胞培养液在4℃、5000rpm转速下离心20min获得上清，将上清在4℃、30000rpm转速下超速离心1h进行浓缩，使用PBS重悬浓缩液并在4℃下过夜溶解，最后在20%-30%-60%的蔗糖中以转速30000rpm离心1h，经去蔗糖步骤后取30%-60%梯度间的溶液30000rpm离心1h，沉淀重悬后为纯化的病毒样颗粒。

[0021] 甲型流感通用型病毒样颗粒用于制备预防特异性流感、虎流感同源病毒及异源病毒的疫苗。

[0022] 本发明的有益效果是：本发明利用杆状病毒昆虫表达系统作为表达载体、利用细胞作为生物反应器生产甲型流感病毒样颗粒，具有产量高、生产成本低的优点，生产的甲型流感病毒样颗粒免疫原性好、交叉保护性好，能够用于大量制备流感疫苗，且无生物安全风险等问题，能够激发基体对多种流感病毒的免疫。

附图说明

[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0024] 图1是mHA蛋白、sHA蛋白、cHA蛋白的基因构成示意图。

[0025] 图2：A是以HA兔多抗为一抗获得的VLPs(HA-M1)免疫萤光图，B是以HA兔多抗为一抗获得的sHA-VLPs免疫萤光图，C是以HA兔多抗为一抗获得的mHA-VLPs免疫萤光图，D是以HA兔多抗为一抗获得的cHA-VLPs免疫萤光图，E是以M1鼠单抗为一抗获得的VLPs(HA-M1)免疫萤光图，F是以M1鼠单抗为一抗获得的sHA-VLPs免疫萤光图，G是以M1鼠单抗为一抗获得的mHA-VLPs免疫萤光图，H是以M1鼠单抗为一抗获得的cHA-VLPs免疫萤光图。

[0026] 图3：A是VLPs(HA-M1)的电镜图，B是病毒样颗粒sHA-VLPs的电镜检测图，C是病毒样颗粒mHA-VLPs的电镜检测图，D是病毒样颗粒cHA-VLPs的电镜检测图。

[0027] 图4：A是用M1鼠单抗作一抗4种VLPs的蛋白印迹图，B是VLPs(HA-M1)和mHA-VLPs的蛋白印迹图，C是sHA-VLPs和cHA-VLPs的蛋白印迹图，D是用NP、M2鼠单抗作一抗时4种VLPs的蛋白印迹图，E是4种VLPs的蛋白印迹图。

[0028] 图5A是检测免疫针对H1N1的特异性抗体水平。

[0029] 图5B是检测免疫针对H3N2的特异性抗体水平。

[0030] 图5C是检测免疫针对H5N1的特异性抗体水平。

[0031] 图5D是检测免疫针对H7N7的特异性抗体水平。

[0032] 图5E是IgG1和IgG2a抗体的检测图。

[0033] 图6A是H1N1攻毒组小鼠的体重变化图。

[0034] 图6B是H1N1攻毒组小鼠的生存率变化图。

[0035] 图6C是H3N2攻毒组小鼠的体重变化图。

[0036] 图6D是H3N2攻毒组小鼠的生存率变化图。

[0037] 图6E是H5N1攻毒组小鼠的体重变化图。

[0038] 图6F是H5N1攻毒组小鼠的生存率变化图。

[0039] 图6G是H7N7攻毒组小鼠的体重变化图。

[0040] 图6H是H7N7攻毒组小鼠的生存率变化图。

[0041] 图7A是H5N1刺激下IL-4的分泌情况图。

[0042] 图7B是H5N1刺激下IFN-γ的分泌情况图。

[0043] 图8是流感病毒滴度检测图。

具体实施方式

[0044] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0045] 甲型流感通用型病毒样颗粒是将3种融合蛋白分别嵌合展示在流感病毒M1蛋白表面制备而成的，分别记作sHA-VLPs、mHA-VLPs、cHA-VLPs，融合蛋白sHA蛋白、mHA蛋白和cHA蛋白的基因构成如图1所示，融合蛋白分别由流感病毒HA蛋白、M2e蛋白、NP蛋白、PBI蛋白的高度保守性序列全部或部分重组而成。

[0046] 融合蛋白sHA蛋白从N端到C端的序列构成为：蜂毒信号肽+NP蛋白的两段保守序列+5个来自不同亚型、不同种属的M2e蛋白+HA2蛋白，序列间用连接肽连接，sHA蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示，sHA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

[0047] 融合蛋白mHA蛋白从N端到C端的序列构成为：蜂毒信号肽+HA蛋白的3段保守序列，3端保守序列分别是：HA1蛋白的E14-H37、HA1蛋白的N286-N319和HA2蛋白的T41-S113，序列间用连接肽连接，mHA蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示，mHA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

[0048] 融合蛋白cHA蛋白从N端到C端的序列构成为：蜂毒信号肽+HA1蛋白E14-H37间的保守序列+NP蛋白的2段保守序列+5个来自不同亚型、不同种属的M2e蛋白+HA蛋白的两段保守序列+HA跨膜区，HA蛋白的两端保守序列是HA1蛋白的N286-N319和HA2蛋白的T41-S113，序列间用连接肽连接，cHA蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示，cHA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0049] 本发明参考不同流感病毒HA蛋白的保守区域、M2蛋白的保守区域M2e、NP蛋白保守区域进行串联表达，并结合HA蛋白的跨膜区和胞内区重组获得融合蛋白，将融合蛋白展示在病毒样颗粒表面，以构建不同的甲型流感通用型病毒样颗粒，该病毒样颗粒相比于单独短肽具有更好的免疫原性，能更好的刺激机体产生体液免疫和细胞免疫。

[0050] 甲型流感通用型病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

[0051] 步骤1，构建重组pFastBacdual-M1质粒：通过PCR法获得流感病毒M1蛋白的编码基因，对M1蛋白的编码基因与pFastBacdual载体的基因进行多克隆位点分析，选择pFastBacdual载体上提供而目的片段上没有的两个限制性内切酶位点，设计目的片段的引物，经过目的片段扩增、双酶切后回收目的片段，将目的片段插入pFastBacdual载体p10启动子后的多克隆位点中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pFastBacdual-M1质粒；

[0052] 步骤2，构建重组穿梭质粒：通过基因合成技术获得融合蛋白sHA、mHA和cHA编码基因，将融合蛋白sHA、mHA和cHA的编码基因与pFastBacdual-M1质粒的基因进行多克隆位点分析，选择pFastBacdual-M1质粒上提供而融合蛋白上没有的两个限制性内切酶位点，双酶切后回收融合蛋白的目的片段插入pFastBacdual-M1质粒的PH启动子后的多克隆位点中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pFastBacdual-M1-融合蛋白穿梭质粒；

[0053] 步骤3，构建重组杆状病毒质粒与重组杆状病毒拯救：将pFastBacdual-M1-融合蛋白穿梭质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组杆状病毒质粒Bacmid，使用重组杆状病毒质粒Bacmid转染Sf9昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，转染时Sf9昆虫细胞的汇合度达到80%以上；

[0054] 步骤4，制得甲型流感通用病毒样颗粒：将重组杆状病毒按MOI=3接种Sf9昆虫细胞，3天后收获上清，即得甲型流感通用型病毒样颗粒，接种重组杆状病毒时Sf9昆虫细胞的浓度需达到2×106/mL。

[0055] 本发明在步骤1中M1蛋白与pFastBacdual载体的酶切位点为SmaI和NsiI，步骤2中融合蛋白sHA、mHA和cHA的编码基因与pFastBacdual-M1质粒的酶切位点为EcoRI和NotI。

[0056] 本发明步骤3中pFastBacdual-M1-融合蛋白穿梭质粒的分子克隆由常规转化DH5α感受态细胞克隆得到；获得重组杆状病毒质粒的具体步骤如下：将10ng pFastBacdual-M1-融合蛋白穿梭质粒加入DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min后在42℃下热激45s，然后冰浴2min，加入无抗LB培养基在37℃、转速200rpm下摇床振荡4h，取100µL振荡溶液涂布到含X-gal、IPTG的三抗LB平板上，在37℃下培养48h，蓝白斑筛选到的白斑即为重组杆状病毒质粒Bacmid，通过DNA的转座实现DH10Bac感受态细胞中空白杆粒与pFastBacdual-M1-融合蛋白穿梭质粒间的DNA同源重组。

[0057] 病毒样颗粒的纯化方法选用蔗糖密度梯度离心法，具体过程如下：将接种重组杆状病毒的昆虫细胞培养72h后，收集悬浮细胞培养液在4℃、5000rpm转速下离心20min去除细胞碎片、获得上清，将上清在4℃、30000rpm转速下超速离心1h进行浓缩，使用PBS重悬浓缩液并在4℃下过夜溶解，最后在20%-30%-60%的蔗糖中以转速30000rpm离心1h，经去蔗糖步骤后取30%-60%梯度间的溶液30000rpm离心1h，沉淀重悬后为纯化的病毒样颗粒。

[0058] 实施例1

[0059] 选用以下材料对本发明的病毒样颗粒制备方法和应用进行验证。

[0060] H1N1流感病毒鼠适应株A/Changchun/01/2009(H1N1,group1)，H3N2流感病毒鼠适应株A/baikalteal/Shanghai/SH-89/2013(H3N2,group2)，H5N1禽流感病毒A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(H5N1,clade2.3.2.1;group1)，H7N7流感病毒鼠适应株A/Lesser White-fronted goose/HuNan/412/2010(H7N7,group2)，以上材料均由军事医学科学院军事医学研究院军事兽医研究所病毒室提供；主要试剂E.coli DH5α和E.coli DH10Bac由本实验室保存，供体质粒pFastBacdual载体购自Invitrogen公司，融合蛋白基因合成由金唯智公司提供，重组质粒基因测序和引物合成等技术服务由长春库美生物提供，昆虫细胞转染试剂盒购自Invitrogen公司，核酸内切酶购自Thermo公司，基因组提取试剂盒购自AXYGEN公司，Sf-900Ⅱ SFM购自Thermo公司，抗生素等购自索莱宝公司，HA兔多抗购自北京义翘神州生物公司，M2鼠单抗、NP鼠单抗购自abcam公司，M1鼠单抗购自苏州杰恩公司。

[0061] 实验方法如下：

[0062] S1，将H5N1病毒中提取的RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板、分别用H5N1的HA蛋白引物和M1蛋白引物进行PCR扩增得到HA蛋白和M1蛋白片段，SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16为HA蛋白片段的扩增引物，SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18为M1蛋白的扩增引物，使用基因合成得到融合蛋白sHA、mHA、cHA的基因片段，PCR扩增过程为95℃维持5min后95℃维持30s，转56℃维持90s再72℃维持1min，共进行30个循环；

[0063] 使用SmaI和NsiI酶切位点将得到的M1蛋白基因克隆到质粒pFastBacdual中，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂板过夜培养，筛选阳性菌，经质粒PCR、测序和酶切鉴定，得到正确的pFastBacdual-M1质粒；

[0064] S2，使用SalI和NotI酶切位点将得到的HA蛋白基因克隆到pFastBacdual-M1质粒中，得到正确的pFastBacdual-HA-M1质粒；

[0065] 以酶切位点EcoRI和NotI得到pFastBacdual-sHA-M1质粒、pFastBacdual-mHA-M1质粒、pFastBacdual-cHA-M1质粒，SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14分别为鉴定sHA蛋白、mHA蛋白、cHA蛋白片段的PCR上下游引物；

[0066] S3，构建重组杆状质粒：

[0067] 使用pFastBacdual-HA-M1质粒转化DH10Bac感受态细胞，从细菌生长产生的蓝白斑菌落中挑选白斑，提取质粒PCR鉴定正确，得到重组杆状质粒HA-M1-Bacmid，用相同的方法得到sHA-M1-Bacmid、mHA-M1-Bacmid、cHA-M1-Bacmid；

[0068] S4，拯救重组杆状病毒：

[0069] 将鉴定阳性的4种Bacmid质粒用Cellreagent转染试剂盒转入Sf9细胞，27℃培养三天后，收集细胞培养上清P1，将P1按3％的体积比接种到新的Sf9细胞中，继续培养以扩增病毒毒力，培养三天收集P2代上清，将P2按3％的体积比接种到新的Sf9细胞中，继续培养三天后收集P3代上清，提取P3代上清中的DNA进行PCR验证，并观察记录P3代细胞形态变化，用间接免疫荧光对P3代细胞进行表达鉴定，图2A～图2D分别为以HA兔多抗为一抗使用间接免疫荧光法获得的4种杆状病毒感染的Sf9细胞的检验图，图2E～图2H分别为以M1鼠单抗为一抗使用间接免疫荧光法获得的4种杆状病毒感染的Sf9细胞的检验图，由图2A～图2H发现4种杆状病毒感染的P3代Sf9细胞均有强烈的绿色荧光表达，说明4种病毒样颗粒有相应蛋白的表达；

[0070] S5，大量表达与纯化病毒样颗粒：

[0071] 用Takara公司的快速杆状病毒滴度检测试剂盒测定P3代杆状病毒滴度，用P3代杆状病毒按MOI=3接种大量培养的悬浮Sf9细胞，4天后收取细胞培养液，经去细胞碎片→离心浓缩→蔗糖密度梯度离心→去蔗糖等一系列步骤后得到纯化的病毒样颗粒；

[0072] （1）使用Western blot验证实施例制备的4种病毒样颗粒；

[0073] 用HA兔多抗作为一抗进行Western blot验证，发现VLPs(HA-M1)在70KD左右有条带，mHA-VLPs在23KD左右有条带如图4B所示，sHA-VLPs和cHA-VLPs在50KD左右有条带如图4C、图4E所示，说明4种VLPs的融合蛋白表达正确；

[0074] 用M1鼠单抗作为一抗进行Western blot验证，验证结果如图4A所示，发现4种VLPs均在30KD左右有条带，说明4种VLPs的M1蛋白表达正确；

[0075] 用NP、M2鼠单抗作为一抗进行Western blot验证，验证结果如图4D所示，发现4种VLPs中只有sHA-VLPs和cHA-VLPs在50KD左右有条带，说明4种VLPs中sHA-VLPs和cHA-VLPs的融合蛋白表达正确；

[0076] （2）使用透射电镜观察4种病毒样颗粒；

[0077] 在透射电镜下观察VLPs(HA-M1)，观察结果如图3A所示，观察到大小约100nm的类球形粒子，且球形周围有茎突结构，说明VLPs(HA-M1)组装正确；以HA多抗为一抗对3种通用病毒样颗粒sHA-VLPs、mHA-VLPs、cHA-VLPs作免疫电镜检测，检测结果如图3B～图3D所示，在电镜下观察到这3种病毒样颗粒为大小100nm左右的颗粒，且颗粒周围被金颗粒标记，说明组装成了3种甲型流感通用型病毒样颗粒。

[0078] 实施例2

[0079] 选用以下材料研究本发明甲型流感通用病毒样颗粒的免疫性能，BCA蛋白检测试剂盒购自Thermo公司，4种灭活流感病毒样颗粒自行纯化，HPR标记山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a购自Southern Biotechnology公司，小鼠IFN-γ和IL-4的ELISApot检测试剂盒购自Mabtech公司，TMB购自Sigma公司，6-8周龄的BALB/c雌性小鼠购自北京维通利华公司；

[0080] 1、实验的具体过程如下：

[0081] S1，免疫和攻毒：

[0082] 用BCA检测试剂盒检测流感病毒样颗粒的蛋白浓度，在0周和3周给小鼠肌肉注射0.1mL含有10µg病毒样颗粒的疫苗，VLPs(HA-M1)为免疫对照组，PBS组为Mock组，在第二次免疫两周后用异氟烷麻醉小鼠，以10MLD50同源病毒(A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012，H5N1，clade2.3.2.1；group1)和异源病毒(mouse-adapted A/Changchun/01/2009，H1N1，group1)、(mouse-adapted A/baikal teal/Shanghai/SH-89/2013，H3N2，group2)、(mouse-adapted A/Lesser White-fronted goose/HuNan/412/2010，H7N7，group2)攻击Mock组、对照组VLPs(HA-M1)和实验组(sHA-VLPs,mHA-VLPs,cHA-VLPs)，进行小鼠滴鼻攻毒，所有的试验条件和试验程序都遵从国际疼痛研究协会的道德准则；

[0083] S2，特异性IgG抗体检测：

[0084] 在小鼠免疫后0周、3周、5周眼眶采血，采取的血液于室温放置2h后经3000rpm离心10min，分离出上层血清于-80℃储存；用ELISA试验检测血清中的流感病毒特定的IgG、IgG1和IgG2a，用灭活的H1N1流感病毒鼠适应株A/Changchun/01/2009(H1N1，group1)，H3N2流感病毒鼠适应株A/baikalteal/Shanghai/SH-89/2013(H3N2，group2)，H5N1禽流感病毒A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(H5N1，clade 2.3.2.1；group1)，H7N7流感病毒鼠适应株A/Lesser White-fronted goose/HuNan/412/2010(H7N7，group2)的病毒以5µg/mL在4℃过夜包覆96孔板、用5%的脱脂牛奶室温封闭2h，在96孔板中加入稀释好的血清样品37℃孵育
1.5h，用PBST清洗后再用HRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a在37℃孵育1h，用PBST清洗后加入TMB在25℃作用30min，之后加入50µL 0.5mol/L的H2SO4终止反应，用分光光度计在
450nm处检测结果；

[0085] S3，攻毒保护实验：攻毒后15天内观察各组小鼠体重变化和生存率变化，实验各组小鼠的体重变化和生存率变化情况如图6A～图6H所示；

[0086] S4，使用ELISApot检测细胞因子，具体过程如下：

[0087] 用ELISApot检测由病毒样颗粒诱导的病毒活化的抗原特异性T细胞，由IL-4单抗和IFN-γ单抗预包覆96孔板，每孔铺1×106个攻毒后第4天分离的脾细胞，每组3只老鼠，每只老鼠6个复孔（其中3个复孔加刺激物，另外3个为对照孔），刺激物为灭活的H5N1病毒样颗粒，刺激物终浓度为10µg/mL，用含有10%FBS的1640培养基37℃、5%CO2培养48h，弃去孔中细胞，按照ELISApot检测试剂盒的步骤进行酶联斑点检测，最后用ELISApot阅读系统计算斑点形成单位；

[0088] S5，使用以下步骤进行肺的病毒滴定：

[0089] 肺匀浆按1:10，1:102，…，1:1010稀释后接种鸡胚，每个稀释度接种3枚9日龄SPF级鸡胚，每枚鸡蛋接种100µL肺匀浆，封上不干胶后于37℃孵育48h，48h后检测尿囊液血凝结果，每枚鸡蛋取50µL尿囊液与50µL1%的鸡红细胞悬液混合，15min后观察记录结果，并用Reed-Muench法计算每只老鼠肺脏研磨液的鸡胚半数感染量EID50。

[0090] 2、实验结果

[0091] （1）甲型流感通用病毒样颗粒在小鼠体内激发的免疫应答检测结果；

[0092] 分别检测免疫第0、3、5周的小鼠血清中的针对同源病毒和异源病毒的特异性抗体水平，同源病毒(A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012，H5N1，clade)的检测结果如图5C所示、3种异源病毒(mouse-adapted A/Changchun/01/2009，H1N1，group1)、(mouse-adapted A/baikalteal/Shanghai/SH-89/2013，H3N2，group2)、(mouse-adapted A/Lesser White-fronted goose/HuNan/412/2010，H7N7，group2)的检测结果分别如图5A、图5B、图5D所示；图5A～图5D中特异性IgG抗体水平随着免疫周数的增长而增长，表明有特异性抗体的产生，和对照组VLPs(HA-M1)相比，如图5A和图5D所示sHA-VLPs针对H1N1和H7N7的特异性抗体水平有显著性升高，如图5B所示mHA-VLPs针对H3N2的特异性抗体水平有显著性升高，如图5C所示cHA-VLPs针对H5N1的特异性抗体水平有显著性升高，4种病毒样颗粒中sHA-VLPs组刺激机体产生的针对4种流感病毒的特异性抗体都保持在高水平，sHA-VLPs具有更好的广谱性；对所有免疫组的第五周血清的IgG1和IgG2a抗体亚型进行检测，如图5E所示，所有免疫组针对H5N1抗原的IgG1的滴度比IgG2a的滴度高，说明病毒产生特异性免疫反应的抗体以IgG1为主，而在VLPs的免疫效果评估中，IgG1/IgG2a水平高说明比起细胞免疫，VLPs主要诱导产生体液免疫来起到保护作用。

[0093] （2）甲型流感通用病毒样颗粒的攻毒保护研究；

[0094] H1N1攻毒组小鼠的体重变化率和生存率变化曲线如图6A、图6B所示，H3N2攻毒组小鼠的体重变化率和生存率变化曲线如图6C、图6D所示，H5N1攻毒组小鼠的体重变化率和生存率变化曲线如图6E、图6F所示，H7N7攻毒组小鼠的体重变化率和生存率变化曲线如图6G、图6H所示，由图6A、图6C、图6E、图6G可知各攻毒组小鼠的体重变化率区别较小，但在H3N2攻毒组mHA-VLPs表现出较小的体重损失；

[0095] 由图6B可知H1N1攻毒组除了sHA-VLPs和mHA-VLPs的生存率分别为60%和20%以外，其余各组均无存活；由图6D可知H3N2攻毒组mHA-VLPs组的存活率为60%，sHA-VLPs组和对照组VLPs(HA-M1)的存活率均为20%，cHA-VLPs和Mock组无存活；由图6F可知H5N1攻毒组中对照组VLPs(HA-M1)、mHA-VLPs组和cHA-VLPs组存活率均为40%，sHA-VLPs组存活率为20%，Mock组无存活；由图6H可知H7N7攻毒组中对照组VLPs(HA-M1)和cHA-VLPs组存活率均为80%，sHA-VLPs组和mHA-VLPs组存活率分别为60%和50%，Mock组无存活；通过体重率和存活率检测结果可知，sHA-VLPs和mHA-VLPs两组针对同源和异源流感病毒的广谱保护效果较好。

[0096] （3）甲型流感通用型病毒样颗粒能激活特异的T淋巴细胞；

[0097] 在小鼠攻毒后第四天分离脾淋巴细胞，并用H5N1灭活抗原刺激，然后检测特异性的IL-4（Th2型免疫反应）的分泌情况检测结果如图7A所示，在灭活病毒的刺激下，cHA-VLPs组相比对照组VLPs(HA-M1)能产生更高的IL-4水平，IFN-γ（Th1型免疫反应）的分泌情况检测如图7B所示，mHA-VLPs组相比对照组VLPs(HA-M1)能产生更高的IFN-γ水平，相比之下IL-4的表达量在所有免疫组中比IFN-γ的表达量高，说明T淋巴细胞以Th2型细胞免疫为主。

[0098] （4）甲型流感通用病毒样颗粒能抑制流感病毒的复制；

[0099] 如图8所示，取攻毒后第四天的小鼠肺脏，在9日龄SPF鸡胚中进行各型流感病毒的病毒滴度测定，除H5N1病毒外，其余3种异源病毒的实验组相比对照组病毒滴度下降的总体趋势与攻毒保护实验一致的；H5N1病毒滴度测定中，sHA-VLPs组和cHA-VLPs组病毒滴度比对照组VLPs (HA-M1)有显著下降，表明sHA-VLPs组和cHA-VLPs组颗粒能够抑制流感病毒在小鼠肺中的复制。

[0100] 3种甲型流感通用病毒样颗粒中，sHA-VLPs组的综合免疫保护作用较好，sHA-VLPs组能针对多种异源流感病毒产生高水平的攻毒保护率和特异性IgG抗体，抑制流感病毒的复制，通用型病毒样颗粒的免疫保护作用以体液免疫为主。

[0101] 本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

[0102] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。