一种干燥细胞模型及其建立方法以及应用

摘要

一种干燥细胞模型建立方法，包括以下步骤：细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下进行培养；细胞干燥步骤，吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液，在风速小于0.1m/s、相对湿度在10.0％及以下，25℃±5℃的条件下暴露细胞；再培养步骤，在控温、控湿条件下对细胞进行再培养，使经干燥处理的细胞活力降至45％‑70％，其中，细胞活力是指由WST‑1方法测得，将在给定条件下进行孵育后的未经干燥处理组的吸光度值定义为100％，在给定条件下对经干燥处理组进行同样的孵育后，测定其吸光度值，得到经干燥处理组的吸光度值/未经干燥处理组的吸光度值的检测结果，并以百分比表示的所述检测结果；此方法可以用于评价化妆品及其原料的干燥保护和/或干燥修复性能。

权利要求

1.一种干燥细胞模型建立方法，所述方法包括以下步骤：细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下对细胞进行培养；

细胞干燥步骤，吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液，然后在风速小于0.1m/s、相对湿度在10.0%以下，温度在25℃±5℃的条件下暴露细胞；

再培养步骤，在控温、控湿条件下对细胞进行再培养，使经干燥处理的细胞活力降至

45%‑70%，其中，经干燥处理的细胞活力是指由WST‑1方法测得，将在给定条件下进行孵育后的未经干燥处理组的吸光度值定义为细胞活力为100%，在给定条件下对经干燥处理组进行同样的孵育后，测定其吸光度值，得到经干燥处理组的吸光度值/未经干燥处理组的吸光度值的检测结果，并以百分比表示的所述检测结果；

其中，用于构建所述干燥细胞模型的细胞是人皮肤细胞，所述人皮肤细胞是人皮肤成纤维细胞。

2.根据权利要求1所述的干燥细胞模型建立方法，其中，使用复苏后第3 4代的人皮肤~

成纤维细胞。

3.根据权利要求1或2所述的干燥细胞模型建立方法，其中，在细胞培养步骤中，当贴壁培养的人皮肤细胞在细胞培养皿中达到80%以上融合时，对该处理后的细胞进行消化、然后混匀计数之后，加入细胞培养板，对细胞进行培养。

4.根据权利要求3所述的干燥细胞模型建立方法，其中，所述在细胞培养板上的细胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养24‑48小时。

5.根据权利要求1 4中任一项所述的干燥细胞模型建立方法，其中，~

在细胞干燥步骤中，所述干燥步骤在超净工作台内完成；吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液；将用于培养细胞的细胞培养板向下倾斜30‑60度角，吸净孔内培养液，然后将上述吸干培养液之后的细胞放入干燥器内进行干燥。

6.根据权利要求5所述的干燥细胞模型建立方法，其中，在所述干燥器内在20‑30℃的温度、干燥10‑60分钟来完成干燥步骤。

7.根据权利要求1 4中任一项所述的干燥细胞模型建立方法，其中，~

在再培养步骤中，所述培养在控温、控湿条件下进行。

8.根据权利要求7所述的干燥细胞模型建立方法，其中，所述再培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养16‑24小时，采用无血清培养体系。

9.一种对药剂的保湿/防干燥效果进行体外评价的方法，其包括：细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下对细胞进行体外培养；

加药步骤，向经培养之后得到的细胞加入用无血清细胞培养液稀释至给定浓度的待评价药剂，继续培养16‑24小时，制备出经药剂处理的细胞，以及向经培养之后得到的细胞加入上述无血清培养液，继续培养16‑24小时，制备出正常对照细胞；

细胞干燥步骤，吸干上述经药剂处理的细胞和正常对照细胞的细胞培养液，取上述经药剂处理的细胞和一部分正常对照细胞，在风速小于0.1m/s、相对湿度在10.0%及以下，温o o

度在25 C±5C的条件下暴露细胞，分别得到样品组和干燥模型组，干燥模型组细胞活力降至45%‑70%，另一部分正常对照细胞作为未经干燥处理组，吸干后立刻进行下一步再培养步骤；其中，细胞活力是指由WST‑1方法测得，将在给定条件下进行孵育后的未经干燥处理组的吸光度值定义为细胞活力为100%，在给定条件下对样品组和干燥模型组进行同样的孵育后，测定其吸光度值，得到样品组或干燥模型组的吸光度值/未经干燥处理组吸光度值的检测结果，并以百分比表示的所述检测结果；

再培养步骤，向上述样品组、干燥模型组和未经干燥处理组细胞中加入新的无血清培养液，继续培养给定时间；

结果评价步骤，根据样品组和干燥模型组的给定参数的检测结果差异，来评价所述药剂的干燥保护效果；

其中，用于构建所述干燥细胞模型的细胞是人皮肤细胞，所述人皮肤细胞是人皮肤成纤维细胞。

10.一种对药剂的干燥修复效果进行体外评价的方法，其包括：细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下对细胞进行体外培养；

细胞干燥步骤，吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液，然后在风速小于0.1m/s、相对湿o o

度在10.0%及以下，温度在25C±5C的条件下暴露细胞，使这部分细胞活力降至45%‑70%；留取部分细胞不暴露于干燥环境，作为未经干燥处理组，吸干培养液后立刻进行再培养步骤；

其中，细胞活力是指由WST‑1方法测得，将在给定条件下进行孵育后的未经干燥处理组的吸光度值定义为细胞活力为100%，在给定条件下对样品组和干燥模型组进行同样的孵育后，测定其吸光度值，得到样品组或干燥模型组吸光度值/未经干燥处理组吸光度值的检测结果，并以百分比表示的所述检测结果；

加药步骤，将上述经细胞干燥步骤处理的细胞分为两组，分别加入无血清细胞培养液和用无血清细胞培养液稀释至给定浓度的待评价药剂，制备出干燥模型组和样品组；

再培养步骤，向上述未经干燥处理组细胞中加入新鲜无血清培养液，与经加药步骤处理的干燥模型组和样品组一起，继续培养给定时间；

结果评价步骤，根据样品组和干燥模型组的给定参数的检测结果差异，来评价所述药剂的干燥修复效果；

其中，用于构建所述干燥细胞模型的细胞是人皮肤细胞，所述人皮肤细胞是人皮肤成纤维细胞。

11.根据权利要求9或10所述的体外评价方法，其中，使用复苏后第3 4代的人皮肤成纤维细胞。

~

12.根据权利要求9或10所述的体外评价方法，其中，在细胞培养步骤中，采用人皮肤细胞在细胞培养皿达到80%以上融合时，对该处理后的

4 5

细胞消化，然后混匀计数之后，调细胞密度2×10‑5×10个/mL，每孔100‑150μL，加入细胞培养板，对细胞进行培养。

13.根据权利要求12所述的体外评价方法，其中，所述在细胞培养板上的细胞培养是在

37℃、饱和湿度下CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养24‑48小时。

14.根据权利要求9或10所述的体外评价方法，其中，在细胞干燥步骤中，所述干燥步骤在超净工作台内完成；吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液；将用于培养细胞的细胞培养板向下倾斜30‑60度角，吸净孔内培养液，然后将上述吸干培养液之后的细胞放入干燥器内进行干燥。

15.根据权利要求14所述的体外评价方法，其中，在所述干燥器内在20‑30℃的温度、干燥10‑60分钟来完成干燥步骤。

16.根据权利要求9或10所述的体外评价方法，其中，所述给定参数是样品组和/或干燥模型组相对于未经干燥处理组的细胞活力，或者样品组和/或干燥模型组相对于未经干燥处理组的水通道蛋白3表达量。

17.根据权利要求9或10所述的体外评价方法，其中，在加药步骤中，在细胞培养板上药剂或无血清培养液的加入量为每孔100‑150μL，各组的加入量保持相同。

18.根据权利要求9或10所述的体外评价方法，其中，在再培养步骤中，各组经处理后继续培养的给定时间为16‑24小时。

19.根据权利要求9或10所述的体外评价方法，其中，计算细胞活力是在再培养步骤之后，加入WST‑1孵育0.5‑4小时后测定其细胞活力。

20.根据权利要求9或10所述的体外评价方法，其中，所述药剂包括但不限于甘油、透明质酸、聚谷氨酸、银耳多糖。

说明书

一种干燥细胞模型及其建立方法以及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种对化妆品及其原料的保湿性进行评价的方法，特别涉及一种在细胞水平评价化妆品及其原料保湿性以及对干燥损伤的防护与修复功效的方法。

背景技术

[0002] 保湿是皮肤护理的基本诉求，保湿功效是化妆品最基本的功能，因而宣称保湿的化妆品在整个化妆品品类中占有最高的比例。研究者们也在不断推出新的作用机制、新的
保湿功效评价方法。《化妆品保湿功效评价指南》是国内首个关于化妆品功效评价的行业标
准，对规范化妆品市场秩序，提升化妆品质量水平，起到促进作用。该方法是用电容法测定
人皮肤角质层含水量以及用经皮水分散失来评价护肤品的保湿性。此方法需要专用仪器，
耗费大量人力资源，且对测试环境温度及相对湿度要求严格。

[0003] 皮肤细胞作为化妆品所接触人体的第一道屏障，从细胞水平来测定保湿性是一种亟待开发的保湿性评价方法。目前皮肤细胞已有商业化的细胞株方便购买，易于培养，且受
外界环境影响较小，节省较多人力资源。所以从细胞水平来评价化妆品及其原料的保湿性
是一种经济实惠的方法。

[0004] 专利CN102888439A公开了一种用于体外评估保湿/抗干燥损伤功效的方法，该方法构建了一种细胞干燥模型，包括以培养基培养细胞、细胞同步化、细胞铺板、加入药物、干
燥和噻唑蓝测定步骤，所述干燥步骤为：吸去培养基后，在干燥风速0.1m/s‑1.0m/s、湿度为
15％‑50％和20‑30℃温度下放置5min‑20min。

[0005] 一般可用烘箱干燥法、风吹干燥法来对细胞造成干燥损伤，制备干燥模型。但是烘箱较难精确保持温度，一般烘箱的最低温度是环境温度加10℃，在炎热的夏季，烘箱温度一
般是40‑45℃，在此温度下进行干燥，会对细胞造成一定程度的热损伤。而风吹干燥法一般
是在超净台中利用超净台的风来对细胞造成干燥损伤，这种方法的缺点是需要垂直气流的
超净台，且超净台风速不稳定及风速的均匀性不佳，对实验结果稳定性影响较大。

发明内容

[0006] 本发明的目的是建立一种人皮肤细胞干燥模型，其可以用于评价化妆品及其原料保湿性能。

[0007] 具体地，本发明涉及：

[0008] 1.一种干燥细胞模型建立方法，所述方法包括以下步骤：

[0009] 细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下对细胞进行培养；

[0010] 细胞干燥步骤，吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液，然后在风速小于0.1m/s、相对湿度在10.0％以下，温度在25℃±5℃的条件下暴露细胞；

[0011] 再培养步骤，在控温、控湿条件下对细胞进行再培养，使经干燥处理的细胞活力降至45％‑70％，其中，经干燥处理的细胞活力是指由WST‑1方法测得，将在给定条件下进行孵
育后的未经干燥处理组的吸光度值定义为细胞活力为100％，在给定条件下对经干燥处理
组进行同样的孵育后，测定其吸光度值，得到经干燥处理组的吸光度值/未经干燥处理组的
吸光度值的检测结果，并以百分比表示的所述检测结果。

[0012] 2.根据项1所述的干燥细胞模型建立方法，其中，

[0013] 用于构建所述干燥细胞模型的细胞是人皮肤细胞，

[0014] 所述人皮肤细胞选自人皮肤成纤维细胞或者人皮肤角质形成细胞；

[0015] 优选使用复苏后第3～4代的人皮肤成纤维细胞或人皮肤角质形成细胞。

[0016] 3.根据项1或2所述的干燥细胞模型建立方法，其中，

[0017] 在细胞培养步骤中，采用人皮肤细胞在细胞培养皿达到80％以上融合时，对该处理后的细胞进行消化、然后混匀计数之后，加入细胞培养板，对细胞进行培养；

[0018] 优选所述在细胞培养板上的细胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养24‑48小时。

[0019] 4.根据项1～3中任一项所述的干燥细胞模型建立方法，其中，

[0020] 在细胞干燥步骤中，所述干燥步骤在超净工作台内完成；吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液；将用于培养细胞的细胞培养板向下倾斜30‑60度角，吸净孔内培养液，然后
将上述吸干培养液之后的细胞放入干燥器内进行干燥。

[0021] 5.根据项4所述的干燥细胞模型建立方法，其中，

[0022] 在所述干燥器内在20‑30℃的温度、干燥10‑60分钟来完成干燥步骤。

[0023] 6.项1～3中任一项所述的干燥细胞模型建立方法，其中，

[0024] 在再培养步骤中，所述培养在控温、控湿条件下进行；优选所述再培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养16‑24小时，采用无血清培养体系。

[0025] 7.一种干燥细胞模型，其是经如下步骤对人皮肤细胞进行处理构建而成的细胞模型：

[0026] 细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下对细胞进行体外培养；

[0027] 细胞干燥步骤，吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液，然后在风速小于0.1m/s、相对湿度在10.0％及以下，温度在25℃±5℃的条件下暴露细胞；

[0028] 再培养步骤，在控温、控湿条件下对细胞进行再培养，使经干燥处理的细胞活力降至45％‑70％，其中，经干燥处理的细胞活力是指由WST‑1方法测得，将在给定条件下进行孵
育后的未经干燥处理组的吸光度值定义为细胞活力为100％，在给定条件下对经干燥处理
组进行同样的孵育后，测定其吸光度值，得到经干燥处理组的吸光度值/未经干燥处理组的
吸光度值的检测结果，并以百分比表示的所述检测结果。

[0029] 8.根据项7所述的干燥细胞模型，其中，

[0030] 用于构建所述干燥细胞模型的细胞是人皮肤细胞，

[0031] 所述人皮肤细胞选自人皮肤成纤维细胞或者人皮肤角质形成细胞；优选使用复苏后第3～4代的人皮肤成纤维细胞或人皮肤角质形成细胞。

[0032] 9.根据项7或8所述的干燥细胞模型，其中，

[0033] 在细胞培养步骤中，采用人皮肤细胞在细胞培养皿达到80％以上融合时，对该处理后的细胞消化、混匀计数后加入细胞培养板，对细胞进行培养；优选所述在细胞培养板上
的细胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养24‑48小时。

[0034] 10.根据项7～9中任一项所述的干燥细胞模型，其中，

[0035] 在细胞干燥步骤中，所述干燥步骤在超净工作台内完成；吸干经细胞培养步骤培养后的细胞培养液；将用于培养细胞的细胞培养板向下倾斜30‑60度角，吸净孔内培养液，
然后将上述吸干培养液之后的细胞放入干燥器内进行干燥。

[0036] 11.根据项10所述的干燥细胞模型，其中，

[0037] 在所述干燥器内在20‑30℃的温度、干燥10‑60分钟来完成干燥步骤。

[0038] 12.根据项7～9中任一项所述的干燥细胞模型，其中，

[0039] 在再培养步骤中，所述培养在控温、控湿条件下进行；优选所述再培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养16‑24小时，采用无血清培养体系。

[0040] 13.一种对药剂的保湿/防干燥效果进行体外评价的方法，其包括：

[0041] 细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下对细胞进行体外培养；

[0042] 加药步骤，向经培养之后得到的细胞加入用无血清细胞培养液稀释至给定浓度的待评价药剂，继续培养16‑24小时，制备出经药剂处理的细胞，以及向经培养之后得到的细
胞加入上述无血清培养液，继续培养16‑24小时，制备出正常对照细胞；

[0043] 细胞干燥步骤，吸干上述经药剂处理的细胞和正常对照细胞的细胞培养液，取上述经药剂处理的细胞和一部分正常对照细胞，在风速小于0.1m/s、相对湿度在10.0％及以
下，温度在25℃±5℃的条件下暴露细胞，分别得到样品组和干燥模型组，另一部分正常对
照细胞作为未经干燥处理组，吸干后立刻进行下一步再培养步骤；

[0044] 再培养步骤，向上述样品组、干燥模型组和未经干燥处理组细胞中加入新的无血清培养液，继续培养给定时间，使干燥模型组细胞活力降至45％‑70％，其中，细胞活力是指
由WST‑1方法测得，将在给定条件下进行孵育后的未经干燥处理组的吸光度值定义为细胞
活力为100％，在给定条件下对样品组和干燥模型组进行同样的孵育后，测定其吸光度值，
得到样品组或干燥模型组的吸光度值/未经干燥处理组的吸光度值的检测结果，并以百分
比表示的所述检测结果；

[0045] 结果评价步骤，根据样品组和干燥模型组的给定参数的检测结果差异，来评价所述药剂的干燥保护效果。

[0046] 14.一种对药剂的干燥修复效果进行体外评价的方法，其包括：

[0047] 细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下对细胞进行体外培养；

[0048] 细胞干燥步骤，吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液，然后在风速小于0.1m/s、相对湿度在10.0％及以下，温度在25℃±5℃的条件下暴露细胞；留取部分细胞不暴露于干燥
环境，作为未经干燥处理组，吸干培养液后立刻进行再培养步骤；

[0049] 加药步骤，将上述经细胞干燥步骤处理的细胞分为两组，分别加入无血清细胞培养液和用无血清细胞培养液稀释至给定浓度的待评价药剂，制备出干燥模型组和样品组；

[0050] 再培养步骤，向上述未经干燥处理组细胞中加入新鲜无血清培养液，与经加药步骤处理的干燥模型组和样品组一起，继续培养给定时间，使干燥模型组细胞活力降至45％‑
70％，其中，细胞活力是指由WST‑1方法测得，将在给定条件下进行孵育后的未经干燥处理
组的吸光度值定义为细胞活力为100％，在给定条件下对样品组和干燥模型组进行同样的
孵育后，测定其吸光度值，得到样品组或干燥模型组吸光度值/未经干燥处理组的吸光度值
的检测结果，并以百分比表示的所述检测结果；

[0051] 结果评价步骤，根据样品组和干燥模型组的给定参数的检测结果差异，来评价所述药剂的干燥修复效果。

[0052] 15.根据项13或14所述的体外评价方法，其中，

[0053] 用于构建所述干燥细胞模型的细胞是人皮肤细胞，

[0054] 所述人皮肤细胞选自人皮肤成纤维细胞或者人皮肤角质形成细胞；优选使用复苏后第3～4代的人皮肤成纤维细胞或人皮肤角质形成细胞。

[0055] 16.根据项13或14所述的体外评价方法，其中，

[0056] 在细胞培养步骤中，采用人皮肤细胞在细胞培养皿达到80％以上融合时，对该处4 5
理后的细胞消化，然后混匀计数之后，调细胞密度2×10‑5×10个/mL，每孔100‑150μL，加
入细胞培养板，对细胞进行培养；

[0057] 优选所述在细胞培养板上的细胞培养是在37℃、饱和湿度下CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养24‑48小时。

[0058] 17.根据项13或14所述的体外评价方法，其中，

[0059] 在细胞干燥步骤中，所述干燥步骤在超净工作台内完成；吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液；将用于培养细胞的细胞培养板向下倾斜30‑60度角，吸净孔内培养液，然后
将上述吸干培养液之后的细胞放入干燥器内进行干燥。

[0060] 18.根据项17所述的体外评价方法，其中，

[0061] 在所述干燥器内在20‑30℃的温度、干燥10‑60分钟来完成干燥步骤。

[0062] 19.根据项13或14所述的体外评价方法，其中，

[0063] 所述给定参数是样品组和/或干燥模型组相对于未经干燥处理组的细胞活力，或者样品组和/或干燥模型组相对于未经干燥处理组的水通道蛋白3表达量。

[0064] 20.根据项13或14所述的体外评价方法，其中，

[0065] 在加药步骤中，在细胞培养板上药剂或无血清培养液的加入量为每孔100‑150μL，各组的加入量保持相同。

[0066] 21.根据项13或14所述的体外评价方法，其中，

[0067] 在再培养步骤中，各组经处理后继续培养的给定时间为16‑24小时。

[0068] 22.根据项13或14所述的体外评价方法，其中，

[0069] 计算细胞活力是在再培养步骤之后，加入WST‑1孵育0.5‑4小时后测定其细胞活力。

[0070] 23.根据项13或14所述的体外评价方法，其中，

[0071] 所述有保湿功效的药剂包括但不限于各种保湿原液类化妆品、甘油、透明质酸、聚谷氨酸、银耳多糖。

[0072] 本发明的有益技术效果：

[0073] 利用本发明建立的干燥细胞模型的方法，可以获得有效的干燥细胞模型，并且该干燥细胞模型可以有效地用于评估药剂的保湿效果，从而为保湿性护肤品对皮肤的保湿效
果的评价提供了一种新的方法，也为皮肤干燥患者用特殊保湿护肤品的研制提供了一种新
的细胞模型。

[0074] 按如下方法使用本发明的干燥细胞模型：使用两种皮肤细胞进行复苏，培养，铺板，加药，然后置于可以调节湿度的干燥器中一定时间，使其失水，对细胞造成一定程度的
干燥损伤。用水溶性四氮唑(WST‑1)法测定细胞活性，荧光染色法测定水通道蛋白3型
(AQP3)的表达；使用上述两种参数进行最终的结果评价。该细胞模型显著降低细胞中线粒
体活性，并使AQP3表达降低，为保湿性护肤品对皮肤的保湿效果的评价提供了一种新的方
法，也为皮肤干燥患者用特殊保湿护肤品的研制提供了新的细胞模型。

[0075] 综上所述，本发明的技术方案取得了诸多的有益技术效果：本发明使用密闭的干燥器，设备简单，易操作，只要对干燥器内的相对湿度控制在一定的范围，就能具有结果重
现性高的良好效果。本发明在从属权利要求中还特别突出了以下技术窍门：成纤维细胞比
角质层细胞建立模型的效果好；WST‑1比MTT的结果评价精确度高。

附图说明

[0076] 图1为在20倍物镜下细胞形态的对比；

[0077] 图2为在10倍物镜下细胞中水通道蛋白3表达情况的对比。

具体实施方式

[0078] 下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限
制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整
的传达给本领域的技术人员。

[0079] 需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利
要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的
准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解
释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以
说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利
要求所界定者为准。

[0080] 本发明的第一方面涉及一种干燥细胞模型建立方法，该方法包括以下步骤：

[0081] 细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下对细胞进行培养；

[0082] 细胞干燥步骤，吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液，然后在风速小于0.1m/s、相对湿度在10.0％及以下，温度在25℃±5℃的条件下暴露细胞；

[0083] 再培养步骤，在控温、控湿条件下对细胞进行再培养，使经干燥处理的细胞活力降至45％‑70％，其中，经干燥处理的细胞活力是指由WST‑1方法测得，将在给定条件下进行孵
育后的未经干燥处理组的吸光度值定义为细胞活力为100％，在给定条件下对经干燥处理
组进行同样的孵育后，测定其吸光度值，得到经干燥处理组的吸光度值/未经干燥处理组的
吸光度值的检测结果，并以百分比表示的所述检测结果。

[0084] 在控温、控湿条件下对细胞进行再培养，使经干燥处理的细胞活力降至45％‑70％是指，利用检测的经干燥处理组的吸光度值除以未经干燥处理组的吸光度值，由此得到的
数值乘以100％，从而获得经干燥处理的细胞活力，该计算结果降至45％‑70％。

[0085] 在此，“给定条件”是指在实施WST‑1方法期间对细胞进行孵育时所使用的条件，特别是指，避光条件下，在细胞培养板上相应的孔中加入10μL WST‑1溶液(每孔已加入100μL
无血清细胞培养液)，于37℃下在培养箱内孵育2小时。

[0086] 在优选的实施方式中，干燥时的风速小于0.05m/s，特别是小于0.02m/s，优选小于0.01m/s；在优选的实施方式中，干燥时的相对湿度在10％及以下，特别是在8％以下；在优
选的实施方式中，干燥时的温度在25℃±2℃；在优选的实施方式中使该细胞活力降至
45％‑70％、优选细胞活力为55～65％。

[0087] 在一个具体的实施方式中，“在控温条件下培养”特别是指在37℃下培养；在一个具体的实施方式中，上述方法使用的是人皮肤细胞，该人皮肤细胞选自人皮肤成纤维细胞
或者人皮肤角质形成细胞。

[0088] 在本说明书的上下文中，成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，
多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。根据不
同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞
质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互
相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分
重要的作用。在国王学院研究人员一项针对小鼠的研究中，发现小鼠皮肤中的成纤维细胞
至少有两种类型：一种是结缔组织上层的成纤维细胞，它们是皮肤毛囊形成所必须；另一种
则是结缔组织下层的成纤维细胞，这部分细胞负责制造大部分的皮肤胶原纤维，触发受损
皮肤的修复。通过皮肤表皮信号的刺激可增加成纤维细胞的数量，而成纤维细胞数量的增
多有助于伤口愈合过程中毛囊的形成，以及降低皮肤愈合后落下疤痕的几率。

[0089] 在本说明书的上下文中，角质形成细胞是表皮的主要构成细胞，数量占表皮细胞的80％以上，在分化过程中产生角蛋白。根据分化阶段和特点可分为五层，由内至外分别为
基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。

[0090] 角质层细胞位于皮肤表皮层，但存在不易培养的缺点。成纤维细胞位于真皮层，更易培养，但是成纤维细胞在普通的风干条件下存在不易干燥损伤的缺点，而在干燥器中干
燥，则更容易造成干燥损伤。

[0091] 在一个具体的实施方式中，优选采用复苏后的第3～4代的人皮肤成纤维细胞或人皮肤角质形成细胞。特别是采用复苏后的第4代细胞。

[0092] 在本说明书的上下文中，“复苏”符合生物技术领域的一般定义，是指将冻存在液氮或者‑80℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，以使细胞恢复生长的过程。

[0093] 在本发明的干燥细胞模型建立方法中，在细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下对细胞进行培养。具体来说，在细胞培养步骤中，采用人皮肤细胞在细胞培养皿
达到80％以上融合时，对该处理后的细胞进行消化、然后混匀计数之后，加入细胞培养板，
对细胞进行培养。

[0094] 在一个具体的实施方式中，在细胞培养板上的细胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养24‑48小时。

[0095] 在此，饱和湿度表示在一定温度下，单位容积空气中所能容纳的水汽量的最大限度。在此，细胞培养皿和细胞培养板符合生物技术领域的一般定义，细胞培养皿为表面经过
处理的聚苯乙烯培养皿，细胞培养板为平底、96孔、表面经过处理的聚苯乙烯培养板。

[0096] 在此，“融合达到80％”是指在培养皿上培养时，贴壁细胞单层覆盖培养皿上表面80％的面积。

[0097] 在一个具体的实施方式中，在干燥步骤中，首先需要吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液，在此，该吸干步骤的操作可以采用注射器、移液管或者移液枪等任何适用的工
具。干燥时候需要控制在风速小于0.1m/s、相对湿度在10.0％及以下，25℃±5℃的条件下，
使该细胞活力降至45％‑70％。在此，细胞活力优选为55％～65％。

[0098] 在一个具体的实施方式中，在细胞干燥步骤中，所述干燥步骤在超净工作台内完成；吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液；将用于培养细胞的细胞培养板向下倾斜30‑60度
角，优选35‑45度角，吸净孔内培养液，然后将上述吸干培养液之后的细胞放入干燥器内进
行干燥。

[0099] 在本发明中，优选方式为在超净工作台中吸液并移转至干燥器，并在干燥器中静置的方式进行干燥步骤，以实现控制风速和湿度的目的；其中，风速的测量可以采用超净工
作台上的风速调节和测量装置；而湿度可以使用湿度计测得，其调节手段可以通过变化干
燥剂的量实现；在此，干燥器使用一般化学实验室的2L玻璃干燥器，所使用的干燥剂包括但
不限于：硫酸钙、氯化钙、硅胶、活性氧化铝以及它们之间的以及与其他适合的干燥剂的组
合。

[0100] 在一个具体的实施方式中，在所述干燥器内在20‑30℃的温度、干燥10‑60分钟来完成干燥步骤。

[0101] 本发明的第二方面涉及一种干燥细胞模型，其是经如下步骤对人皮肤细胞进行处理构建而成的细胞模型：

[0102] 细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下对细胞进行体外培养；

[0103] 细胞干燥步骤，吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液，然后在风速小于0.1m/s、相对湿度在10.0％及以下，温度在25℃±5℃的条件下暴露细胞；

[0104] 再培养步骤，在控温、控湿条件下对细胞进行再培养，使经干燥处理的细胞活力降至45％‑70％，其中，细胞活力是指由WST‑1方法测得，将在给定条件下进行培养之后的未经
干燥处理的、以细胞吸光度值表示的细胞活力定义为100％，在给定条件下对经干燥处理的
细胞进行培养，然后测定其细胞吸光度值，得到经干燥处理的细胞的吸光度值/未经干燥处
理的细胞吸光度值的检测结果，并且以百分比表示的所述检测结果。

[0105] 在此，“给定条件”是指在实施WST‑1方法期间对细胞进行孵育时所使用的条件，特别是指，避光条件下，在细胞培养板上相应的孔中加入10μL WST‑1溶液(每孔已加入100μL
无血清细胞培养液)，于37℃下在培养箱内孵育2小时。

[0106] 在一个具体的实施方式中，用于构建所述干燥细胞模型的细胞是人皮肤细胞，所述人皮肤细胞选自人皮肤成纤维细胞或者人皮肤角质形成细胞；优选使用复苏后第3～4代
的人皮肤成纤维细胞或人皮肤角质形成细胞。

[0107] 在一个具体的实施方式中，在细胞培养步骤中，采用人皮肤细胞在细胞培养皿达到80％以上融合时，对该处理后的细胞消化、混匀计数后加入细胞培养板，对细胞进行培
养；优选所述在细胞培养板上的细胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养
箱内培养24‑48小时。

[0108] 在一个具体的实施方式中，在细胞干燥步骤中，所述干燥步骤在超净工作台内完成；吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液；将用于培养细胞的细胞培养板向下倾斜30‑60度
角，吸净孔内培养液，然后将上述吸干培养液之后的细胞放入干燥器内进行干燥。

[0109] 在一个具体的实施方式中，在所述干燥器内在20‑30℃的温度、干燥10‑60分钟来完成干燥步骤。

[0110] 本发明的第三方面涉及一种对药剂的保湿性和干燥损伤的防护与修复效果进行体外评价的方法。

[0111] 其中，对药剂的保湿/防干燥效果进行评价的方法包括：

[0112] 细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下对细胞进行体外培养；

[0113] 加药步骤，向经培养之后得到的细胞加入用无血清细胞培养液稀释至给定浓度的待评价药剂，继续培养16‑24小时，制备出经药剂处理的细胞，以及向经培养之后得到的细
胞加入上述无血清培养液，继续培养16‑24小时，制备出正常对照细胞；

[0114] 细胞干燥步骤，吸干上述经药剂处理的细胞和正常对照细胞的细胞培养液，取上述经药剂处理的细胞和一部分正常对照细胞，在风速小于0.1m/s、相对湿度在10.0％及以
下，温度在25℃±5℃的条件下暴露细胞，分别得到样品组和干燥模型组，另一部分正常对
照细胞作为未经干燥处理组，吸干后立刻进行下一步再培养步骤；

[0115] 再培养步骤，向上述样品组、干燥模型组和未经干燥处理组细胞中加入新的无血清培养液，继续培养给定时间，使干燥模型组细胞活力降至45％‑70％，其中，细胞活力是指
由WST‑1方法测得，将在给定条件下进行孵育后的未经干燥处理组的吸光度值定义为细胞
活力为100％，在给定条件下对样品组和干燥模型组进行同样的孵育后，测定其吸光度值，
得到样品组或干燥模型组吸光度值/未经干燥处理组吸光度值的检测结果，并以百分比表
示的所述检测结果；

[0116] 结果评价步骤，根据样品组和干燥模型组的给定参数的检测结果差异，来评价所述药剂的干燥保护效果。

[0117] 其中，对药剂的干燥修复效果进行体外评价的方法包括：

[0118] 细胞培养步骤，于细胞培养板上在控温、控湿条件下对细胞进行体外培养；

[0119] 细胞干燥步骤，吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液，然后在风速小于0.1m/s、相对湿度在10.0％及以下，温度在25℃±5℃的条件下暴露细胞；留取部分细胞不暴露于干燥
环境，作为未经干燥处理组，吸干培养液后立刻进行再培养步骤；

[0120] 加药步骤，将上述经细胞干燥步骤处理的细胞分为两组，分别加入无血清细胞培养液和用无血清细胞培养液稀释至给定浓度的待评价药剂，制备出干燥模型组和样品组；

[0121] 再培养步骤，向上述未经干燥处理组细胞中加入新鲜无血清培养液，与经加药步骤处理的干燥模型组和样品组一起，继续培养给定时间，使干燥模型组细胞活力降至45％‑
70％，其中，细胞活力是指由WST‑1方法测得，将在给定条件下进行孵育后的未经干燥处理
组的吸光度值定义为细胞活力为100％，在给定条件下对样品组和干燥模型组进行同样的
孵育后，测定其吸光度值，得到样品组或干燥模型组吸光度值/未经干燥处理组吸光度值的
检测结果，并以百分比表示的所述检测结果；

[0122] 结果评价步骤，根据样品组和干燥模型组的给定参数的检测结果差异，来评价所述药剂的干燥修复效果。

[0123] 在此，先加药步骤、后细胞干燥步骤进行的评价方法的结果体现了待评价药剂的干燥保护效果，而先细胞干燥步骤、后加药步骤的评价方法的结果体现了待评价药剂的干
燥修复效果。

[0124] 在本说明书的上下文中，“给定时间”是指对于所采用细胞活力测定技术(例如WST‑1)所必要的孵育时间，例如为0.5‑4小时，优选2小时。

[0125] 在此，“给定条件”是指在实施WST‑1方法期间对细胞进行孵育时所使用的条件，特别是指，避光条件下，在细胞培养板上相应的孔中加入10μL WST‑1溶液(每孔已加入100μL
无血清细胞培养液)，于37℃下在培养箱内孵育2小时。

[0126] 在一个具体的实施方式中，用于构建所述干燥细胞模型的细胞是人皮肤细胞，所述人皮肤细胞选自人皮肤成纤维细胞或者人皮肤角质形成细胞；优选使用复苏后第3～4代
的人皮肤成纤维细胞或人皮肤角质形成细胞。

[0127] 在一个具体的实施方式中，在细胞培养步骤中，采用人皮肤细胞在细胞培养皿达4 5
到80％以上融合时，对该处理后的细胞消化，然后混匀计数之后，调细胞密度2×10‑5×10
个/mL，每孔100‑150μL，加入细胞培养板，对细胞进行培养；优选所述在细胞培养板上的细
胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO2浓度为5％的细胞培养箱内培养24‑48小时。

[0128] 在一个具体的实施方式中，在细胞干燥步骤中，所述干燥步骤在超净工作台内完成；吸干经细胞培养步骤后的细胞培养液；将用于培养细胞的细胞培养板向下倾斜30‑60度
角，吸净孔内培养液，然后将上述吸干培养液之后的细胞放入干燥器内进行干燥。

[0129] 在一个具体的实施方式中，在所述干燥器内在20‑30℃的温度、干燥10‑60分钟来完成干燥步骤。

[0130] 在一个具体的实施方式中，“给定参数”是样品组和/或干燥模型组相对于未经干燥处理组的细胞活力，或者样品组和/或干燥模型组相对于未经干燥处理组的水通道蛋白3
表达量。

[0131] 在本说明书的上下文中，WST‑1是一种检测细胞线粒体活性的试剂，为一种类似于噻唑蓝(MTT)的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原
生成橙黄色的甲瓒(formazan)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越
浅。WST‑1是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的
优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定
的溶解液来溶解；而WST‑1和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解
步骤。其次，WST‑1产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST‑1比XTT
和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST‑1和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏
度更高。WST‑1使用时无须同位素及有机溶剂，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。
不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外步骤去溶解formazan。WST‑1对细胞无明显
毒性。加入WST‑1显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找
到最佳测定时间。

[0132] 在本说明书的上下文中，水通道蛋白(AQP)是一种位于细胞膜上的蛋白质，能显著增加细胞膜对水分子的通透性。由于表皮层没有血管，表皮层中的水分都是从真皮中扩散
而来，因此，表皮细胞间的AQP就构成了细胞间水分输送的主要通路。迄今为止已发现13种
AQP，其中AQP3是人皮肤中表达量最丰富的水通道蛋白亚型，AQP3除对水分子通透外还对甘
油等具有通透性。目前主要采用Western Blot杂交、免疫组化染色法半定量检测以及商品
化试剂盒ELISA法定量检测AQP3含量的变化，可以作为化妆品保湿功效有效成分的评价指
标之一。

[0133] 在此，评价过程可以简述为：如果干燥模型组的细胞活力和/或AQP表达量显著低于未经干燥处理组，则判定干燥细胞模型有效；如果样品组的细胞活力和/或AQP表达量显
著高于干燥模型细胞，则判定待测药剂有干燥保护/干燥修复效果。

[0134] 在一个具体的实施方式中，在加药步骤中，在细胞培养板上药剂或无血清培养液的加入量为每孔100‑150μL，各组的加入量保持相同。

[0135] 在一个具体的实施方式中，在再培养步骤中，各组经处理后继续培养的给定时间为16‑24小时。

[0136] 在一个具体的实施方式中，计算细胞活力是在再培养步骤之后，加入WST‑1孵育0.5‑4小时后测定其细胞活力。

[0137] 在一个具体的实施方式中，所述有保湿功效的药剂包括但不限于各种保湿原液类化妆品、甘油、透明质酸、聚谷氨酸、银耳多糖。

[0138] 实施例

[0139] 实验例1干燥器法制备人皮肤成纤维细胞的干燥细胞模型

[0140] 1.1试验材料

[0141] 实验材料：人皮肤成纤维细胞，RPMI‑1640培养基，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶。

[0142] 主要设备：玻璃干燥器(直径300mm)，温、湿度计，倒置显微镜，超净工作台，二氧化碳培养箱。

[0143] 1.2实验方法、过程

[0144] 1.2.1实验前准备

[0145] 准备一个玻璃干燥器，加入500g硅胶干燥颗粒(烘箱120℃下4小时)。密闭1小时，测定干燥器内相对湿度为10.0％，温度25℃，紫外灯下照射1小时。

[0146] 1.2.2铺板

[0147] 以5×104个/mL的密度将复苏后第三代的人皮肤成纤维细胞接种于96孔板上，每孔125μL，每个样品设5个复孔。在37℃、5％CO2条件下培养24h。

[0148] 1.2.3干燥

[0149] 在超净工作台内，将96孔板向下倾斜45度角，用1mL注射器，针头豁口向下，吸净孔内培养液。以未吸干的孔作为对照。敞口放入干燥器内，干燥10分钟。

[0150] 1.3WST‑1法测定细胞活力

[0151] 干燥完后，对照孔吸干培养液，模型孔和对照孔每孔加入100μL无血清细胞培养基，关闭超净台内照明灯，每孔加入10μL WST‑1溶液，于培养箱内孵育2小时。同时设空白孔
(无血清培养液和WST‑1，无细胞)。孵育完毕后用酶标仪测定各孔490nm吸光度值。细胞活力
计算见下式：

[0152] 细胞活力(％)＝(经干燥处理组OD值‑空白孔OD值)/(未经干燥处理组OD值‑空白孔OD值)×100

[0153] 1.4结果和分析

[0154] 实验重复三次，细胞活力见下表1。

[0155] 表1 细胞活力(％)

[0156]

[0157] 注：**表示与未经干燥处理组相比p＜0.01

[0158] 结论：用干燥器进行细胞干燥损伤是可行的，其三次平行实验误差在5.0％以内。本方案将成纤维细胞与干燥器法搭配使用，取得了干燥后活力低于70％的良好建模效果。

[0159] 实验例2干燥器法制备人皮肤成纤维细胞的干燥细胞模型

[0160] 2.1具体参数同实验例1，其中将1.2.3中干燥时间替换为30分钟。

[0161] 2.2结果和分析

[0162] 实验重复三次，细胞活力见下表2。

[0163] 表2 细胞活力(％)

[0164]

[0165] 注：**表示与未经干燥处理组相比p＜0.01

[0166] 结论：用干燥器进行细胞干燥损伤是可行的，其三次平行实验误差在5.0％以内。实验例2的干燥损伤效果更为显著。

[0167] 实验例3干燥器法制备人皮肤角质形成细胞干燥模型

[0168] 3.1实验材料

[0169] 实验材料：人皮肤角质形成细胞(HaCaT)，DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶。

[0170] 主要设备：玻璃干燥器(直径300mm)，倒置显微镜，超净工作台，二氧化碳培养箱，温、湿度计

[0171] 3.2实验方法、过程

[0172] 3.2.1实验前准备

[0173] 准备一个玻璃干燥器，加入500g硅胶干燥颗粒(烘箱120℃下4小时)。密闭1小时，测定干燥器内相对湿度为9.0％，温度26℃，紫外灯下照射1小时。

[0174] 3.2.2铺板

[0175] 以5×105个/mL的密度将复苏后第三代的人皮肤角质形成细胞接种于96孔板，每孔100μL，37℃、5％CO2条件下培养24h。

[0176] 3.2.3干燥

[0177] 在超净工作台内，将96孔板向下倾斜45度角，用1mL注射器，针头豁口向下，吸净孔内培养液。以未吸干的孔作为对照。敞口放入干燥器内，干燥10分钟。

[0178] 继续培养24小时后用WST‑1法测定细胞活力。

[0179] 3.3结果和分析

[0180] 实验重复三次，干燥时间为10min，细胞活力见下表3。

[0181] 表3 细胞活力(％)

[0182]

[0183] 注：**表示与未经干燥处理组相比p＜0.01

[0184] 结论：用干燥器进行细胞干燥损伤是可行的，其三次平行实验误差在5.0％以内。对比实验例1和实验例3可以看出，对于更易培养而不易建立干燥模型的成纤维细胞，使用
干燥器法可以取得和角质形成细胞相类似的有利结果。

[0185] 对比例1风干法制备人皮肤成纤维细胞干燥模型

[0186] 1.1试验材料

[0187] 实验材料：人皮肤成纤维细胞，RPMI‑1640培养基，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶。

[0188] 主要设备：超净工作台，二氧化碳培养箱，温、湿度计

[0189] 1.2实验方法、过程：

[0190] 1.2.1铺板

[0191] 以5×104个/mL的密度将复苏后第三代的人皮肤成纤维细胞接种于96孔板，每孔125μL，37℃、5％CO2条件下培养24h。

[0192] 1.2.2干燥

[0193] 将96孔板向下倾斜45度角，用1mL注射器，针头豁口向下，吸净其中的培养液。敞口放入超净台内，温度25℃，风速0.3‑0.5m/s，相对湿度40％±5％，干燥10分钟。加入新的培
养液培养24小时后用WST‑1法测定细胞活力。

[0194] 1.3结果和分析

[0195] 实验重复三次，细胞活力见下表4。

[0196] 表4 细胞活力(％)

[0197]试验次数 未经干燥处理组 经干燥处理组(10min)
1 100.00 64.3
2 100.00 68.02
3 100.00 80.03
平均值 100.00 70.78±6.7**

[0198] 注：**表示与未经干燥处理组相比p＜0.05

[0199] 结论：用风干法进行细胞干燥损伤是可行的，但是实验重复性差，偏差较大。另外可以看出，与干燥器法相比，同样进行10min干燥，使用风干法的细胞活力仍旧较高，较难建
立成纤维细胞的干燥模型。

[0200] 对比例2风干法制备人皮肤角质细胞干燥模型

[0201] 2.1试验材料

[0202] 实验材料：人皮肤角质形成细胞(HaCaT)，DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶。

[0203] 主要设备：超净工作台，二氧化碳培养箱，温湿度计

[0204] 2.2实验方法、过程

[0205] 2.2.1铺板

[0206] 以5×105个/mL的密度将复苏后第三代的人皮肤角质形成细胞接种于96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO2条件下培养24h。

[0207] 2.2.2干燥

[0208] 将96孔板向下倾斜45度角，用1mL注射器，针头豁口向下，吸净其中的培养液。敞口放入超净台内，温度26℃，风速0.3‑0.5m/s，相对湿度40％±5％，干燥10分钟。加入新的培
养液培养24小时后用WST‑1法测定细胞活力。

[0209] 2.3结果和分析

[0210] 实验重复三次，细胞活力见下表5.

[0211] 表5 细胞活力(％)

[0212]

[0213] 注：**表示与未经干燥处理的细胞相比p＜0.01

[0214] 结论：用风干法进行细胞干燥损伤是可行的，但是实验重复性较差，实验偏差较大。

[0215] 对比例3自然干燥法制备人皮肤角质细胞干燥模型

[0216] 3.1试验材料

[0217] 实验材料：人皮肤角质形成细胞(HaCaT)，DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶。

[0218] 主要设备：超净工作台，二氧化碳培养箱，温湿度计

[0219] 3.2实验方法、过程

[0220] 3.2.1铺板

[0221] 以5×105个/mL的密度将复苏后第三代的人皮肤角质形成细胞接种于96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO2条件下培养24h。

[0222] 3.2.2干燥

[0223] 将96孔板向下倾斜60度角，用1mL注射器，针头豁口向下，吸净其中的培养液。敞口放入超净台内，关闭风机，温度26℃，相对湿度40％±5％，干燥60分钟及120分钟。加入新的
培养液培养24小时后用WST‑1法测定细胞活力。

[0224] 3.3结果和分析

[0225] 实验重复三次，细胞活力见下表7.

[0226] 表6 细胞活力(％)

[0227]

[0228] 结论：用自然干燥法进行细胞干燥在2小时内对细胞的损伤都比较小，达不到需要使细胞模型细胞活力降至45％‑70％的损伤程度。

[0229] 对比例4干燥器法制备人皮肤成纤维细胞的干燥细胞模型

[0230] 4.1具体参数同实验例1，其中将测定细胞活力的方法改为MTT法，用二甲基亚砜溶解反应产物后测定吸光度。

[0231] 4.2结果和分析

[0232] 实验重复三次，细胞活力见下表7.

[0233] 表7 细胞活力(％)

[0234]

[0235] 注：**表示与未经干燥处理的细胞相比p＜0.01

[0236] 表8 MTT法与WST‑1法测定细胞活力的对比

[0237]   MTT法 WST‑1法检测灵敏度 高 很高
检测时间 ≥2.5小时 ≥1.0小时
细胞毒性 高，细胞形态完全消失 很低，细胞形态不变

[0238] 结论：用MTT法测定干燥细胞模型的细胞活力是可行的，但是平行试验间误差较实验例1偏大，如表7的结果所示；另外，实验操作更为繁琐，耗时更长。

[0239] 对比例5干燥器法制备人皮肤成纤维细胞干燥细胞模型

[0240] 5.1具体参数同实验例1，其中1.2.3中干燥时间替换为40分钟。

[0241] 5.2结果和分析

[0242] 实验重复三次，细胞活力见下表9.

[0243] 表9 细胞活力(％)

[0244]

[0245] 注：**表示与未经干燥处理的细胞相比p＜0.01

[0246] 结论：用干燥器进行细胞干燥损伤是可行的，其三次平行实验误差在5.0％以内。只是干燥时间过长，细胞活力低于45％，对细胞造成不可逆损伤，加药后，细胞无法修复，则
无法进行保湿评价。

[0247] 表10 不同干燥方式细胞活力

[0248]

[0249]

[0250] 实验例4透明质酸对干燥损伤的防护作用

[0251] 1.1试验材料

[0252] 实验材料：人皮肤成纤维细胞，透明质酸(分子量：148万，华熙生物科技股份有限公司)，RPMI‑1640培养基，胎牛血清，胰蛋白酶。

[0253] 主要设备：玻璃干燥器(直径300mm)，温、湿度计，倒置显微镜，超净工作台，二氧化碳培养箱

[0254] 1.2实验方法、过程：

[0255] 1.2.1实验前准备

[0256] 准备一个玻璃干燥器，加入500g硅胶干燥颗粒(烘箱120℃下4小时)。密闭1小时，测定干燥器内相对湿度为8.0％，温度25℃，紫外灯下照射1小时。

[0257] 1.2.2铺板

[0258] 以5×104个/mL的密度将复苏后第三代的人皮肤成纤维细胞接种于96孔板，每孔125μL，在37℃、5％CO2条件下培养24h。

[0259] 1.2.3加药

[0260] 在超净工作台内，将96孔板向下倾斜45度角，用1mL注射器，针头豁口向下，吸净孔内培养液。模型组和未经干燥处理组仅将旧培养液替换为无血清培养液。样品组弃去培养
液后，加入用无血清培养液配制的透明质酸溶液，每孔100μL，在37℃、5％CO2条件下培养
16h。

[0261] 1.2.4干燥

[0262] 在超净工作台内，将96孔板向下倾斜45度角，用1mL注射器，针头豁口向下，吸净模型组和样品组孔内培养液，将培养板敞口放入干燥器内，干燥30分钟。所有培养孔中加入新
鲜无血清培养液培养24小时后用WST‑1法测定细胞活力。

[0263] 1.3结果和分析

[0264] 细胞干燥后进行测试，结果分子量为148万的透明质酸具有较好的防干燥作用，与干燥模型细胞相比细胞活力提高24.45％。具体结果见表11.

[0265] 表11 透明质酸对细胞干燥损伤的防护作用

[0266]

[0267] 实验例5透明质酸对干燥损伤的修复作用

[0268] 2.1试验材料

[0269] 实验材料：人皮肤成纤维细胞(HSF)，透明质酸(分子量：38万，华熙生物科技股份有限公司)，DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶。

[0270] 主要设备：玻璃干燥器(直径300mm)，倒置显微镜，超净工作台，二氧化碳培养箱，温、湿度计

[0271] 2.2实验方法、过程：

[0272] 2.2.1实验前准备

[0273] 准备一个玻璃干燥器，加入500g硅胶干燥颗粒(烘箱120℃下放置4小时)。密闭1小时，测定干燥器内相对湿度为9.0％，温度27℃，紫外灯下照射1小时。

[0274] 2.2.2铺板

[0275] 以5×105个/mL的密度将复苏后第三代的人皮肤成纤维细胞接种于96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO2条件下培养24h。

[0276] 2.2.3干燥

[0277] 在超净工作台内，将96孔板向下倾斜60度角，用1mL注射器，针头豁口向下，吸净孔内培养液。以未吸干的孔作为对照。敞口放入干燥器内，干燥10分钟。

[0278] 2.2.4加药

[0279] 干燥步骤之后，样品组加入无血清培养液配制的透明质酸溶液，模型组和未经干燥处理组加入无血清培养液，每孔100μL。继续培养24小时后用WST‑1法测定细胞活力。

[0280] 2.3结果和分析

[0281] 细胞干燥10min后加入0.2％的透明质酸作用24小时后进行测试，结果分子量为38万的HA具有较好的修复作用，与干燥模型细胞相比，细胞活力提高14％。具体结果见表12。

[0282] 表12 HA对细胞干燥损伤的修复作用

[0283]

[0284] 实验例6透明质酸水润次抛原液对干燥损伤的保护作用

[0285] 3.1试验材料

[0286] 实验材料：人皮肤角质形成细胞(HaCaT)，透明质酸水润次抛原液(润百颜，华熙生物科技股份有限公司)，DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶。

[0287] 主要设备：玻璃干燥器(直径300mm)，倒置显微镜，超净工作台，二氧化碳培养箱，数显恒温水浴锅

[0288] 3.2实验方法、过程：

[0289] 3.2.1实验前准备

[0290] 准备一个玻璃干燥器，加入500g硅胶干燥颗粒(烘箱120℃下4小时)。密闭1小时，测定干燥器内相对湿度为8.0％，温度26℃，紫外灯下照射1小时。

[0291] 3.2.2铺板

[0292] 以5×105个/mL的密度将复苏后第三代的人皮肤角质形成细胞接种于96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO2条件下培养24h。

[0293] 3.2.3加药

[0294] 在超净工作台内，将96孔板向下倾斜45度角，用1mL注射器，针头豁口向下，吸净孔内培养液。模型组和未经干燥处理组仅将旧培养液替换为无血清培养液。样品组加入用无
血清培养液稀释10倍的透明质酸水润次抛原液溶液，每孔100μL，在37℃、5％CO2条件下培
养16h。

[0295] 3.2.4干燥

[0296] 在超净工作台内，将96孔板向下倾斜60度角，用1mL注射器，针头豁口向下，吸净模型组和样品组孔内培养液，将培养板敞口放入干燥器内，干燥15分钟。

[0297] 所有培养孔中加入新鲜无血清培养液培养24小时后用WST‑1法测定细胞活力。用荧光显微镜拍摄水通道蛋白3表达情况。

[0298] 3.3结果和分析

[0299] 加入稀释10倍的透明质酸水润次抛原液，然后吸出，细胞干燥15min，结果水润次抛原液有较好的防干燥的作用。具体结果见表13以及附图。

[0300] 表13 透明质酸水润次抛原液对细胞干燥损伤的防护作用

[0301]

[0302] 此外，图1和图2分别显示了各组细胞的形态差异和荧光显微镜拍摄的AQP3表达情况。

[0303] 图1是各组细胞的形态照片。基于图1的结果可见细胞干燥后形态皱缩，膜结构受损。而加入透明质酸水润次抛原液后再干燥，细胞形态较好，损伤程度减轻。其中，a：正常对
照细胞b:干燥模型细胞c:透明质酸水润次抛原液+干燥15分钟

[0304] 图2是荧光显微镜拍摄的荧光照片，绿色荧光为AQP3目标蛋白，其光强弱即对应细胞目标蛋白数量的多少。基于图2的结果可见细胞干燥后其表面AQP3荧光强度减弱，而加入
透明质酸水润次抛原液后再干燥，细胞表面荧光强度与干燥模型细胞相比荧光强度有所升
高。其中，d：正常对照细胞e:干燥模型细胞f:透明质酸水润次抛原液+干燥15分钟

[0305] 尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性
的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围
的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。