试验试样是否含有植物病原性菌的判定方法

摘要

本发明提供从植物病原性菌和植物非病原性菌2种菌中选择性地判定试验试样是否含有植物病原性菌的方法。本发明中，首先，在具备通孔的基板的表侧的面配置试验试样。基板在其背侧的面具备纤维素膜。基板的通孔具有7.065平方微米～19.625平方微米的截面积。纤维素膜不具有通孔、且具有0.5微米～3.7微米的厚度。接着，将试验试样静置，对纤维素膜照射紫外线，使其与菌显色试剂接触。将观察到显色的试验试样判定为含有植物病原性菌。

权利要求

1.一种判定试验试样是否含有植物病原性菌的方法，该方法包括以下的工序：(a)在具备通孔的基板的表侧的面配置所述试验试样的工序，其中，

所述基板在其背侧的面具备纤维素膜，所述基板的通孔具有7.065平方微米～19.625平方微米的截面积，所述纤维素膜不具有通孔，且所述纤维素膜具有0.5微米～3.7微米的厚度，(b)在工序(a)之后，将所述试验试样静置的工序，(c)在工序(b)之后，使用以对着所述纤维素膜的表侧的面的方式设置的紫外线光源，对所述纤维素膜照射紫外线的工序，(d)在所述工序(c)之后，使所述纤维素膜的背面的面与菌显色试剂接触的工序，和(e)在所述菌显色试剂显色了的情况下，判定所述试验试样含有所述植物病原性菌的工序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述植物病原性菌是植物病原性真菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述植物病原性真菌是选自由炭疽菌属(Colletotrichum)、镰孢属(Fusarium)、葡萄孢属(Botrytis)、钉孢属(Passalora)和假尾孢属(Pseudocercospora)组成的组中的至少1种真菌。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述植物病原性真菌是选自由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、燕麦细镰孢霉菌(Fusarium avenaceum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、黄钉孢菌(Passalora fulva)和煤污假尾孢菌(Pseudocercospora fuligena)组成的组中的至少1种真菌。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述植物病原性菌是植物病原性卵菌。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述工序(b)之前，进一步具备对所述试验试样供给培养基的工序。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述培养基是液体培养基。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述培养基是固体培养基。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述工序(b)中，在使所述纤维素膜的背面的面与培养基接触的同时，将所述试验试样静置。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述培养基是液体培养基。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述培养基是固体培养基。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述试验试样是固体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述固体是选自由植物体的一部分、土壤和经破碎的植物组成的组中的至少1种固体。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述试验试样是液体。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述液体是选自由农业用水、为了水耕栽培而使用的液体、为了清洗植物而使用之后的液体、从植物提取的液体、为了清洗农业材料而使用之后的液体、或为了清洗衣物或鞋靴而使用之后的液体组成的组中的至少1种液体。

16.一种在权利要求1～15的任一项所述的方法的实施中使用的装置，该装置具备所述基板和所述纤维素膜。

17.一种叠层体，

该叠层体具备：

具备通孔的基板、和

纤维素膜，

所述纤维素膜叠层在所述基板上，所述基板的通孔具有7.065平方微米～19.625平方微米的截面积，所述纤维素膜不具有通孔、且所述纤维素膜具有0.5微米～3.7微米的厚度。

说明书

试验试样是否含有植物病原性菌的判定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及判定试验试样是否含有植物病原性菌的方法。

背景技术

[0002] 专利文献1公开了丝状菌测量方法。图10显示用于专利文献1所公开的丝状菌测量方法的微多孔膜支撑体的剖面图。专利文献1所公开的丝状菌测量方法的目的在于，提供为了测量受检材料中的丝状菌数而在短时间的培养中测量丝状菌，而且能够正确测量丝状菌的丝状菌测量方法。该丝状菌测量方法通过对通过液体培养而培养的丝状菌13、或在微多孔膜支撑体4的微多孔膜1上培养的丝状菌13的多个延伸的菌丝拍照后，用图像分析单元10识别并分析形状与面积和发光亮度，从而具有能够用短时间的培养测量丝状菌13的作用。微多孔膜1夹入压圈2和基部3之间。

[0003] 非专利文献1公开了作为植物病原性卵菌的1种的大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)的假菌丝贯穿具有3微米的孔的PET膜。

[0004] 专利文献2公开了判定试验试样是否含有植物病原性卵菌的方法。

[0005] 现有技术文献

[0006] 专利文献

[0007] 专利文献1:日本特开2005-287337号公报

[0008] 专利文献2:日本特开2017-029131号公报

[0009] 非专利文献

[0010] 非专利文献1:Paul F.Morris.et.al“. Chemotropic and Contact Responses of Phytophthora sojae Hyphae to  Soybean Isoflavonoids and Artificial Substrates”,Plant Physiol.(1998)117:1171-1178

发明内容

[0011] 发明所要解决的课题

[0012] 本发明的目的是提供从植物病原性菌和植物非病原性菌2种菌中选择性地判定试验试样是否含有植物病原性菌的方法。

[0013] 用于解决课题的手段

[0014] 本发明提供判断试验试样是否含有植物病原性菌的方法。该方法具备以下工序。

[0015] (a)在具备通孔的基板的表侧的面配置所述试验试样的工序，

[0016] 其中，

[0017] 所述基板在其背侧的面具备纤维素膜，

[0018] 所述基板的通孔具有7.065平方微米～19.625平方微米的截面积，所述纤维素膜不具有通孔，且

[0019] 所述纤维素膜具有0.5微米～3.7微米的厚度，

[0020] (b)在工序(a)之后，将所述试验试样静置的工序，

[0021] (c)在工序(b)之后，使用以对着所述纤维素膜的表侧的面的方式设置的紫外线光源对所述纤维素膜照射紫外线的工序，

[0022] (d)在所述工序(c)之后，使所述纤维素膜的背面的面与菌显色试剂接触的工序，和

[0023] (e)在所述菌显色试剂显色了的情况下，判定所述试验试样含有所述植物病原性菌的工序。

[0024] 发明的效果

[0025] 本发明提供从植物病原性菌和植物非病原性菌2种菌中选择性地判定试验试样是否含有植物病原性菌的方法。

附图说明

[0026] 图1显示第1容器100的剖面图。

[0027] 图2显示在背面的面具备纤维素膜104的基板170的剖面图。

[0028] 图3显示被供给试验试样之后的第1容器100的剖面图。

[0029] 图4显示在表面配置了植物病原性菌的基板170的剖面图。

[0030] 图5A是显示植物病原性菌贯穿了通孔172和纤维素膜104的状态的剖面图。

[0031] 图5B是工序(c)中的剖面图。

[0032] 图5C是工序(c)之后的剖面图。

[0033] 图6显示使菌的培养加速的方法的一例的剖面图。

[0034] 图7是接着图6显示使菌的培养加速的方法的一例的剖面图。

[0035] 图8是显示从纤维素膜104的背面的面观察菌的状态的剖面图。

[0036] 图9是显示从纤维素膜104的背面的面观察菌的状态的剖面图。

[0037] 图10是显示用于专利文献1所公开的丝状菌测量方法的微多孔膜支撑体的剖面图。

具体实施方式

[0038] 首先，对于本说明书中使用的术语“菌”进行说明。术语“菌”包含真菌和卵菌。菌大致分为植物病原性菌和植物非病原性菌2种菌。植物病原性真菌包含例如，镰孢属(Fusarium)、炭疽菌属(Colletotrichum)、葡萄孢属(Botrytis)、钉孢属(Passalora)或假尾孢属(Pseudocercospora)。植物病原性真菌的例子是燕麦细镰孢霉菌(Fusarium avenaceum)、胶孢炭疽菌(胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)s)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、黄钉孢菌(Passalora fulva)或煤污假尾孢菌(Pseudocercospora fuligena)。这些植物病原性菌引起根腐病(Root rot disease)、瘟病(blast)、炭疽病(Anthrax)、灰霉病(Gray mold)等。这些植物病原性菌使植物枯萎。植物非病原性菌的例子是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产黄青霉(Penicillium chysogeum)、或米曲霉(Aspergillus oryzae)。

[0039] 术语“植物病原性”是指对植物具有病原性。术语“植物非病原性”是指对植物不具有病原性。即使菌具有病原性，如果对植物不具有病原性，则该菌是“植物非病原性”。换言之，只要菌对植物不造成坏影响，该菌就是“植物非病原性”。术语“植物非病原性”所含的接头词“非”不修饰“植物”。接头词“非”修饰“病原性”。

[0040] 以下，参照附图详细说明本发明的实施方式。日本专利第6167309号、美国专利第9695459号、欧洲专利第3128001号、日本专利第6167310号、美国专利第9689020号、欧洲专利第3128002号、国际专利申请PCT/JP2016/004417、和国际专利申请PCT/JP2017/008407在本说明书中作为参考被引用。

[0041] (工序(a))

[0042] 工序(a)中，在具备通孔172的基板170的表侧的面配置试验试样。基板170的背侧的面170b粘附有纤维素膜104。换言之，纤维素膜104的表侧的面104a与基板170的背侧的面170b相接。表侧的面104a是指纤维素膜104的上侧的面。

[0043] 具体地，如图1所示，准备容器100。期望容器100在上端具备凸缘102。容器100的底面由基板170形成。

[0044] 如图2所示，基板170在其背侧的面170b具备纤维素膜104。基板170具备从其表侧的面170a贯穿到背侧的面170b的通孔172。通孔172具有3微米～5微米的直径。请参照申请3和申请4。换言之，通孔172具有7.065平方微米～19.625平方微米的截面积。请参照申请3和申请4。此外，请注意与基板170不同地，纤维素膜104不具有通孔。

[0045] 如图3所示，向容器100的内部供给试验试样200。这样，在基板170的表侧的面170a上配置试验试样200。在试验试样200含有植物病原性菌202的情况下，如图4所示，在基板170的表侧的面170a上配置植物病原性菌202。

[0046] 试验试样200是固体、液体、或气体。期望试验试样200是固体或液体。固体的试验试样200的例子是土壤或经破碎的植物。其他例子是蛭石、岩棉、或尿烷这样的农业材料。液体的试验试样200的例子是农业用水、为了水耕栽培而使用的液体、为了清洗植物而使用之后的液体、从植物提取的液体、为了清洗农业材料而使用之后的液体、或为了清洗操作者的衣物或鞋靴而使用之后的液体。

[0047] (工序(b))

[0048] 工序(b)中，在工序(a)之后，将试验试样200静置规定的培养时间。期望将试验试样200静置4～150小时左右(更期望24～120小时左右)。这样来培养菌。换言之，培养时间期望为约4～150小时左右(期望24～120小时左右)。以下将纤维素膜104的厚度和通孔172的大小的重要性在以下进行说明。

[0049] 工序(b)中，试验试样200所含有的各种菌生长。如申请1～申请4中也证实的那样，在满足以下的(I)的情况下，植物病原性菌202如图5A所示，贯穿纤维素膜104那样地生长。其结果是在纤维素膜104的背面的面104b出现植物病原性菌202。

[0050] 条件(I)纤维素膜104具有0.5微米～3.7微米的厚度。

[0051] 在满足上述(I)的条件的情况下，植物非病原性菌基本不贯穿纤维素膜104。因此，植物非病原性菌在纤维素膜104的背面的面104b基本不出席。另一方面，植物病原性菌202选择性地在背面的面104b出现。这样，植物病原性菌202选择性地在容器100的外侧出现。背侧的面104b是指纤维素膜104的下侧的面。

[0052] 在纤维素膜104具有超过3.7微米的厚度的情况下，不仅植物非病原性菌，连植物病原性菌也不贯穿纤维素膜104。因此，在纤维素膜104具有超过3.7微米的厚度的情况下，选择性丧失。在纤维素膜104具有小于0.5微米的厚度的情况(包含未设置纤维素膜104的情况)下，不仅植物病原性菌，连植物非病原性菌也贯穿纤维素膜104(或在基板170的背侧的面170b被发现)。因此，在纤维素膜104具有小于0.5微米的厚度的情况下，选择性丧失。

[0053] 在通孔172具有小于7.065平方微米的截面积(即，小于3微米的直径)的情况下，不仅植物非病原性菌，连植物病原性菌也变得难以贯穿纤维素膜104。另一方面，在通孔172具有超过19.625平方微米的截面积(即，超过5微米的直径)的情况下，与通孔172具有19.625平方微米的截面积(即，5微米的直径)的情况相比，有侵入点数减少的倾向。

[0054] 纤维素膜104在基板170的背侧的面170b上绷紧。这样，基板170支撑纤维素膜104。

[0055] 如图2所示，基板170具有多个通孔172。对基板170的厚度不限定，作为一例为1微米～500微米。纤维素膜104非常薄。但是，如果在这样的基板170上配置纤维素膜104，则纤维素膜104的处理变得容易。

[0056] 为了使菌的培养加速，可以对试验试样200供给培养基。具体地，可以在含有试验试样200的容器100的内部供给培养基。期望培养基为液体。培养基可以在工序(b)中供给。代替在工序(b)中供给，培养基也可以在工序(b)之前供给。换言之，培养基可以在工序(a)中供给。培养基也可以在工序(a)之前供给到容器100的内部。

[0057] 图6显示使菌的培养加速的其他方法。如图6所示，期望使纤维素膜104的背面的面104b与液体的培养基302接触。首先，准备在内部具有液体的培养基302的第2容器300。以下，为了与第2容器300区别，容器100也称为“第1容器100”。以凸缘102的下面与第2容器300的上端接触的方式，使第1容器100重叠于第2容器300。换言之，第1容器100被第2容器300的上端支撑。这样，液体的培养基302被夹在纤维素膜104的背面的面104b和第2容器300的底面之间。

[0058] 或者，第1容器100重叠于第2容器300之后，在纤维素膜104的背面的面104b和第2容器300的底面之间供给液体的培养基302。

[0059] 还可以使用具有粘性的固体的培养基代替液体的培养基302。如图6所示，可以使用固体的培养基304和液体的培养基302的两者。这种情况下，液体的培养基302夹在固体的培养基304和纤维素膜104之间。如图5A所示，在背面的面104b出现的植物病原性菌的培养，通过液体培养基302和固体培养基304的至少一方而被加速。

[0060] (工序(c))

[0061] 工序(c)中，在工序(b)之后，如图5B所示，使用以对着纤维素膜104的表侧的面104a的方式设置的紫外线光源400，对纤维素膜104照射紫外线。

[0062] 通过紫外线的杀菌作用，如图5C所示，位于纤维素膜104的表侧的面104a上的部分植物病原性菌202被杀死。请参照图5C中所含的虚线。同样地，位于纤维素膜104的表侧的面104a上的植物非病原性菌也被杀死。另一方面，纤维素膜104屏蔽紫外线，因此位于纤维素膜104的背侧的面104b的植物病原性菌202的部分(即，贯穿纤维素膜104的植物病原性菌
202的一部分)仍然生存。基板170也屏蔽紫外线。

[0063] 紫外线的强度和照射时间可以由阅读本说明书的本领域技术人员适当选择。具有过高强度的紫外线不能被纤维素膜104和基板170充分屏蔽，从而将位于纤维素膜104的背侧的面104b的植物病原性菌202的部分也杀死。其结果是菌的选择性丧失。过长的紫外线照射时间也引起同样的问题。

[0064] (工序(d))

[0065] 工序(d)中，在工序(c)之后，使纤维素膜104的背侧的面104b与菌显色试剂接触。这样，在纤维素膜104的背面的面104b出现的植物病原性菌202的一部分(请参照图5C)使菌显色试剂显色。菌显色试剂与活菌反应而显色，另一方面与死菌不反应而不显色。菌显色试剂一般为水溶性。

[0066] 理论上，因为第二容器300与第一容器100被纤维素膜104隔着，所以菌显色试剂不蔓延到第1容器100的内部。因此，第1容器100中含有的植物病原性菌不使菌显色试剂显色。

[0067] 但是，实际上，经由在贯穿了纤维素膜104的植物病原性菌202的周围形成的小间隙，菌显色试剂能够蔓延到第1容器100的内部。另外，菌呈示试剂一般为水溶性，因而能够经由纤维素膜104的内部蔓延到纤维素膜104的表侧的面104a。

[0068] 因此，位于纤维素膜104的表侧的面104a上的植物病原性菌202的一部分也使菌显色试剂显色。进而，位于纤维素膜104的表侧的面104a上的植物非病原性菌(未图示)也使菌显色试剂显色。因此，菌的选择性丧失。

[0069] 另一方面，本实施方式中，如图5C所示，通过紫外线的照射，在纤维素膜104的表侧的面104a上，植物病原性菌202和植物非病原性菌(未图示)被杀死。但是，植物病原性菌202的一部分在纤维素膜104的背侧的面104b仍然存活，该一部分使菌显色试剂显色。当然，植物非病原性菌不贯穿纤维素膜104，因此不使菌显色试剂显色。这样，本实施方式中，贯穿纤维素膜104的植物病原性菌202的一部分选择性地使菌显色试剂显色。

[0070] 菌显色试剂的例子是具有以下化1的化学结构的化学物质。该化学物质被称为WST-8。

[0071]

[0072] 具体地，在工序(c)之后，从第2容器300中除去液体的培养基302和固体的培养基304。接下来，在第2容器300的内部添加菌显色试剂。接下来，如图7所示，将第1容器100重叠于在内部具有菌显色试剂的第2容器300。或者，在将第1容器100重叠于第2容器300之后，在纤维素膜104的背面的面104b和第2容器300的底面之间供给含有菌显色试剂的溶液402。另外，由于液体从纤维素膜104渗出，因而也可以将含有菌显色试剂的溶液402供给到第1容器
100内。

[0073] (工序(e))

[0074] 工序(e)中，在工序(d)中菌显色试剂显色了的情况下，判定试验试样含有植物病原性菌。

[0075] 本发明中，也包含在上述选择性地判定是否含有植物病原性菌的方法的实施中使用的装置。

[0076] 本发明的装置至少具备基板和纤维素膜。基板具备通孔，该通孔具有7.065平方微米～19.625平方微米的截面积，换言之具有3微米～5微米的直径的。基板也可以是底面由该基板构成、且具备凸缘的容器。在基板的一面具备纤维素膜，该纤维素膜具有0.5微米～3.7微米的厚度，不具有通孔。

[0077] 本发明的装置还可以包含用于使菌的培养加速的培养基、菌显色试剂等。另外，本发明的装置还可以具备用于对纤维素膜照射紫外线的紫外线光源、用于光学检测菌显色试剂的显色的光学传感器、用于显示检测的结果的显示元件等。

[0078] 只要不妨碍本发明的效果，在纤维素膜和基板之间也可以夹有其他层。但是，期望纤维素膜与基板相接。换言之，只要不妨碍本发明的效果，纤维素膜不必须与基板相接，此时可以以在纤维素膜和基板之间夹有其他层的方式布置纤维素膜在基板上的位置。但是，虽然是重复的表述，但期望以纤维素膜与基板相接的方式布置纤维素膜在基板上的位置。

[0079] (实施例)

[0080] 参照以下的实施例更详细地说明本发明。

[0081] (培养基的准备)

[0082] 首先，本发明者们在纯水(1升)中溶解0.56mM的硫酸铁(III)、1.53mM的硝酸锌、和1.1mM的硫酸锰(II)，制备水溶液。接着，本发明者们对该水溶液(2毫升)混合并溶解纯水(1升)、乳糖(37.5克、从SIGMA-ALDRICH社获得)、酪蛋白水合物(3.0克、从Difco社获得)、磷酸二氢钾(1.0克、从和光纯药工业株式会社获得)、硫酸镁(0.5克、从和光纯药工业株式会社获得)，制备混合物。本发明者们使用高压釜将混合物灭菌。所得的混合物的pH为6.0。本发明者们将该混合物用纯水稀释10倍，得到培养基。以下，将这样得到的培养基称为“10％LCH培养基”。

[0083] (WST反应液的制备)

[0084] 本发明者们将杜醌(Duroquinone，从东京化成工业株式会社获得、CAS号:527-17-3)溶解在乙醇(从和光纯药工业株式会社获得)中，得到杜醌乙醇溶液(50mM)。与此分别地，本发明者们将2-环己氨基乙磺酸(从东京化成工业株式会社获得、CAS:103-47-9、以下称为“Chem”)溶解在纯水中，得到Chem溶液(100mM)。本发明者们通过滴加NaOH水溶液(1M、从和光纯药工业株式会社获得)将Chem溶液的pH调整为9.5。

[0085] 本发明者们将以下的表1所示的试剂混合，得到WST反应液。

[0086] 表1

[0087]试剂名 体积比
10％LCH培养基 170
WST-8溶液 9
杜醌乙醇溶液(50mM) 1
Chem溶液(100mM) 20

[0088] WST-8溶液包含在从株式会社同仁化学研究所作为商品名：WST-8Microbial Viability Assay Kit-WST获得的商品中。WST-8具有作为“化1”在上面叙述的化学结构。

[0089] (实验例1)

[0090] (胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)的培养)

[0091] 将作为植物病原菌的一种的胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基。接下来，将培养基在25摄氏度的温度下静置1周。胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)由岐阜大学应用生物科学部的清水准教授赠予。

[0092] 接下来，将包含菌丝的前端的部分与培养基一起以1厘米×1厘米的大小切下。将切下的部分浸泡在配置于12孔板上的10％LCH培养基中。各纯水的体积为1毫升。

[0093] 将配置于12孔板上的水用光学显微镜进行观察。其结果在配置于12孔板上的水中确认了胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)的孢子释放。这样，得到了含有胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)的水溶液。以下，将该水溶液称为“植物病原性菌水溶液”。

[0094] (实验例1)

[0095] 实验例1包含实施例1A～实施例1D。

[0096] (实施例1A)

[0097] 如下准备图1所示的第1容器100。

[0098] 首先，将纤维素(从SIGMA-ALDRICH社获得、商品名：AvicEl pH-101)溶解语离子液体，制备具有1％的浓度的纤维素溶液。离子液体是氯化1-丁基-3-甲基咪唑(从SIGMA-ALDRICH社获得)。

[0099] 将纤维素溶液加热到60摄氏度。接着，将纤维素溶液在底面具有聚对苯二甲酸乙二酯膜的容器(从ミリポア社获得、商品名：Millicell PISP 12R48)的背面的面通过旋涂法以30秒、2000rpm的旋转速度进行涂布。聚对苯二甲酸乙二酯膜作为基板170发挥功能。聚对苯二甲酸乙二酯膜随机地具有多个直径为3微米的通孔172。这样，在聚对苯二甲酸乙二酯膜的背侧的面形成具有0.5微米的厚度的纤维素膜104。根据ミリポア社，通孔172的直径可以有正负10％左右的误差范围。

[0100] 将容器在乙醇中在室温静置12小时。这样，将氯化1-丁基-3-甲基咪唑替换成乙醇。换言之，将氯化1-丁基-3-甲基咪唑从纤维素膜104除去。

[0101] 最后，将容器在真空干燥器内干燥。这样，得到图1所示的第1容器100。请留意图1中作为基板170发挥功能的聚对苯二甲酸乙二酯膜未图示。

[0102] 接着，如图6所示所示，将第1容器100重叠于第2容器300。作为第2容器300，使用24孔板(从コーニング社获得)。纤维素膜104的背面的面104b与液体的培养基302相接。作为液体的培养基302，使用10％LCH培养基。将包含1000个胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)的孢子的植物病原菌水溶液添加到第1容器100的内部。

[0103] 将第1容器100在25摄氏度的温度静置24小时。换言之，在实施例1A中，培养时间为24小时。

[0104] (菌的检测)

[0105] 接下来，本发明者们将第1容器100从第2容器300分离。进而本发明者们将第1容器100的内部所含的溶液使用移液器除去。然后，本发明者们将第1容器100的周围使用黑色24孔板(从zell-kontakt社获得、商品名：Imaging Plate FC)包围，对第1容器100进行遮光。

[0106] 如图5B和图5C所示，使用紫外线光源400(パナソニック株式会社制、商品名：UV-EC910ZA)对纤维素膜104照射紫外线。紫外线光源400和纤维素膜104的之间的间隔为1.5cm。在紫外线光源400中流通0.1安培的电流10分钟。

[0107] 接下来，本发明者们使纤维素膜104的背侧的面104b接触WST反应液(100微升)。接着，在25摄氏度将第1容器100遮光1小时，使得光不照射纤维素膜104。

[0108] 本发明者们将与纤维素膜104的背侧的面104b接触的WST反应液(50微升)移入96孔平底透明板(从Greiner社获得)。接下来，本发明者们使用酶标仪(从TECAN社获得、商品名：M1000Pro)测定460纳米的波长下的WST反应液的吸光度。

[0109] 与此分别地，作为参照，将WST反应液在25摄氏度静置1小时，接下来同样测定其吸光度。当然，作为参照使用的WST反应液不与纤维素膜104的背侧的面104b接触。实施例1A重复2次。

[0110] 本发明者们按照以下的算式(I)计算出显色度。

[0111] 显色度＝(与纤维素膜104的背侧的面104b接触的WST反应液的吸光度)-(作为参照的WST反应液的吸光度)(I)

[0112] 结果在以下的表2中显示。

[0113] 表2

[0114]  WST反应液的吸光度
与背侧的面104b接触的WST反应液(第一次) 0.428
参照用WST反应液(第一次) 0.046
与背侧的面104b接触的WST反应液(第二次) 0.308
参照用WST反应液(第二次) 0.044

[0115] 根据上述表2，实施例1中的胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)的显色度的平均值为0.32(＝((0.428-0.046)+(0.308-0.044))/2)。

[0116] (实施例1B)

[0117] 实施例1B中，除了纤维素溶液具有3％的浓度，和纤维素膜104具有3.7微米的厚度之外，进行与实施例1A同样的实验。结果在以下的表3中显示。

[0118] 表3

[0119]  WST反应液的吸光度
与背侧的面104b接触的WST反应液(第一次) 0.361
参照用WST反应液(第一次) 0.054
与背侧的面104b接触的WST反应液(第二次) 0.257
参照用WST反应液(第二次) 0.043

[0120] (实施例1C)

[0121] 实施例1C中，除了在纤维素膜104的背侧的面104b的整面黏贴防水胶带(日东电工株式会社获得、商品名：57130SB)以外，进行与实施例1A同样的实验。防水胶带抑制了菌向纤维素膜104的背侧的面104b的外侧延伸。结果在以下的表4中显示。

[0122] 表4

[0123]  WST反应液的吸光度
与背侧的面104b接触的WST反应液(第一次) 0.078
参照用WST反应液(第一次) 0.046
与背侧的面104b接触的WST反应液(第二次) 0.064
参照用WST反应液(第二次) 0.044

[0124] (实施例1D)

[0125] 实施例1D中，除了纤维素溶液具有3％的浓度，纤维素膜104具有3.7微米的厚度，和在纤维素膜104的背侧的面104b的整面黏贴防水胶带之外，进行与实施例1A同样的实验。结果在以下的表5中显示。

[0126] 表5

[0127]   WST反应液的吸光度
与背侧的面104b接触的WST反应液(第一次) 0.071
参照用WST反应液(第一次) 0.054
与背侧的面104b接触的WST反应液(第二次) 0.062
参照用WST反应液(第二次) 0.043

[0128] (实验例2)

[0129] 实验例2包含实施例2A～实施例2D。实验例2中，除了使用燕麦细镰孢霉菌(Fusarium avenaceum)代替胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)以外，进行与实验例1同样的实验。

[0130] 实施例2A的结果在以下的表6中显示。

[0131] 表6

[0132]  WST反应液的吸光度
与背侧的面104b接触的WST反应液(第一次) 0.273
参照用WST反应液(第一次) 0.046
与背侧的面104b接触的WST反应液(第二次) 0.273
参照用WST反应液(第二次) 0.056

[0133] 实施例2B的结果在以下的表7中显示。

[0134] 表7

[0135]  WST反应液的吸光度
与背侧的面104b接触的WST反应液(第一次) 0.213
参照用WST反应液(第一次) 0.054
与背侧的面104b接触的WST反应液(第二次) 0.204
参照用WST反应液(第二次) 0.063

[0136] 实施例2C的结果在以下的表8中显示。

[0137] 表8

[0138]  WST反应液的吸光度
与背侧的面104b接触的WST反应液(第一次) 0.060
参照用WST反应液(第一次) 0.061
与背侧的面104b接触的WST反应液(第二次) 0.077
参照用WST反应液(第二次) 0.056

[0139] 实施例2D的结果在以下的表9中显示。

[0140] 表9

[0141]  WST反应液的吸光度
与背侧的面104b接触的WST反应液(第一次) 0.057
参照用WST反应液(第一次) 0.062
与背侧的面104b接触的WST反应液(第二次) 0.071
参照用WST反应液(第二次) 0.063

[0142] 以下的表10显示实施例1A～实施例1D和实施例2A～实施例2D的结果。

[0143] 表10

[0144]

[0145] 由上述表10表明，检测到贯穿了纤维素膜104的植物病原性菌。

[0146] (实验例3)

[0147] 对于作为植物病原菌的一种的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)(番茄灰色霉病菌)，与上述实验例1同样地，获得包含灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的孢子的植物病原菌水溶液。

[0148] 实验例3包含实施例3和比较例3A～3C。

[0149] (实施例3)

[0150] 与上述实施例1同样地准备图1所示的第1容器100。

[0151] 接着，如图6所示，将第1容器100重叠于第2容器300。作为第2容器300和液体的培养基302，使用与上述实施例1同样的。将包含1000个灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的孢子的植物病原菌水溶液添加到第1容器100的内部。

[0152] 将第1容器100在25摄氏度的温度静置40小时。

[0153] 接下来，与上述实施例1同样地，将第1容器100从第2容器300分离，将第1容器100的内部所含的溶液除去后，对第1容器100进行遮光。

[0154] 如图5B和图5C所示，与上述实施例1同样地，使用紫外线光源400对纤维素膜104照射紫外线。

[0155] 接下来，使纤维素膜104的背侧的面104b接触WST反应液(100微升)。接着，在25摄氏度将第1容器100遮光3小时，使得光不照射纤维素膜104。

[0156] 接下来，与上述实施例1同样地，测定与纤维素膜104的背侧的面104b接触的WST反应液(50微升)的吸光度。

[0157] (比较例3A)

[0158] 比较例3A中，除了在准备实施例3中的第1容器100时，使用具有5％的浓度的纤维素溶液代替具有1％的浓度的纤维素溶液，和作为具有底面具有多个通孔的聚对苯二甲酸乙二酯膜的容器，使用通孔的直径为1微米的(ミリポア社商品名：Millicell PIRP 12R 48)代替通孔的直径为3微米的(ミリポア社商品名：Millicell PISP 12R 48)之外，进行与上述实施例3同样的实验。

[0159] (比较例3B)

[0160] 比较例3B中，除了不对纤维素膜104照射紫外线以外，进行与上述实施例3同样的实验。

[0161] (比较例3C)

[0162] 比较例3C中，除了不对纤维素膜104照射紫外线以外，进行与上述比较例3A同样的实验。

[0163] (实验例4)

[0164] 对于作为植物病原菌的一种的黄钉孢菌(Passalora fulva)(番茄叶霉病菌)，与上述实验例1同样地，获得包含黄钉孢菌(Passalora fulva)的孢子的植物病原菌水溶液。

[0165] 实验例4包含实施例4和比较例4A～4B。

[0166] (实施例4)

[0167] 与上述实施例1同样地准备图1所示的第1容器100。

[0168] 接着，如图6所示，将第1容器100重叠于第2容器300。作为第2容器300和液体的培养基302，使用与上述实施例1同样的。将包含1000个黄钉孢菌(Passalora fulva)的孢子的植物病原菌水溶液添加到第1容器100的内部。

[0169] 将第1容器100在25摄氏度的温度静置120小时。

[0170] 接下来，与上述实施例1同样地，将第1容器100从第2容器300分离，将第1容器100的内部所含的溶液除去后，将第1容器100进行遮光。

[0171] 如图5B和图5C所示，与上述实施例1同样地，使用紫外线光源400对纤维素膜104照射紫外线。

[0172] 接下来，使纤维素膜104的背侧的面104b接触WST反应液(100微升)。接着，在25摄氏度将第1容器100遮光3小时，使得光不照射纤维素膜104。

[0173] 接下来，与上述实施例1同样地，测定与纤维素膜104的背侧的面104b接触的WST反应液(50微升)的吸光度。

[0174] (比较例4A)

[0175] 比较例4A中，除了在准备实施例4中的第1容器100时，使用具有5％的浓度的纤维素溶液代替具有1％的浓度的纤维素溶液，和作为具有底面具有多个通孔的聚对苯二甲酸乙二酯膜的容器，使用通孔的直径为1微米的(ミリポア社商品名：Millicell PIRP 12R 48)代替通孔的直径为3微米的(ミリポア社商品名：Millicell PISP 12R 48)之外，进行与上述实施例4同样的实验。

[0176] (比较例4B)

[0177] 比较例4B中，除了不对纤维素膜104照射紫外线以外，进行与上述实施例4同样的实验。

[0178] (实验例5)

[0179] 对于作为植物病原菌的一种的煤污假尾孢菌(Pseudocercospora fuligena)(番茄黑霉病菌)，与上述实验例1同样地，获得包含煤污假尾孢菌(Pseudocercospora fuligena)的孢子的植物病原菌水溶液。

[0180] 实验例5包含实施例5和比较例5A～5B。

[0181] (实施例5)

[0182] 与上述实施例1同样地准备图1所示的第1容器100。

[0183] 接着，如图6所示，将第1容器100重叠于第2容器300。作为第2容器300和液体的培养基302，使用与上述实施例1同样的。将包含1000个煤污假尾孢菌(Pseudocercospora fuligena)的孢子的植物病原菌水溶液添加到第1容器100的内部。

[0184] 将第1容器100在25摄氏度的温度静置75小时。

[0185] 接下来，与上述实施例1同样地，将第1容器100从第2容器300分离，将第1容器100的内部所含的溶液除去后，将第1容器100进行遮光。

[0186] 如图5B和图5C所示，与上述实施例1同样地，使用紫外线光源400对纤维素膜104照射紫外线。

[0187] 接下来，使纤维素膜104的背侧的面104b与WST反应液(100微升)接触。接着，在25摄氏度将第1容器100遮光1小时，使得光不照射纤维素膜104。

[0188] 接下来，与上述实施例1同样地，测定与纤维素膜104的背侧的面104b接触的WST反应液(50微升)的吸光度。

[0189] (比较例5A)

[0190] 比较例5A中，除了在准备实施例5中的第1容器100时，使用具有5％的浓度的纤维素溶液代替具有1％的浓度的纤维素溶液，和作为具有底面具有多个通孔的聚对苯二甲酸乙二酯膜的容器，使用通孔的直径为1微米的(ミリポア社商品名：Millicell PIRP 12R 48)代替通孔的直径为3微米的(ミリポア社商品名：Millicell PISP 12R 48)之外，进行与上述实施例5同样的实验。

[0191] (比较例5B)

[0192] 比较例5B中，除了不对纤维素膜104照射紫外线以外，进行与上述实施例5同样的实验。

[0193] 以下的表11显示实验例3～5的结果。此外，表11的贯穿菌丝数，表示将贯穿了纤维素膜104的菌丝的数通过光学显微镜观察而计数的结果。

[0194] 表11

[0195]

[0196] 实施例3～5中的显色度是通过紫外线照射而基板170上的菌被杀死，仅由贯穿了纤维素膜104的菌丝造成的显色。

[0197] 另外，比较例3A、4A、5A在菌难以贯穿的条件实施，因而没有菌的贯穿，或者有菌的贯穿也是极少数。因此，通过紫外线照射而基板170上的菌被杀死，与实施例3～5相比显示非常低的显色度。由该比较例3A、4A、5A与实施例3～5的各个比较可以理解，通过本发明的方法能够通过显色度来判定有无贯穿菌丝。

[0198] 另外，比较例3B、3C、4B、5B中，没照射紫外线，因此基板170上的菌没有被杀死。因此，无论有无贯穿菌丝，均显示高于实施例3～5的各个的显色度，不能判定有无贯穿菌丝。

[0199] 以上，通过实验例3～5的结果，根据本发明的方法，通过贯穿了纤维素膜的植物病原性菌使菌显色试剂显色，能够判断试验试样是否含有植物病原性菌。

[0200] 产业可利用性

[0201] 本发明能够用于简单地判断农业用水、植物体破碎物、或土壤这样的试验试样是否含有植物病原性菌。

[0202] 符号说明

[0203] 100 第1容器

[0204] 102 凸缘

[0205] 104 纤维素膜

[0206] 104a 表侧的面

[0207] 104b 背侧的面

[0208] 170 基板

[0209] 170a 表侧的面

[0210] 170b 背侧的面

[0211] 200 试验试样

[0212] 202 植物病原性菌

[0213] 202a 植物病原性菌的一部分

[0214] 300 第2容器

[0215] 302 液体的培养基

[0216] 304 固体的培养基

[0217] 402 含有菌显色试剂的溶液

[0218] 500 光源

[0219] 600 显微镜