一种展示抗体的铁蛋白纳米材料及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种展示抗体的铁蛋白纳米材料，所述的铁蛋白纳米材料包括：包裹金属氧化物内核的铁蛋白笼，以及连接在铁蛋白笼外表面的结合抗体Fc结构域的蛋白。该铁蛋白纳米材料的抗体展示效率很高，解决了传统铁蛋白直接与抗体融合表达造成的抗体结构改变的难题，且铁蛋白纳米材料自带金属氧化物标签，无需再在需结合的抗体自身携带标签，简化后续蛋白纯化、定量、定位的步骤。

权利要求

1.一种展示抗体的铁蛋白纳米材料，其特征在于，所述的铁蛋白纳米材料包括：

包裹金属氧化物内核的铁蛋白笼，以及连接在铁蛋白笼外表面的结合抗体Fc结构域的蛋白，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白选自蛋白A，其中，1个铁蛋白与1个蛋白A通过连接肽连接在铁蛋白的N端，包括有铁蛋白笼以及连接在铁蛋白笼外表面的结合抗体Fc结构域的蛋白称为融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料，其特征在于，所述的铁蛋白笼由

12或24个铁蛋白单体组成，所述的铁蛋白单体选自天然或变体的人铁蛋白H亚基、人铁蛋白L亚基、哺乳动物铁蛋白H亚基、哺乳动物铁蛋白L亚基、植物铁蛋白或微生物铁蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料，其特征在于，所述的连接肽由10-20个氨基酸组成，所述的10-20个氨基酸为丝氨酸和甘氨酸的排列组合。

4.根据权利要求1-2任一所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料，其特征在于，所述的金属氧化物内核粒径为1-8nm，所述的金属氧化物化学式为Fe(3-x)MxO4 ，其中0≤x≤3，或Fe(2-x)MxO3，其中0≤x≤2，其中，所述的M选自Mn、Cu、Zn、Ni、Gd或Co。

5.一种权利要求1-4任一所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料的制备方法，其特征在于，包括将金属盐类和氧化剂加入所述融合蛋白的溶液中进行反应，其中，金属离子与氧化剂的摩尔比为1:0.33-0.5，所述融合蛋白与金属离子的摩尔比为1:100-40000。

6.根据权利要求5所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料的制备方法，其特征在于，所述的氧化剂为H2O2，所述反应的条件为pH 8-10，温度50-85℃，金属盐类的浓度为10-200mM，氧化剂的浓度为5-100mM，融合蛋白浓度为0.25-2mg/mL，金属盐类的加液速度为每分钟每个融合蛋白10-200个金属离子。

7.根据权利要求5或6所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A）将结合抗体Fc结构域的蛋白A的编码基因与铁蛋白单体编码基因连接制备融合基因；

B）将步骤A）制备的融合基因连接至载体pET22b上；

C）将步骤B）获得的含有融合基因的载体转化到BL21(DE3)细胞中，培养，并利用IPTG诱导表达融合蛋白；

D）破碎步骤C）表达融合蛋白的细胞释放融合蛋白，纯化融合蛋白；

E）将亚铁盐，或者亚铁盐与金属氧化物的组合，和H2O2加入步骤D）纯化的融合蛋白溶液中进行反应，利用浓度≤500mM的NaOH控制pH值为8-10，控制温度为50-85℃，其中，在融合蛋白内部形成金属氧化物内核，其中，金属离子的加液速度为每分钟每个融合蛋白10-200个金属离子，金属离子数和H2O2分子数之比为2:1或3:1，融合蛋白浓度为0.25-2mg/mL，其中当使用亚铁盐与金属氧化物的组合时，所述的金属氧化物化学式为Fe(3-x)MxO4，其中0≤x≤

3，或Fe(2-x)MxO3，其中0≤x≤2，并且所述的M选自Mn、Cu、Zn、Ni、Gd或Co；

F）纯化后得到铁蛋白纳米材料。

说明书

一种展示抗体的铁蛋白纳米材料及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及纳米材料技术领域，具体涉及一种展示通用型抗体的铁蛋白纳米材料，所述的铁蛋白纳米材料包含具有类似过氧化物酶活性的金属氧化物内核，以及该铁蛋
白纳米材料的制备方法和应用。

背景技术

[0002] 抗体是B淋巴细胞在抗原刺激下产生的针对该抗原的免疫球蛋白，抗体能够识别抗原并与之发生结合反应，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。抗体-抗原的特异性结合反应被广泛的应用于科研、医学等领域。针对不同应用场景，开发了不同的技术与方
法，如：酶联免疫吸附实验(ELISA)，不仅能够对特定的蛋白进行定量分析，还可以研究分子之间的相互作用或其他特性；蛋白质印迹(WB)，通常被用来确定样品间蛋白的相对表达水
平，还可以确定目标蛋白的分子量大小；免疫组织化学(IHC)，能够揭示样本内抗原的组织特异性和亚细胞定位；免疫沉淀(IP)，是分离纯化单一或复合蛋白的最常用的一种方式；酶联免疫斑点(ELISPOT)，用于检测如细胞因子和生长因子这样的分泌蛋白。以上技术方法的基本原理均是利用抗原-抗体的特异性反应。然而，在实现检测目的的过程中，还需要借助其他辅助手段，如，对抗体进行标记(与具有催化显色能力的酶进行偶联)，对抗体进行固定(与固项载体偶联)。直接对抗体进行标记和固定有几方面的缺点：第一，损伤抗体结构，降低抗体-抗原反应的特异性；第二，标记和固定的位点随机不可控，造成抗体活性位点被遮挡、封闭，或者不能正确定向，降低抗体-抗原结合的效率；第三，传统的技术方法步骤繁琐，耗费时间，检测的时效性较差。

[0003] 抗体的标记和固定在实际应用中是不可或缺的，然而传统的技术手段又有种种缺点，因此，有必要开发新的方法策略。抗体展示平台给我们提供了新的思路。用温和无损的方法将抗体定向展示在平台上，对展示抗体的平台进行固定和标记，不会损伤抗体。

[0004] 铁蛋白是由24或12个蛋白亚基自组装构成的笼状蛋白(外径12nm)，是参与和维持生物有机体铁代谢的重要铁储存蛋白，广泛存在于动物、植物及微生物细胞中。铁蛋白遗传及三维结构信息清楚，且结构非常稳定，能够耐受60-100℃高温，便于进行修饰改造，是展示抗体的绝佳材料。

[0005] 参考文献Antibody–drug conjugates:targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin(Elisabetta 
Falvo，Nanoscale，24，2013)公开了一种抗体-药物结合物，包括利用偶联有抗体的铁蛋白笼载药，向患有黑色素瘤小鼠注射抗体-药物结合物，流式细胞仪验证药效。该专利中铁蛋白笼直接偶联抗体并用于载药。

[0006] 专利CN108976299A公开了一种改善抗体片段亲和力和体内半衰期的方法，包括将抗体片段与铁蛋白笼融合表达，铁蛋白笼空腔容纳药物。该专利中铁蛋白笼直接与抗体融
合表达，并用于载药。

[0007] 参考文献Developing an antibody-binding protein cage as a molecular recognition drug modular nanoplatform(Hyo JinKang，Biomaterials，33(21)，2012.7：
5423-5430)公开了将Fc绑定肽编码基因导入自组装蛋白笼铁蛋白环中，形成四重对称结构
FcBP-铁蛋白，用作纳米传递平台。通过FcBP-铁蛋白与兔IgG抗体混合形成非共价复合物，实现抗体在蛋白笼表面的定向显示。该专利中铁蛋白与连接抗体Fc结构域的蛋白偶联，再
与抗体混合。

[0008] 专利CN105842456A公开了一种乳铁蛋白定向免疫磁珠，该磁珠利用蛋白G或蛋白A偶联到磁珠上，首先用抗乳铁蛋白的抗体与磁珠上的蛋白G或蛋白A偶联，然后交联剂将带
有乳铁蛋白抗体的蛋白G或蛋白A与磁珠交联，该免疫磁珠用于乳铁蛋白的纯化。

[0009] 即目前的研究中，铁蛋白展示抗体的方法包括：1)铁蛋白直接偶联抗体，2)铁蛋白与连接抗体Fc结构域的蛋白偶联，再与抗体混合。铁蛋白展示抗体的用途主要在于通过抗体靶向细胞给药，或者纯化相应的抗体。

[0010] 磁性铁蛋白是以铁蛋白为模板采用仿生矿化合成。本发明人所在研发团队在总结改进前人磁性铁蛋白合成方法的基础上，于2010年建立了成熟的磁性铁蛋白合成方法，利
用异源表达的空壳人H亚基铁蛋白为模板，一步仿生矿化得到具有完整铁蛋白壳包裹的核-
壳型磁性纳米材料(见专利CN102115746A及CN102464715A)，其包括两部分，铁氧体内核(四氧化三铁或γ-三氧化二铁)，以及铁蛋白外壳。磁性铁蛋白直径约12nm的球形亲水材料，具有较大的比表面积，非常适合抗体的表面展示。为达到采用磁性铁蛋白展示抗体的目的，本发明人提供了一种展示抗体的铁蛋白纳米材料，包括将蛋白质A或蛋白质G与铁蛋白融合表
达，并在形成的铁蛋白笼内部合成金属氧化物内核作为标签。该铁蛋白纳米材料解决了抗
体应用中的三大难题：第一，抗体与展示平台的连接问题，本发明所述的铁蛋白纳米材料对抗体具有天然的亲和性，能够与抗体自发装配连接，无需化学共价偶联，避免对抗体造成损伤；第二，抗体在展示平台上的定向问题，本发明中复合纳米材料的活性基团Protein A分布在材料的外表面，向外空间伸展，特异性结合抗体Fc结构域后，抗体的Fab结构域也向外空间伸展定向，不会被遮挡，抗原结合活性不受影响；第三，抗体的标记问题，该平台自身具有类过氧化物酶标签，无需对抗体进行标记，避免了抗体的损伤。该铁蛋白纳米材料为抗体的应用提供了一个通用型平台，极大地便利了抗体的应用，在生物医学、免疫检测等领域具有广阔的应用潜力。

发明内容

[0011] 本发明提供了一种展示抗体的铁蛋白纳米材料，利用蛋白A或蛋白G结合抗体Fc结构域作为桥梁，解决了传统铁蛋白直接与抗体融合表达造成的抗体结构改变，又由于该铁
蛋白纳米材料包含金属氧化物内核而自带标签，无需再在需结合的抗体自身携带标签，简
化后续蛋白纯化、定量、定位的步骤。本发明所述的铁蛋白纳米材料中，每个铁蛋白纳米材料最多可结合48个抗体，抗体展示效率很高。

[0012] 本发明提供的展示抗体的具有类似过氧化物酶催化活性的铁蛋白纳米材料，能够在H2O2出现时同TMB、DAB等底物反应显色，不仅能够高效展示抗体，还能取代酶标二抗的作用。利用本发明提供的铁蛋白纳米材料展示抗体，无需对抗体进行酶或信号分子标记，无需一抗、二抗、三抗多步孵育，能够一步实现抗原识别和显色，降低检测的成本，提高检测的时效性。

[0013] 本发明的第一方面，提供了一种展示抗体的铁蛋白纳米材料，所述的铁蛋白纳米材料包括：

[0014] 包裹金属氧化物内核的铁蛋白笼，以及连接在铁蛋白笼外表面的结合抗体Fc结构域的蛋白。

[0015] 优选的，所述的铁蛋白笼由12或24个铁蛋白单体组成。

[0016] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的铁蛋白笼由24个铁蛋白单体组成。

[0017] 优选的，所述的1个铁蛋白单体连接1-5个结合抗体Fc结构域的蛋白。

[0018] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的1个铁蛋白单体连接1个结合抗体Fc结构域的蛋白。

[0019] 优选的，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白选自蛋白A或蛋白G。

[0020] 优选的，所述的蛋白A或蛋白G为天然的或者基因重组表达的。更优选的，所述的蛋白A或蛋白G为经过密码子优化后表达的。

[0021] 优选的，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白为经密码子优化后表达的蛋白A的A结构域、B结构域、C结构域、A结构域变体、B结构域变体或C结构域变体中的一种或两种以上的组合。

[0022] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白为经过密码子优化后表达的蛋白A的B结构域的变体。

[0023] 所述的与铁蛋白单体连接的蛋白A与抗体的连接位点为蛋白A的A结构域、B结构域、C结构域、A结构域变体、B结构域变体或C结构域变体中的一种或两种以上的组合，所述的铁蛋白与蛋白A连接在铁蛋白的N端。

[0024] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的B结构域变体为将天然B结构域的29位的甘氨酸G变成丙氨酸A，第23位的天冬酰胺(N-Asn)替换成苏氨酸(T-Thr)。B结构域变体较原始序列稳定性高。

[0025] 所述的蛋白A的A、B、C结构域与抗体的结合是通过氢键实现的，不会对抗体的结构造成化学损伤，且蛋白A与抗体的Fc结构域结合，不影响抗体与抗原结合的Fab结构域，保证了抗体在本发明所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料表面向外伸展，充分展示抗体的Fab结构域，不会因为与蛋白A的结合而造成封闭或遮挡。

[0026] 优选的，所述的铁蛋白纳米材料可以结合1-48个抗体。例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个。

[0027] 更优选的，所述的铁蛋白纳米材料可以结合12-48个抗体。

[0028] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的铁蛋白纳米材料结合24个抗体。

[0029] 优选的，所述的铁蛋白单体选自天然或变体的人铁蛋白H亚基、人铁蛋白L亚基、哺乳动物铁蛋白H亚基、哺乳动物铁蛋白L亚基、植物铁蛋白或微生物铁蛋白。其中，所述的微生物铁蛋白可以选自细菌铁蛋白Bacterioferritin。。

[0030] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的铁蛋白单体选自天然或变体的人铁蛋白H亚基。

[0031] 优选的，所述的铁蛋白笼与结合抗体Fc结构域的蛋白通过连接肽连接，所述的连接肽由10-20个氨基酸组成，所述的10-20个氨基酸为丝氨酸和甘氨酸的排列组合。

[0032] 优选的，所述的连接肽序列选自：

[0033] GSGGGGSGGG(SEQ ID NO：5)；

[0034] GSGGGGSGGGGSGGG(SEQ ID NO：6)；

[0035] GSGGGGSGGGGSGGGGSGGG(SEQ ID NO：7)。

[0036] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的连接肽序列如SEQ ID NO：5所示。

[0037] 优选的，所述的金属氧化物内核粒径为1-8nm。

[0038] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的金属氧化物内核粒径为4.9-7.5nm。

[0039] 优选的，所述的金属氧化物化学式为Fe(3-x)MxO4(0≤x≤3)或Fe(2-x)MxO3(0≤x≤2)，其中，所述的M选自Mn、Cu、Zn、Ni、Gd或Co。

[0040] 进一步优选的，所述的金属氧化物内核成分为Fe2O3、Co3O4、Fe(3-x)CoxO4(0≤x≤1)或Fe(3-x)MnxO4(0≤x≤1)。

[0041] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的金属氧化物内核成分为Fe3O4。

[0042] 优选的，所述的金属氧化物内核具有类似过氧化物酶的催化活性，其催化活性的高低可以通过纳米颗粒的大小及成分进行调节。

[0043] 本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括铁蛋白笼，及连接在铁蛋白笼外表面的结合抗体Fc结构域的蛋白。

[0044] 优选的，所述的铁蛋白笼由12或24个铁蛋白单体组成。

[0045] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的铁蛋白笼由24个铁蛋白单体组成。

[0046] 优选的，每个铁蛋白单体均可连接1-5个结合抗体Fc结构域的蛋白。

[0047] 优选的，所述的每个融合蛋白可以结合1-48个抗体。例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个。

[0048] 更优选的，所述的每个融合蛋白可以结合12-48个抗体。

[0049] 在本发明的一个具体实施方式中，每个融合蛋白结合24个抗体。

[0050] 优选的，所述的铁蛋白单体选自天然或变体的人铁蛋白H亚基、人铁蛋白L亚基、哺乳动物铁蛋白H亚基、哺乳动物铁蛋白L亚基、植物铁蛋白或微生物铁蛋白。其中，所述的微生物铁蛋白可以选自细菌铁蛋白Bacterioferritin。

[0051] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的铁蛋白单体选自天然或变体的人铁蛋白H亚基。

[0052] 优选的，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白选自蛋白A或蛋白G。

[0053] 优选的，所述的蛋白A或蛋白G为天然的或者基因重组表达的。更优选的，所述的蛋白A或蛋白G为经过密码子优化后表达的。

[0054] 优选的，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白为经密码子优化后表达的蛋白A的A结构域、B结构域、C结构域、A结构域变体、B结构域变体或C结构域变体中的一种或两种以上的组合。

[0055] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白为经过密码子优化后表达的蛋白A的B结构域的变体。

[0056] 优选的，所述的与铁蛋白融合的蛋白A与抗体连接的位点为蛋白A的A结构域、B结构域、C结构域、A结构域变体、B结构域变体或C结构域变体中的一种或两种以上的组合。所述的铁蛋白与蛋白A连接在铁蛋白的N端。

[0057] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的B结构域变体为将天然B结构域的29位的甘氨酸G变成丙氨酸A，第23位的天冬酰胺(N-Asn)替换成苏氨酸(T-Thr)。B结构域变体较原始序列稳定性高。

[0058] 优选的，所述的铁蛋白笼与结合抗体Fc结构域的蛋白通过连接肽连接，所述的连接肽由10-20个氨基酸组成，所述的10-20个氨基酸为丝氨酸和甘氨酸的排列组合。

[0059] 优选的，所述的连接肽序列选自：

[0060] GSGGGGSGGG(SEQ ID NO：5)；

[0061] GSGGGGSGGGGSGGG(SEQ ID NO：6)；

[0062] GSGGGGSGGGGSGGGGSGGG(SEQ ID NO：7)。

[0063] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的连接肽序列如SEQ ID NO：5所示。

[0064] 本发明的第三方面，提供了一种上述融合蛋白的制备方法，包括：

[0065] 将结合抗体Fc结构域的蛋白编码基因与铁蛋白单体编码基因连接制备融合基因；

[0066] 将融合基因连接至质粒上；

[0067] 将含有融合基因的质粒转化到大肠杆菌中，培养，并利用IPTG诱导表达；

[0068] 破碎细胞释放融合蛋白，并纯化融合蛋白。

[0069] 优选的，所述的融合蛋白自发组装成外表面向外侧延展连接蛋白A的铁蛋白笼结构。

[0070] 优选的，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白选自蛋白A或蛋白G。进一步优选的，所述的蛋白A或蛋白G为天然的或者基因重组表达的。更进一步优选的，所述的蛋白A或蛋白G为经过密码子优化后表达的。

[0071] 优选的，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白为经密码子优化后表达的蛋白A的A结构域、B结构域、C结构域、A结构域变体、B结构域变体或C结构域变体中的一种或两种以上的组合。

[0072] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白为经过密码子优化后表达的蛋白A的B结构域的变体。

[0073] 优选的，所述的融合基因还包括编码连接肽的核苷酸序列。

[0074] 优选的，所述的融合基因经过密码子优化，使其更适应大肠杆菌的表达体系。其中，密码子优化可以采用现有任何网站或者软件进行获取。

[0075] 在本发明的一个具体实施方式中，所述密码子优化的网站可以为http://www.jcat.de/。

[0076] 优选的，所述的培养为将含有融合基因载体的BL21(DE3)细胞培养至对数期，转接大瓶培养，待菌株生产至OD值0.6-1.0时，诱导表达。

[0077] 优选的，所述的诱导时间为6-12h。

[0078] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的诱导时间为8-10h。

[0079] 优选的，所述的诱导温度为20-40℃。

[0080] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的诱导温度为30-35℃。

[0081] 优选的，所述的破碎细胞的方法可以采用常规生物化学方法、物理方法或机械方法中的一种或两种以上的组合。

[0082] 更优选的，所述的生物化学方法选自化学试剂法、自溶法或酶解法。其中，所述的化学试剂选自甲苯、丙酮、氯仿或Triton。

[0083] 更优选的，所述的物理方法选自温差法、压差法或超声法。

[0084] 更优选的，所述的机械方法选自捣碎法、研磨法或匀浆法。

[0085] 在本发明的一个具体实施方式中，所述破碎细胞的方法采用超声法。

[0086] 优选的，所述纯化融合蛋白选自离心、凝胶过滤、层析方法、硫酸铵沉淀、离子交换或分子排阻层析分离蛋白。

[0087] 具体的，所述的纯化融合蛋白为在破碎的细胞中加入0.3％-1.5％的Triton X-100，60-80℃加热15-30分钟，对融合蛋白进行初步纯化；再采用凝胶过滤的方法对初步纯化的融合蛋白进行精细分离和纯化。

[0088] 优选的，所述的质粒为pET系统。更优选的，所述的载体包括但不限于pET-30a、pET-31b、pET-34b、pET-35b、pET22b、pET-43.1。

[0089] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的质粒为pET22b。

[0090] 本发明的第四方面，提供了上述融合蛋白在抗体展示中的应用。

[0091] 本发明的第五方面，提供了编码上述融合蛋白的核苷酸序列。

[0092] 优选的，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

[0093] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

[0094] 本发明的第六方面，提供了一种包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列的载体。

[0095] 优选的，所述的载体为pET系统。更优选的，所述的载体包括但不限于pET-30a、pET-31b、pET-34b、pET-35b、pET22b、pET-43.1。

[0096] 本发明的第七方面，提供了一种包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列或上述载体的细胞。

[0097] 本发明的第八方面，提供了一种表达上述融合蛋白的菌株。

[0098] 优选的，所述的菌株为大肠杆菌。更优选的，所述的菌株选自BL21(DE3)或Rosetta系列菌株。

[0099] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的菌株为BL21(DE3)。

[0100] 本发明的第九方面，提供了一种上述的展示抗体的铁蛋白纳米材料的制备方法，包括将金属盐类和氧化剂加入上述的融合蛋白中进行反应，其中，金属离子与氧化剂的摩
尔比为1:0.33-0.5，所述的融合蛋白与金属离子的摩尔比为1:100-40000。

[0101] 优选的，所述的氧化剂为H2O2，所述反应的条件为pH 8-10，温度50-85℃，金属盐类的浓度为10-200mM，氧化剂的浓度为5-100mM，融合蛋白浓度为0.25-2mg/mL，金属盐类的加液速度为每分钟每个融合蛋白10-200个金属离子。

[0102] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

[0103] A)将结合抗体Fc结构域的蛋白编码基因与铁蛋白单体编码基因连接制备融合基因；

[0104] B)将步骤A)制备的融合基因连接至载体pET22b上；

[0105] C)将步骤B)获得的含有融合基因的载体转化到BL21(DE3)细胞中，培养，并利用IPTG诱导表达融合蛋白；

[0106] D)破碎步骤C)表达融合蛋白的细胞释放融合蛋白，纯化融合蛋白；

[0107] E)将亚铁盐或者亚铁盐与金属氧化物的组合，和H2O2加入步骤D)纯化的融合蛋白溶液中进行反应，利用浓度≤500mM的NaOH控制pH值为8-10，控制温度为50-85℃，其中，在融合蛋白内部形成金属氧化物内核，其中，金属离子的加液速度为每分钟每个融合蛋白10-
200个金属离子，金属离子数和过氧化氢分子数之比为2:1或3:1，融合蛋白浓度为0.25-
2mg/mL；优选的，所述的亚铁盐为硫酸亚铁、硫酸亚铁铵或氯化亚铁，优选的，所述的金属氧化物化学式为Fe(3-x)MxO4(0≤x≤3)或Fe(2-x)MxO3(0≤x≤2)，其中，所述的M选自Mn、Cu、Zn、Ni、Gd或Co。

[0108] F)纯化后得到铁蛋白纳米材料。

[0109] 优选的，所述的步骤A)中融合基因还包括编码连接肽的核苷酸序列。

[0110] 优选的，所述的融合基因与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

[0111] 优选的，所述的步骤A)中的融合基因经过密码子优化，使其更适应大肠杆菌的表达体系。其中，密码子优化可以采用现有任何网站或者软件进行获取。

[0112] 在本发明的一个具体实施方式中，所述密码子优化的网站可以为http://www.jcat.de/。

[0113] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的融合基因如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列。

[0114] 优选的，所述的步骤C)中的培养为将含有融合基因载体的BL21(DE3)细胞培养至对数期，转接大瓶培养，待菌株生产至OD值0.6-1.0时，诱导表达。

[0115] 优选的，所述的步骤C)中诱导时间为6-12h。

[0116] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的诱导时间为8-10h。

[0117] 优选的，所述的诱导温度为20-40℃。

[0118] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的诱导温度为30-35℃。

[0119] 优选的，所述步骤D)中破碎步骤C)表达融合蛋白的细胞的方法可以采用常规生物化学方法、物理方法或机械方法中的一种或两种以上的组合。

[0120] 更优选的，所述的生物化学方法选自化学试剂法、自溶法或酶解法。其中，所述的化学试剂选自甲苯、丙酮、氯仿或Triton。

[0121] 更优选的，所述的物理方法选自温差法、压差法或超声法。

[0122] 更优选的，所述的机械方法选自捣碎法、研磨法或匀浆法。

[0123] 在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤D)中破碎步骤C)表达融合蛋白的细胞的方法采用超声法。

[0124] 优选的，所述步骤D)中纯化选自离心、凝胶过滤、层析方法、硫酸铵沉淀、离子交换或分子排阻层析分离蛋白。

[0125] 具体的，所述步骤D)中纯化为在破碎的细胞中加入0.3％-1.5％的Triton X-100，60-80℃加热15-30分钟，对融合蛋白进行初步纯化；再采用凝胶过滤的方法对初步纯化的
融合蛋白进行精细分离和纯化。

[0126] 优选的，所述的步骤E)中pH控制在8.5-9.0。

[0127] 在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤E)中温度控制在65-70℃。

[0128] 优选的，所述的金属氧化物内核成分选自Fe2O3、Co3O4、Fe(3-x)CoxO4(0≤x≤1)或Fe(3-x)MnxO4(0≤x≤1)。

[0129] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的金属氧化物内核成分为Fe3O4。

[0130] 优选的，所述步骤F)中纯化选自离心、凝胶过滤、层析方法、硫酸铵沉淀、离子交换或分子排阻层析分离蛋白。

[0131] 优选的，所述的融合蛋白自发组装成外表面向外侧延展连接蛋白A的铁蛋白笼结构。

[0132] 本发明的第十方面，提供了上述的展示抗体的铁蛋白纳米材料、上述的融合蛋白、上述的编码融合蛋白的核苷酸序列、上述的包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列的载体、上述的包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列或上述载体的细胞，或者，表达上述融合蛋白
的菌株在抗体筛选，抗体纯化，抗体或抗原的定性、定量及定位，靶向细胞，细胞标记，免疫检测中的应用。

[0133] 本发明的第十一方面，提供了所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料、所述的融合蛋白、所述的编码融合蛋白的核苷酸序列、上述的包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列的载
体、上述的包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列或上述载体的细胞，或者，表达上述融合蛋白的菌株在免疫组化、ELISA、免疫沉淀、蛋白质印迹、酶联免疫斑点、流式细胞仪中的应用。

[0134] 优选的，所述的免疫组化包括通过抗原抗体结合对抗原或抗体进行定位、定性及定量研究。

[0135] 本发明的第十二方面，提供了一种对组织细胞内抗原的定位、定性及相对定量的方法，包括：

[0136] 取待检组织，并使得组织内源性过氧化物酶失活，封闭；

[0137] 将本发明制备的铁蛋白纳米材料与目标抗原对应的抗体孵育，覆盖在待检组织上，孵育；

[0138] 将显色液覆盖在待检组织上，显色，复染并观察染色结果。

[0139] 本发明的第十三方面，提供了一种抗体筛选的方法，将待测样本与本发明制备的铁蛋白纳米材料混合，获得(M-PA-Fn)-antibody，封闭，将目标抗体的相应抗原蛋白加入
后，测定结合情况。

[0140] 本发明的第十四方面，提供了一种疾病的治疗方法，其包括将有效量的抗体展示在本发明所述的铁蛋白纳米材料表面，并施加入动物体内。

[0141] 本发明的第十五方面，提供了一种抗体筛选的试剂盒，其包括本发明所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料。

[0142] 本发明的第十六方面，提供了包含金属氧化物内核的铁蛋白笼在抗体展示中的应用。

[0143] 优选的，将包含金属氧化物内核的铁蛋白笼通过连接肽在外表面连接可以结合抗体Fc结构域的蛋白。

[0144] 优选的，所述的铁蛋白笼由12或24个铁蛋白单体组成。

[0145] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的铁蛋白笼由24个铁蛋白单体组成。

[0146] 优选的，所述的1个铁蛋白单体连接1-5个结合抗体Fc结构域的蛋白。

[0147] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的1个铁蛋白单体连接1个结合抗体Fc结构域的蛋白。

[0148] 进一步优选的，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白为蛋白A或蛋白G。其中，所述的蛋白A或蛋白G为天然的或者基因重组表达的。更优选的，所述的蛋白A或蛋白G为经过密码子优化后表达的。

[0149] 优选的，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白为经密码子优化后表达的蛋白A的A结构域、B结构域、C结构域、A结构域变体、B结构域变体或C结构域变体中的一种或两种以上的组合。

[0150] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的结合抗体Fc结构域的蛋白为经过密码子优化后表达的蛋白A的的B结构域的变体。

[0151] 所述的与铁蛋白单体连接的蛋白A与抗体的连接位点为蛋白A的A结构域、B结构域、C结构域、A结构域变体、B结构域变体或C结构域变体中的一种或两种以上的组合，所述的铁蛋白与蛋白A连接在铁蛋白的N端。

[0152] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的B结构域变体为将天然B结构域的29位的甘氨酸G变成丙氨酸A，第23位的天冬酰胺(N-Asn)替换成苏氨酸(T-Thr)。B结构域变体较原始序列稳定性高。

[0153] 优选的，所述的铁蛋白单体选自天然或变体的人铁蛋白H亚基、人铁蛋白L亚基、哺乳动物铁蛋白H亚基、哺乳动物铁蛋白L亚基、植物铁蛋白或微生物铁蛋白。其中，所述的微生物铁蛋白可以选自细菌铁蛋白Bacterioferritin。

[0154] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的铁蛋白单体选自天然或变体的人铁蛋白H亚基。

[0155] 优选的，所述的铁蛋白纳米材料可以结合1-48个抗体。例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个。

[0156] 更优选的，所述的铁蛋白纳米材料可以结合12-48个抗体。

[0157] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的铁蛋白纳米材料结合24个抗体。

[0158] 优选的，所述的铁蛋白笼与结合抗体Fc结构域的蛋白通过连接肽连接，所述的连接肽由10-20个氨基酸组成，所述的10-20个氨基酸为丝氨酸和甘氨酸的排列组合。

[0159] 优选的，所述的连接肽序列选自：

[0160] GSGGGGSGGG(SEQ ID NO：5)；

[0161] GSGGGGSGGGGSGGG(SEQ ID NO：6)；

[0162] GSGGGGSGGGGSGGGGSGGG(SEQ ID NO：7)。

[0163] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的连接肽序列如SEQ ID NO：5所示。

[0164] 优选的，所述的金属氧化物内核粒径为1-8nm。

[0165] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的金属氧化物内核粒径为4.9-7.5nm。

[0166] 优选的，所述的金属氧化物化学式为Fe(3-x)MxO4(0≤x≤3)或Fe(2-x)MxO3(0≤x≤2)，其中，所述的M选自Mn、Cu、Zn、Ni、Gd或Co。

[0167] 进一步优选的，所述的金属氧化物内核成分为Fe2O3、Co3O4、Fe(3-x)CoxO4(0≤x≤1)或Fe(3-x)MnxO4(0≤x≤1)。

[0168] 在本发明的一个具体实施方式中，所述的金属氧化物内核成分为Fe3O4。

[0169] 优选的，所述的金属氧化物内核具有类似过氧化物酶的催化活性，其催化活性的高低可以通过纳米颗粒的大小及成分进行调节。

[0170] 本发明所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料是一种通用型抗体展示平台，针对各种来源的抗体具有稳定的结合能力，包括但不限于来源于人类、小鼠、豚鼠、兔、猪、猴、奶牛、狗中的抗体。优选的，所述的抗体包括但不限制于IgG、IgM、IgA、IgE或IgD。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗体为IgG。

[0171] 本发明所述的“蛋白A”是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁成分，其能够与抗体非共价结合，捕获抗体(尤其是IgG类)。蛋白A能够结合免疫球蛋白的区域依次为E、D、A、B、C结构域，其中A、B、C三个结构域与抗体的Fc部分结合，E、D两个结构域与抗体的Fab部分结合。

[0172] 本发明所述的“蛋白G”是G型链球菌分离而得的细胞壁蛋白，由近600个氨基酸组成，其N-端部分为白蛋白结构域，C-端部分包括抗体结合域，在本发明中蛋白G与抗体Fc部分结合。

[0173] 本发明所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料可以稳定的结合抗体的Fc结构域，使得抗体的抗原结合区在铁蛋白纳米材料表面向外定向展示，形成(M-PA-Fn)-antibody复合
体。

[0174] 本发明所述的“HRP”为辣根过氧化物酶，催化过氧化氢与氢供体间的氧化还原反应。

[0175] 本发明所述的“TMB”为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，作为过氧化物酶的底物。

[0176] 本发明所述的“DAB”为二氨基联苯胺，作为过氧化物酶的底物。

[0177] 本发明所述的“IPTG”为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

[0178] 本发明所述的“(M-PA-Fn)-antibody”为本发明所述的展示抗体的铁蛋白纳米材料M-PA-Fn与抗体结合后的复合物，其中，M为金属氧化物内核，PA为蛋白A，Fn为铁蛋白笼。
在本发明的一个具体实施方式中，铁蛋白纳米材料表示为M-PA-HFn，其中HFn为人铁蛋白H
亚基。

[0179] 本发明所述的“Fc结构域”为“Y”型抗体的柄部即结晶片段，可以结合糖，非抗原结合片段。

[0180] 本发明所述的“Fab结构域”为抗体结构中的抗原结合片段，包含完整的可变区以及部分恒定区。

[0181] 本发明所述的“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。

[0182] 本发明所述的“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

附图说明

[0183] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

[0184] 图1：融合蛋白异源表达质粒pET22b-PA-HFn质粒图谱，其中，PA-HFn为插入载体的铁蛋白与蛋白A的编码融合蛋白的核苷酸序列。

[0185] 图2：融合蛋白热稳定性分析。A，相同浓度的融合蛋白在不同温度下加热30min，蛋白浓度随温度的变化曲线；B，相同浓度的融合蛋白在65℃下加热不同时间，蛋白浓度随加热时间的变化曲线；C，相同浓度的融合蛋白在不同温度下加热30min后CD光谱图；D，相同浓度的融合蛋白在65℃下加热不同时间后CD光谱图。

[0186] 图3A：铁蛋白纳米材料透射电镜及高分辨电镜分析。

[0187] 图3B：制备的258个铁蛋白纳米材料不同粒径的分布情况，结果显示平均粒径为6.2±1.3nm。

[0188] 图4：铁蛋白纳米材料类似过氧化物酶催化活性测试。左，催化底物TMB显色；右，催化底物DAB显色。

[0189] 图5：检验铁蛋白纳米材料结合抗体的能力。A：融合蛋白结合抗体，B：合成的铁蛋白纳米材料结合抗体。

[0190] 图6：铁蛋白纳米材料应用于组化显色。

[0191] 图7：能够展示抗体且自带类似过氧化物酶标签的铁蛋白纳米材料结构示意图。

具体实施方式

[0192] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都
属于本发明保护的范围。

[0193] 本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。所涉及的酶切、回收、连接、转化、PCR等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。基因序列合成及测序由华大基因生物公司完成。

[0194] 实施例1融合蛋白表达菌株的构建

[0195] 1.1编辑设计Protein A的B结构域的编码基因(SEQ ID NO：1)与铁蛋白的编码基因(SEQ ID NO：2)的融合序列：protein A的相关基因序列在5’端，铁蛋白的基因序列在3’端，两者之间添加30-60bp的连接序列，5’端添加NdeI酶切位点，3’端添加XhoI酶切位点；

[0196] 1.2对设计好的融合序列(SEQ ID NO：3)进行密码子优化(SEQ ID NO：4)，使序列更适应大肠杆菌的表达体系；

[0197] 1.3通过华大基因合成经过密码子优化的融合序列，华大基因将合成的融合序列克隆在pUC57载体上(pUC57-PA-HFn)，并导入大肠杆菌Top10菌株中；

[0198] 1.4从华大基因提供的Top10菌株中提取pUC57-PA-HFn质粒，酶切获取融合序列：

[0199] (1)利用LB培养基培养包含融合序列的Top10菌株，培养条件：37℃200rpm，培养时间：过夜；

[0200] (2)离心收集2mL菌液，用质粒提取试剂盒抽提pUC57-PA-HFn质粒，琼脂糖凝胶电泳检验提取的质粒，Nanodrop测定抽提质粒的浓度；

[0201] (3)利用NdeI和XhoI双酶切pUC57-PA-HFn质粒，凝胶电泳分离融合序列片段，切胶回收目的片段，Nanodrop测定回收片段的浓度；

[0202] 1.7利用NdeI和XhoI双酶切空载pET22b，凝胶电泳切胶回收线性化的pET22b载体，Nanodrop测定回收的线性化pET22b载体浓度；

[0203] 1.8利用T4 DNA连接酶连接切胶回收的融合序列和线性化的pET22b载体，使融合序列插入到pET22b载体的NdeI和XhoI位点之间，完成重组载体构建(见图1)；

[0204] 1.9将构建好的重组载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞中，构建融合蛋白的异源表达体系，表达的蛋白序列为SEQ ID NO：8，通过抗性筛选、菌落PCR、基因测序手段获取了正确的异源表达菌株。

[0205]

[0206]

[0207]

[0208] 实施例2融合蛋白的表达与纯化

[0209] 2.1 LB固体平板(含氨苄青霉素)划线活化实施例1获得的异源表达菌株，挑单克隆至液体LB(加氨苄青霉素)，培养8-10h至对数期，按照1％的接种量转接大瓶液体LB(加氨苄青霉素)，待表达菌株生长至OD值0.6-1.0时，加终浓度1mM IPTG激活T7启动子，诱导表达融合蛋白，30℃诱导8-10h；

[0210] 2.2 4℃离心收集菌体，PBS洗两遍菌体，最后菌体重悬于PBS溶液中，利用超声破碎细胞，离心收集上清；

[0211] 2.3上清液75℃加热20min去除杂蛋白，离心收集上清；

[0212] 2.4上清液过分子筛进一步纯化，得到高纯度融合蛋白。

[0213] 实施例3融合蛋白热稳定性分析

[0214] 3.1将纯化后的融合蛋白置换溶液，由PBS溶液置换成0.1M NaCl溶液，测定蛋白浓度，将蛋白浓度稀释或浓缩至0.15mg/mL。

[0215] 3.2将稀释好的融合蛋白溶液分别在37、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100℃处理30min，20000g离心30min，测定蛋白浓度和CD光谱。结果显示，温度超过75℃，蛋白浓度开始迅速降低(见图2A)，CD光谱曲线开始变形(见图2C)，表明融合蛋白在大于75
℃的条件下二级结构开始改变，并且聚集沉淀。融合蛋白耐受最高温度不超过75℃。

[0216] 3.3将稀释好的融合蛋白溶液在65℃条件下分别加热0.5、1、2、4、6、8、10、20h，20000g离心30min，测定蛋白浓度和CD光谱。结果显示，加热时间在8h以内，蛋白浓度和CD光谱曲线变化不大(图2B、2D)。因此，选择融合蛋白能够耐受的65℃、8h的持续加热进行后续试验。

[0217] 实施例4展示抗体的铁蛋白纳米材料的合成

[0218] 4.1将纯化后的融合蛋白置换溶液，由PBS溶液置换成0.1M NaCl溶液，测定蛋白浓度备用。

[0219] 4.2去离子水抽真空除氧，制成无氧水。用无氧水在厌氧手套箱内配制硫酸亚铁铵、过氧化氢、氢氧化钠溶液。

[0220] 4.3配制0.1M NaCl，0.22μm滤膜过滤，抽真空除氧，制成无氧NaCl溶液备用。

[0221] 4.4融合蛋白加入无氧NaCl溶液，使终浓度为0.5mg/mL，“抽真空-充氩气”反复操作10-20次，去除残留溶解氧。转移至厌氧手套箱备用。

[0222] 4.5开始启动加热，目标温度65℃，同时用氢氧化钠通过pH滴定仪调节融合蛋白溶液pH至8.5。

[0223] 4.6待温度达到设定温度后启动泵液程序，同时通过pH滴定仪将pH稳定在8.5。控制亚铁离子的加液速度为每分钟每个融合蛋白80个离子，每次加入反应体系的亚铁离子数
和过氧化氢分子数之比为3:1，蛋白浓度≥0.25mg/mL。这种化学计量下，融合蛋白内部合成的纳米颗粒为Fe3O4。

[0224] 4.7待泵液量达到每个融合蛋白平均占有5000个铁原子的化学计量时，终止泵液程序。反应继续维持10min后，停止加热，结束反应。

[0225] 4.8 20000g离心30min，去除沉淀，得到目标材料——能够展示抗体且自带类似过氧化物酶标签的铁蛋白纳米材料(见图7)。

[0226] 4.9过分子筛对材料做进一步纯化处理。获得的铁蛋白纳米材料用透射电镜及高分辨电镜分析图见图3。图3显示采用本方法制备的铁蛋白纳米材料粒径大小适宜，平均直
径约为6.2nm，且分布均匀。

[0227] 实施例5铁蛋白纳米材料的类似过氧化物酶催化活性测试

[0228] 5.1配制四组反应缓冲液：其中一组PBS溶液，pH 7.4；三组0.2M醋酸钠溶液，分别用醋酸调pH至4.5、5.5、6.5。

[0229] 5.2显色体系：2mL，显色条件：室温10min，显色缓冲液：PBS及三种不同pH的醋酸钠缓冲液。

[0230] 实施例4制备的铁蛋白纳米材料：20μg/mL；H2O2：100mM；TMB(DAB)：200mM。

[0231] 5.3结果如图4所示，材料有类似过氧化物酶的催化活性，能够催化TMB和DAB显色；在pH 4.5和5.5条件下显色效果较好，但是因为pH 4.5条件下DAB有严重的本底显色，因此
最适显色pH值为5.5。

[0232] 实施例6铁蛋白纳米材料结合抗体能力检验

[0233] 6.1纯化后的融合蛋白PA-HFn(实施例2制备获得)和铁蛋白纳米材料M-PA-HFn(实施例4制备获得)置换缓冲液至PBS中，测定蛋白浓度。

[0234] 6.2包被酶标板：取100μL浓度为0.1mg/mL的融合蛋白PA-HFn和铁蛋白纳米材料M-PA-HFn加入酶标板中，每个样品三个平行，37℃温浴2h。

[0235] 6.3封闭：倒掉酶标板中样品，用300μL PBS洗涤酶标板，重复3-5遍。加300μL 5％脱脂奶粉，37℃温浴2h。

[0236] 6.4捕获抗体：用5％脱脂奶粉稀释辣根过氧化物酶标记的抗体，稀释比例为1/1000-1/10000。倒掉酶标板中脱脂奶粉，加100μL稀释后酶标抗体。37℃温浴10-60min。

[0237] 6.5显色：倒掉酶标板中样品，用300μL PBS洗涤酶标板，重复5遍。加100μL商用TMB显色液，37℃显色10min，加100μL终止液终止显色，酶标仪测定450nm吸光值。

[0238] 6.6见图5结果显示：(1)融合蛋白PA-HFn和铁蛋白纳米材料M-PA-HFn均能结合抗体，(2)对于商用TMB显色液，铁蛋白纳米材料M-PA-HFn显色很弱，如果需要让M-PA-HFn催化显色，需要按照“实施例5”中的方法配置专用显色液。

[0239] 实施例7铁蛋白纳米材料应用于组织切片显色

[0240] 7.1人胰腺癌(CFPAC-1)组织冰冻切片在PBS缓冲液中洗涤3min，重复两次。

[0241] 7.2用0.3％H2O2覆盖组织切片表面，孵育20min，失活内源性过氧化物酶。

[0242] 7.3用5％脱脂奶粉37℃封闭1h，用PBS洗涤3次，每次3min。

[0243] 7.4将2μM的铁蛋白纳米材料与4μM的的肿瘤标志物抗体孵育10-30min，然后覆盖组织切片表面，37℃孵育1h。用PBS洗涤5次，每次3min。

[0244] 7.5按照以下配方配制DAB显色液。

[0245] pH 5.5醋酸钠缓冲液：0.2M

[0246] H2O2：100mM

[0247] DAB：200mM

[0248] 7.6显色：DAB显色液覆盖组织切片表面，37℃显色10min，自来水冲掉显色液终止显色。

[0249] 7.7苏木素复染组织切片。

[0250] 7.8组织切片在无水乙醇和二甲苯中脱水，中性树胶封片。

[0251] 7.9观察分析组织切片染色结果。图6结果表明：抗体-铁蛋白纳米材料复合物能够特异性识别组织抗原，并显色。与传统免疫组化相比，仅需一种抗体，一步就能实现组织显色。

[0252] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0253] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。