一株黄色短波单胞菌及其在白条党参上的应用转让专利
申请号 : CN201910523297.2
文献号 : CN110272841B
文献日 : 2020-10-20
发明人 : 杜文静 , 丁品 , 刘锦霞 , 李晶 , 李娜 , 武建荣 , 张建军
申请人 : 甘肃省科学院生物研究所
摘要 :
本发明提供了一株黄色短波单胞菌（Brevundimonas aurantiaca）D3，该菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17101。D3具有较高的固氮酶活性，对尖孢镰刀菌具有明显的抑制作用，同时对白条党参提取物具有较强的耐受性，D3菌液或以D3为核心菌株的微生物菌剂可以作为白条党参的专属固氮菌肥使用，也可用于防控由尖孢镰刀菌引起白条党参根腐病。
权利要求 :
1.一株黄色短波单胞菌（Brevundimonas aurantiaca）D3的用途，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17101，其特征在于所述用途为抑制尖孢镰刀菌（ Fusarium oxysporum ） 。
2.一株黄色短波单胞菌（Brevundimonas aurantiaca）D3的用途，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17101，其特征在于所述用途为以所述菌株为核心菌株的菌剂产品可以用于防控由尖孢镰刀菌引起的白条党参根腐病。
说明书 :
一株黄色短波单胞菌及其在白条党参上的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体为一株黄色短波单胞菌及其在白条党参上的应用。
背景技术
[0002] 党参为中国常用的传统补益药，具有补中益气，健脾益肺之功效。现代研究，党参含多种糖类、酚类、甾醇、挥发油、黄芩素葡萄糖甙、皂甙及微量生物碱，具有增强免疫力、扩张血管、降压、改善微循环、增强造血功能等作用。此外对化疗放疗引起的白细胞下降有提升作用。甘肃是党参的主产地之一，渭源的白条党参，其年产量占全国党参总产量的60%以上，渭源更是被誉为“中国党参之乡”。甘肃省地处黄土高原，土质主要以黑垆土和黄绵土为主，土壤全氮含量低，pH偏碱性，会造成铵态氮肥中铵的挥发，不适合适用铵态氮肥。而《中药材生产质量管理规范》（GAP）规定：禁用硝态氮肥，氮肥施用过多会使商品药材中的亚硝酸盐积累并转化为强致癌物质亚硝酸铵，同时还会使药材质地松散，易患病害，药用果实中含氮量过高还会促进腐烂，不易保藏，GAP还要求在施肥过程中要保持或增加土壤肥力及土壤的生物活性。
[0003] 因此，最适合于党参种植的氮肥应首选微生物氮肥，即具有固氮性的微生物菌剂。现有技术中尚没有针对白条党参这一特殊作物的专用固氮菌肥，而普通的固氮菌肥中的固氮微生物对于党参种植环境并不能很好的适应，因而造成固氮效率不高，肥料施用效果不好，导致党参产量低，而推广难度大。除了甘肃特有的土壤环境对固氮微生物活性的影响以外，党参在种植过程中本身对土壤中释放的部分代谢产物也会影响固氮微生物的活性，且土壤中的微生物种群会与普通固氮菌肥中的固氮菌产生拮抗作用，从而限制其固氮活性。
[0004] 除氮肥匮乏影响白条党参产量外，病害也是直接威胁白条党参品质的主要因素。根腐病是白条党参常见病，发病范围广，研究表明，白条党参根腐病的主要致病菌为尖孢镰刀菌，通过害虫啃噬白条党参根部形成创面，后有尖孢镰刀菌由创面侵染，继而发病。发病由须根开始，漫延至主根，主根自下而上逐步呈水渍状腐烂，直至全株枯死。目前常用的预防及治疗农药为多菌灵和甲基托布津，多菌灵用于土壤消毒和种秧消毒，但多菌灵残留能引起肝病和染色体畸变，对哺乳动物有毒害，而甲基托布津在碱性土壤中抑菌效果会大打折扣，不适合甘肃白条党参种植区使用。现有技术中的生防类微生物菌剂也受到白条党参种植环境及白条党参根部生物碱的拮抗作用的影响，较难发挥高效的抑菌抗病作用，导致施用效果差，不能有控制白条党参根腐病的发生。
[0005] 同时，额外施加原生土壤环境以外的微生物，会对原有的土壤微生态环境造成影响和破坏，且外来菌种的定殖性差，需要长期施用，大量施用才能保证微生物菌剂发挥效用，导致施用微生物菌剂的成本增加，而效果打折，且生态安全性仍需测评。
发明内容
[0006] 本发明是针对上述现有技术的不足和缺陷，提出了一株黄色短波单胞菌及其在白条党参上的应用。
[0007] 本发明的目的一是提供一株从白条党参根际土壤中分离得到的黄色短波单胞菌D3，该菌株现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.17101，保藏时间2019年01月02日。
[0008] 作为优选，黄色短波单胞菌D3对白条党参提取物的最高耐受量以党参炔苷计为3.47ug/ml。
[0009] 作为优选，黄色短波单胞菌D3的固氮酶活性为182.3 C2H2，nmol h-1 ml-1。
[0010] 作为优选，黄色短波单胞菌D3对尖孢镰刀菌有抑制作用，抑菌率为78.3±1.55%。
[0011] 本发明的目的二是提供黄色短波单胞菌D3在种植白条党参上的用途，D3的菌液或者以D3为核心菌株的菌剂既可以作为微生物氮肥施用，有效促进白条党参的生长，也可以用于防控由尖孢镰刀菌引起的白条党参根腐病。
[0012] 黄色短波单胞菌D3，是从白条党参根际土壤中分离得到的，对白条党参根部的代谢产物具有良好的耐受能力，以党参中主要活性成分党参炔苷计算，其最高耐受量达到3.47ug/ml，远高于白条党参根际土壤中党参炔苷的平均含量，证明D3能够在白条党参根际土壤中正常生长存活，发挥代谢作用。D3是通过阿须贝培养基从白条党参根际土壤中选择分离出来的，经乙炔还原法测定，D3具有较高的固氮酶活性，固氮酶活性为182.3 C2H2，nmol -1 -1
h ml ，可以作为微生物氮肥施用于白条党参。D3还能够抑制白条党参根腐病病原菌尖孢镰刀菌的生长，能够有效防控白条党参根腐病的发生。黄色短波单胞菌D3从白条党参根际土壤中分离，是白条党参根际土壤中的土著微生物，对白条党参根际土壤中的各种特殊生物碱等成分适应性好，因此代谢能力强，活性高，定殖能力强，而且不会对原有土壤微生态环境造成入侵破坏，生态安全性好。D3既具有高固氮性，又具有抑菌性，是一株促生与生防的双效菌株，既具有肥料增产的作用，又具有农药抗病的作用，有效提高白条党参产量的同时保证了药材的品质，改良了白条党参种植地的土壤环境，是一株应用前景广阔的优质菌株，同时由于其优良的定殖性，决定了其施用量少，施用成本低，对于白条党参种植业具有重大意义。
h ml ，可以作为微生物氮肥施用于白条党参。D3还能够抑制白条党参根腐病病原菌尖孢镰刀菌的生长，能够有效防控白条党参根腐病的发生。黄色短波单胞菌D3从白条党参根际土壤中分离，是白条党参根际土壤中的土著微生物，对白条党参根际土壤中的各种特殊生物碱等成分适应性好，因此代谢能力强，活性高，定殖能力强，而且不会对原有土壤微生态环境造成入侵破坏，生态安全性好。D3既具有高固氮性，又具有抑菌性，是一株促生与生防的双效菌株，既具有肥料增产的作用，又具有农药抗病的作用，有效提高白条党参产量的同时保证了药材的品质，改良了白条党参种植地的土壤环境，是一株应用前景广阔的优质菌株，同时由于其优良的定殖性，决定了其施用量少，施用成本低，对于白条党参种植业具有重大意义。
[0013] 保藏说明：
[0014] 菌种名称：黄色短波单胞菌
[0015] 拉丁名：Brevundimonas aurantiaca
[0016] 菌株编号：D3
[0017] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0018] 保藏机构简称：CGMCC
[0019] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0020] 保藏日期：2019年01月 02日
[0021] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 17101。
附图说明
[0022] 图1为实施例1中D3的菌落照片。
具体实施方式
[0023] 下面结合具体实施实例对本发明进行详细说明。以下实施实例有助于此领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0024] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 下述实施例中所使用的培养基如下：
[0027] 固氮菌富集培养基：蔗糖15g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙1.0g，质量分数为1%的钼酸钠、硼酸、硫酸锰、硫酸亚铁（现配）水溶液各1ml，蒸馏水1000ml，pH6.5-7.0。
[0028] 阿须贝培养基：甘露醇10g，酵母膏0.4g，氯化钠0.2g，碳酸钙1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.2g，蒸馏水1000ml，pH7.4-7.6。
[0029] 固氮培养基：磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钾0.8g，硫酸镁0.2g，硫酸钙0.1g，氯化铁 微量，钼酸钠 微量，酵母提取物0.5g，甘露醇20g，蒸馏水1000ml，pH7.2。
[0030] PDA培养基：马铃薯200g 葡萄糖 20g 蒸馏水1000ml，pH自然。
[0031] 以上均为液体培养基配方，相应的固体培养基在上述基础上添加琼脂15g，半固体培养基为在上述基础上添加琼脂5g。
[0032] 下述实施例中所用的圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）1.178，公众可从中国工业微生物菌种保藏管理中心甘肃分中心获得该菌株，以重复本申请的实验。
[0033] 下述实施例中所用的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）ACCC30373，公众可从中国农业微生物菌种保藏管理中心获得该菌株，以重复本申请的实验。
[0034] 实施例1 黄色短波单胞菌D3 CGMCC No.17101的分离
[0035] 取5g土样（采自甘肃省漳县）放入三角瓶中，加入50ml无菌水，封口后于摇床震荡20min制成混悬液，吸取5ml加入100ml固氮菌富集培养基中，28℃培养，72h后吸取5ml菌液加入100ml固氮菌富集培养基继续培养，重复培养三次后进行单菌落分离。分离采用平板划线法与梯度稀释法：平板划线法即用接种环蘸取菌液在阿须贝固体培养基上进行划线分离；梯度稀释法是将培养后的菌液按照10-2、10-4、10-6、10-8稀释度用无菌水制成菌悬液后，吸取0.1ml在阿须贝固体培养基上均匀涂布。涂布好的平板于28℃静置培养，5-7d后挑取单菌落用平板划线法进行菌种纯化。将分离纯化所得的其中一个菌株命名为D3。
[0036] 实施例2 黄色短波单胞菌D3 CGMCC No.17101的鉴定。
[0037] 从以下三方面对分离纯化得到的D3菌株进行鉴定。
[0038] 一、形态学鉴定
[0039] 将实施例1分离得到的D3进行单菌落培养并观察菌落，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态（是否平坦、凸起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘状态（是否整齐、不规则、放射状等）。通过生物染色剂染色后进行显微镜镜检。
[0040] 结果表明，分离纯化后得到的菌株D3菌落：菌落直径2-3mm，菌落颜色为黄色，菌落不透明，菌落表面湿润、微凸起，菌落边缘整齐。镜检结果为革兰氏阴性，有鞭毛，无芽孢。
[0041] 二、16s rDNA 序列同源性分离
[0042] 常规方法培养上述步骤分离纯化得到的菌株D3，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，27F ： 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
[0043] 1492R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3在PCR 扩增仪上进行PCR 反应。反应完成后，取2ulPCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR 扩增片段。PCR 产物用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行。取各个菌种纯化后的PCR 产物，使用测序仪ABI3730-XL 进行DNA 测序。与NCBI GenBank 中的已知序列进行同源性比较后，判定细菌种类，将细菌划分到属或种。
[0044] PCR基因扩增得到菌株D3的16s rDNA基因片段约1.3kb，测定序列后与NCBI数据库中已公开的16s rDNA序列进行在线同源性比较，结果显示D3与黄色短波单胞菌（Brevundimonas aurantiaca）的同源性最高，达到99%。
[0045] 菌株D3的16s rDNA 序列相见序列表中的序列1。
[0046] 三、生理生化特征分析
[0047] 所述菌株D3的生理生化特征测定结果如下：
[0048] 生长温度：4℃不生长，28℃生长，37℃生长；
[0049] 耐盐性实验：0.5% NaCl生长，5% NaCl生长,10%NaCl不生长；
[0050] 糖发酵实验：葡萄糖阳性，D-木糖阴性，甘露醇阳性，乳糖阳性，纤维素阴性，L-阿拉伯糖阴性；
[0051] 水解淀粉实验：阳性；
[0052] 利用柠檬酸盐：阴性；
[0053] 水解酪蛋白：阳性；
[0054] 接触酶反应：阳性；
[0055] 脂肪酶反应：阳性。
[0056] 鉴于上述形态、16s rDNA序列同源性分析、生理生化特征分析结果，将实施例1中分离纯化得到的居住D3鉴定为细菌域黄色短波单胞菌（Brevundimonas aurantiaca）。该黄色短波单胞菌（Brevundimonas aurantiaca）D3已于2019年01月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.17101。
[0057] 实施例3 黄色短波单胞菌D3 CGMCC No.17101的固氮酶活性测试
[0058] 对实施例1分离纯化得到的黄色短波单胞菌（Brevundimonas aurantiaca）D3 CGMCC No.17101进行固氮酶活性测试，采用乙炔还原法，具体方法如下所述：制备获得D3菌株的悬浮液（细胞，1×108ml-1），取1ml接种于盛有5ml半固体阿须贝培养基的血清瓶中， 28℃下培养48h。将血清瓶瓶盖换成橡胶塞，并用无菌注射器抽出10%的气体，然后注入10%乙炔，再在28℃下培养36h。用无菌注射器从血清瓶中抽取混合气体0.2ml注入气相色谱仪，测定乙烯生成量，根据以下公式计算固氮酶活性。N=hxCV/(24.9hst)。其中N为固氮酶活性，即产生乙炔的浓度（C2H2，nmol h-1 ml-1），hx为样品峰值，C为标准乙烯浓度（nmol ml-1），V为培养容器体积(ml)，24.9为常数，hs为标准乙烯峰值，t为样品培养时间(h)。以固氮培养基培养圆褐固氮菌1.178，以同样的方法测定其固氮酶活性作为参照。以上实验均设三组重复。
[0059] 结果显示，实施例1中分离纯化得到的黄色短波单胞菌（Brevundimonas aurantiaca）D3 CGMCC No.17101的固氮酶活性为182.3（C2H2，nmol h-1 ml-1），而圆褐固氮菌1.178的固氮酶活性仅为124.60（C2H2，nmol h-1 ml-1）。这一结果表明，本发明的黄色短波单胞菌（Brevundimonas aurantiaca）D3 CGMCC No.17101具有比传统生物固氮肥料中所使用的菌株圆褐固氮菌1.178更高的固氮能力，在拌种剂、育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
[0060] 实施例4 黄色短波单胞菌D3 CGMCC No.17101对白条党参浸出物的耐受性测试[0061] 以从甘肃省漳县采得的白条党参（晾干）为样品，测定D3对其浸出物的耐受性。以样品白条党参中党参炔苷含量作为衡量白条党参中有效成分的指标。通过HPLC检测样品白条党参中党参炔苷含量为231.25ug/g，样品白条党参根系表面土壤中党参炔苷含量为1.375 ug/g。
[0062] 将样品白条党参粉碎后过80目筛，收集白条党参粉末。精确称取5g白条党参粉末，加入100ml双蒸水，煮沸30min后过滤，得到50ml白条党参浸出液，按照体积比5%、10%、15%、20%代替水添加入阿须贝培养基中，接入3%对数生长期D3菌液，28℃下培养72h后测定培养液中的活菌数量。以圆褐固氮菌1.178作为对照，以不加白条党参浸出液的阿须贝培养基作为空白。实验结果如下：
[0063] 浸出液添加量(%) 0 5 10 15 20白条党参含量(g/ml) 0 0.005 0.01 0.015 0.02
党参炔苷含量(ug/ml) 0 1.1563 2.3125 3.4688 4.6250
D3活菌数(个/ml) 7.2×109 4.8×109 9.2×108 3.9×109 5.1×106
1.178活菌数(个/ml) 4.9×109 5.9×107 7.3×105 4.1×106 3.5×106
党参炔苷含量(ug/ml) 0 1.1563 2.3125 3.4688 4.6250
D3活菌数(个/ml) 7.2×109 4.8×109 9.2×108 3.9×109 5.1×106
1.178活菌数(个/ml) 4.9×109 5.9×107 7.3×105 4.1×106 3.5×106
[0064] 实验结果表明，对照组圆褐固氮菌1.178在党参炔苷含量为1.16 ug/ml时，其活菌数量就已经下降了两个数量级，表明白条党参浸出液对1.178的生长产生了影响，虽未达到杀灭的程度，但仍具有一定抑制作用，而白条党参根际表面土壤中的党参炔苷含量为1.375 ug/g，高于实验组数值，进一步证明1.178在白条党参根际表面的定殖性差，无法正常生长代谢，因而无法发挥其固氮作用。黄色短波单胞菌D3 CGMCC No.17101对白条党参浸出液具有良好的耐受性，当培养基中党参炔苷含量达到3.47 ug/ml时，D3的活菌数量仍能达到3.9×109个/ml，与空白组的活菌数量级相当，证明D3在高浓度白条党参浸出液中仍能保持高活性，能继续发挥其代谢作用。D3对白条党参根际土壤具有良好的适应性和定殖性，在高浓度白条党参挥发物的土壤中仍能发挥高效的代谢作用，是种植白条党参的优选菌株。
[0065] 实施例5 黄色短波单胞菌D3 CGMCC No.17101对尖孢镰刀菌的抑制作用测试[0066] 采用牛津杯法测定黄色短波单胞菌D3 CGMCC No.17101对尖孢镰刀菌的抑制作用。用直径8mm的打孔器将尖孢镰刀菌菌落制成相应尺寸的菌饼，接种于预装有PDA固体培养基的90mm培养皿的中央，将4个牛津杯放置在距平板中心25mm的4个对称角点上。处理组：将处于对数生长期的D3菌液注入其中3个牛津杯，每个牛津杯0.1ml，第4个牛津杯中注入
0.1ml无菌水，平行三组。另在一个平板的四个牛津杯中均注入0.1ml无菌水，作为空白对照。上述平板均放置于28℃培养5-7d，待空白组的菌落长满整个平板结束培养。测量处理组和空白组的尖孢镰刀菌菌落直径，取多次测量的平均数，根据以下公式，计算抑菌率。
0.1ml无菌水，平行三组。另在一个平板的四个牛津杯中均注入0.1ml无菌水，作为空白对照。上述平板均放置于28℃培养5-7d，待空白组的菌落长满整个平板结束培养。测量处理组和空白组的尖孢镰刀菌菌落直径，取多次测量的平均数，根据以下公式，计算抑菌率。
[0067] 抑菌率（%）=[(A-B)/(A-8)]×100%
[0068] 其中：A为空白组菌落直径，B为处理组菌落直径。
[0069] 实验结果显示，D3 CGMCC No.17101对尖孢镰刀菌的抑制率为78.3±1.55%，证明D3对尖孢镰刀菌有明显的抑制作用，可用于白条党参根腐病的防控。