己糖激酶1在延缓衰老中的应用

摘要

本发明提供了己糖激酶1在延缓衰老中的应用，涉及延缓衰老技术领域。本发明以HK1调控MSCs的糖酵解水平和衰老命运为核心，首次将HK1与MSCs有机结合，旨在研究HK1对MSCs的人为改造后，能够上调MSCs的糖酵解水平，又能通过HK1催化的糖酵解水平来延缓MSCs衰老，为解决干细胞衰老所致的种子细胞不足问题提供实验依据，也为延缓干细胞衰老、激活衰老的干细胞“重返青春”开辟了新思路。

权利要求

1.己糖激酶1在制备延缓骨髓间充质干细胞衰老的药品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述己糖激酶1通过提高细胞糖酵解水平来延缓骨髓间充质干细胞衰老。

说明书

己糖激酶1在延缓衰老中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及延缓衰老技术领域，尤其涉及己糖激酶1在延缓衰老中的应 用。

背景技术

[0002] 随着经济发展和医疗卫生条件的改善，人类平均寿命逐渐延长，同时也 带来了一系列的社会问题，如人口老龄化。而导致人口老龄化日益严重的重 要原因之一是衰老。衰老(Aging)是生物体发展的必然趋势，是一种自然 的、不可避免的且复杂多变的生理过程，其特点是渐进性的组织器官结构破 坏、功能丧失、协调性和生理完整性损伤，稳态维持及再生能力进行性下降， 进而导致功能损伤和死亡风险增加。更为严重的是，随着个体衰老的发生， 各种衰老相关性疾病的发生率也日益增高，如糖尿病、心脑血管疾病及恶性 肿瘤等。因此，衰老问题已成为生命科学领域和社会领域的重大问题，而衰 老和抗衰老研究也已成为老年医学领域中的研究热点。延缓衰老，预防和治 疗衰老相关性疾病，提升老龄化人口的生命质量，势在必行！

[0003] 众所周知，继人类基因组大规模测序之后，干细胞研究已成为最有活力、 影响力和应用前景的前沿科学。作为“种子细胞”，干细胞也会发生衰老。成 体干细胞作为干细胞领域的一大分支，对维持组织稳态与再生至关重要，在 促进组织和器官更新、损伤修复、延缓机体衰老以及治疗衰老相关性疾病等 方面具有重要意义。与大多数分化成熟细胞不同，干细胞主要通过糖酵解产 生生命活动所需的ATP。通过分析线粒体的呼吸功能、代谢组学及蛋白组学 发现，成体干细胞如间充质干细胞主要通过糖酵解产生生命活动所需要的 ATP。糖酵解能够通过维持细胞的氧化还原能力促进干细胞“干性”的维持， 又使其免受线粒体氧化应激的损伤，从而延缓细胞衰老的发生。

[0004] 骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是研究较早且较为 深入的一种成体干细胞，由于其低免疫原性、活力强、生物特性均一和无伦 理学争议等优势，已成为干细胞领域和再生医学领域种子细胞的主要来源， 具有广泛的研究基础和临床应用前景。然而，骨髓中MSCs的比例仅占 0.001％～0.01％，为满足其移植需求，需通过体外扩增获得足够数量的MSCs。 但是，随着体外培养次数增加，MSCs的糖酵解水平下调，其增殖活性和存 活能力减弱，多向分化潜能也随之降低，这均是制约患者自体干细胞移植疗 效的主要因素之一，同时也限制了MSCs的临床应用。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供己糖激酶1在延缓衰老中的应用。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了己糖激酶1在制备延缓衰老的药品、保健品或食品添加剂 中的应用。

[0008] 优选的，所述药物、保健品或食品添加剂中还包括载体；所述载体包括 稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活 性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或几种。

[0009] 优选的，所述药物的剂型包括注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口 服液、膏剂和霜剂。

[0010] 本发明提供了己糖激酶1在延缓间充质干细胞衰老中的应用。

[0011] 优选的，所述己糖激酶1通过提高细胞糖酵解水平来延缓间充质干细胞 衰老。

[0012] 本发明的有益效果：本发明提供了己糖激酶1在制备延缓衰老的药品、 保健品或食品添加剂中的应用。MSCs是研究较早且较为深入的一种成体干 细胞，目前已成为干细胞治疗领域和再生医学领域中种子细胞的主要来源， 具有广泛的基础研究和临床应用前景。由于正常骨髓来源较少，获取特定年 龄阶段的骨髓MSCs更为困难，而随着体外培养次数增加，MSCs的增殖活 性和存活能力减弱，多向分化潜能也随之降低，这是制约患者自体干细胞移 植疗效的主要因素，也导致了其临床应用的局限性。本发明以HK1调控 MSCs的糖酵解水平和衰老命运为核心，首次将HK1与MSCs有机结合，旨 在研究HK1对MSCs的人为改造后，能够上调MSCs的糖酵解水平，又能 通过HK1催化的糖酵解水平来延缓MSCs衰老，为解决干细胞衰老所致的 种子细胞不足问题提供实验依据，也为延缓干细胞衰老、激活衰老的干细胞 “重返青春”开辟了新思路。本发明实施例3的实验表明，改良的衰老MSCs 除了重塑细胞的糖酵解水平外，还能够改善衰老MSCs的形态学特点，降低 改良衰老MSCs的SA-β-gal染色阳性率，并且改良的衰老MSCs中衰老相关 因子(P16INK4a和Rb1)表达显著降低，增殖能力明显上调，有效地延缓了 MSCs衰老。本发明以人为地过表达HK1重塑衰老MSCs的糖酵解水平，并 进一步延缓间充质干细胞衰老，为体外大量扩增“年轻态”MSCs提供理论 依据和实验方案，并为预防和治疗衰老相关性疾病提供了新思路与新靶点。
附图说明：

[0013] 图1a为实施例1中倒置相差显微镜下显示的P2与P10MSCs细胞形态；

[0014] 图1b为实施例1中P2与P10MSCs细胞的形态学统计分析结果；

[0015] 图1c为实施例1中SA-β-gal染色和定量分析结果；

[0016] 图1d为实施例1中实时荧光定量PCR检测年轻与衰老MSCs中衰老相 关因子P16INK4a和Rb1mRNA表达水平的结果；

[0017] 图2a为实施例2中年轻与衰老MSCs的细胞相对葡萄糖消耗量；

[0018] 图2b为实施例2中年轻与衰老MSCs的细胞外液的乳酸水平；

[0019] 图2c为实施例2中年轻与衰老MSCs的细胞相对ATP含量；

[0020] 图2d为实施例2中年轻与衰老MSCs的细胞外泌酸率；

[0021] 图2e为实施例2中实时荧光定量PCR检测年轻与衰老MSCs中HK1 表达水平的结果；

[0022] 图3a为实施例3中衰老MSCs受到不同浓度慢病毒感染的情况；

[0023] 图3b为实施例3中衰老MSCs感染慢病毒72h后，荧光定量PCR检测 MSCs中HK1的表达增高倍数；

[0024] 图4a为实施例4中改良的衰老MSCs的细胞葡萄糖消耗量检测结果；

[0025] 图4b为实施例4中改良的衰老MSCs的细胞ATP含量检测结果；

[0026] 图4c为实施例4中改良的衰老MSCs的细胞乳酸水平检测结果；

[0027] 图4d为实施例4中改良的衰老MSCs的细胞ECAR水平检测结果；

[0028] 图4e为实施例4中改良的衰老MSCs的细胞形态学特点倒置相差显微 镜观察结果；

[0029] 图4f为实施例4中改良的衰老MSCs的细胞形态统计学分析结果；

[0030] 图4g为实施例4中改良的衰老MSCs的细胞SA-β-gal染色及定量分析 结果；

[0031] 图4h为实施例4中RT-qPCR检测改良的衰老MSCs中衰老相关因子的 表达情况。

具体实施方式

[0032] 本发明提供了己糖激酶1在制备延缓衰老的药品、保健品或食品添加剂 中的应用。

[0033] 本发明中，所述药物、保健品或食品添加剂中优选的还包括载体；所述 载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、 表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或几种。

[0034] 优选的，所述药物的剂型优选的包括注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶 囊、口服液、膏剂和霜剂。

[0035] 本发明提供了己糖激酶1在延缓间充质干细胞衰老中的应用；优选的， 所述己糖激酶1通过提高细胞糖酵解水平来延缓间充质干细胞衰老。

[0036] 本发明中，所述己糖激酶1通过提高细胞糖酵解水平来延缓间充质干细 胞衰老的途径优选的还包括：1)通过间充质干细胞(MSCs)高表达HK1 实现；2)通过人为高表达HK1的MSCs中提取化学分子、细胞因子和外泌 体等作用提高MSCs的糖酵解水平并延缓间充质干细胞衰老。本发明中，所 述间充质干细胞(MSCs)高表达HK1的方法优选的包括：a)通过病毒搭 载HK1基因使MSCs高表达HK1；所述病毒优选的包括腺病毒或逆转录病 毒；本发明对所述病毒搭载HK1基因和MSCs高表达HK1的方法没有特殊 限制，采用本领域常规方法即可；b)通过其他细胞因子、化学分子等间接 作用提高MSCs的HK1表达水平。

[0037] MSCs高表达HK1后对重塑细胞糖酵解水平具有重要意义。在MSCs 中通过人为提高细胞内HK1表达水平来上调细胞葡萄糖消耗量、乳酸水平、 ATP含量及ECAR水平等能够反映糖酵解水平指标的技术与方法均为借鉴 本发明。

[0038] HK1在改造MSCs细胞学特性及延缓干细胞衰老中发挥重要作用。在本 发明中所涉及的HK1包括通过其他细胞因子、化学分子等间接作用提高 MSCs的HK1表达、携带HK1基因的其它载体如质粒、慢病毒、腺病毒或 腺相关病毒等其它微生物。凡是在MSCs中以人为提高细胞内HK1水平改 造MSCs细胞学特性并延缓干细胞衰老的技术与方法均为借鉴本发明。

[0039] MSCs中人为高表达HK1后细胞分泌的细胞因子、生长因子以及外泌体 中活性成分发生量和质的改变。高表达HK1的MSCs分泌这些细胞因子、 生长因子和外泌体，改善细胞的糖酵解水平，促进细胞增殖与分化，进而延 缓干细胞衰老。因此凡是从高表达HK1的MSCs中分离纯化这些活性成分 如细胞因子、生长因子和外泌体等并制备成治疗剂应用于改善MSCs的糖酵 解水平及延缓MSCs衰老的技术与方法均为借鉴本发明。

[0040] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把 它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0041] 实施例1建立大鼠MSCs体外复制衰老模型

[0042] 1.1原代细胞的分离获取

[0043] 将大鼠置于实验室环境下5～8h，以适应实验室环境，使大鼠处于相对稳 定的状态。将大鼠麻醉脱颈处死，应用碘伏消毒全身、75％医用酒精脱碘消 毒后，于无菌环境下快速分离获取大鼠双侧股骨、胫骨以及肱骨，并浸泡于 含1％青霉素-链霉素的PBS中。在另一干净超净台中剔除骨表面的肌肉和筋 膜等软组织，经PBS浸泡冲洗后，置于MSCs完全培养液中。医用咬骨钳去 掉骨两端后，用5ml注射器吸取完全培养液反复、交替冲洗骨髓腔两端，直 至骨髓腔透明为止。用5ml移液器轻轻地重悬骨髓冲洗液，经40μm细胞过 滤网过滤于50ml的离心管中，室温，1500rpm，离心5min。弃上清，3ml 完全培养液重悬细胞团，轻柔、均匀吹打后接种于10cm细胞培养皿中，置 于37℃，5％CO2细胞恒温培养箱中培养。24h后半量换液，以后每2～3d换 液一次，直至细胞生长至融合。

[0044] 1.2建立MSCs体外复制衰老模型

[0045] 应用体外连续传代培养法获得P1～P10代MSCs，对获得的细胞进行衰 老评估，建立大鼠MSCs复制性衰老模型。以P2代MSCs为年轻细胞，P10 代MSCs为复制衰老细胞，并于倒置相差显微镜下观察其形态。

[0046] 1.3MSCs形态学观察与统计分析

[0047] 将体外传代培养获得的P2和P10代MSCs分别置于倒置相差显微镜下， 观察其生长情况及形态学特征，并随机采集图像。随机选取20～25个图像， 应用Cell Entry软件测量并计算视野内单个细胞的表面积和长宽比，并进行 统计学分析。

[0048] 1.4衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性检测

[0049] 按照5×103个细胞/孔的密度分别将P2、P10MSCs接种于24孔板中， 于37℃，5％CO2恒温培养箱培养。当细胞汇流达80％左右时，取出24孔板。 PBS洗涤3次，3-5min/次，每孔加入250μl固定液，室温，固定15min；弃 固定液，PBS漂洗3次，5min/次。每孔加入500μl染色工作液(A液：B液： C液：X-gal溶液＝1:1:93:5)，用封口膜封住孔板边缘以防挥发，在无CO2的37℃孵箱中孵育12h左右。显微镜下蓝染细胞即为SA-β-gal阳性细胞， 随机选取若干视野采集图像，并计算阳性细胞数占总细胞数的百分比。

[0050] 1.5荧光定量PCR(RT-qPCR)检测衰老相关因子的mRNA表达水平

[0051] (1)细胞RNA提取

[0052] 细胞生长汇流至80％～90％时，弃培养液，PBS清洗2～3次；细胞培养 皿中加入1ml Trizol，室温裂解15～20min，期间反复吹打，尽可能让细胞完 全裂解。移入1.5ml的EP管中，4℃，12000rpm，离心5min，弃沉淀，将 上清移入一新EP管。加200μl氯仿/ml Trizol，上下颠倒混匀15s，禁涡旋， 以免基因组断裂，室温静置15min。12000rpm，4℃，离心15min，吸取上层 水相至另一离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，上下振荡混匀，室温静 置15～20min。12000rpm，4℃，离心15min，弃上清，管底沉淀即为RNA， 加入预冷的75％乙醇洗涤，轻弹管底，悬浮沉淀。8000rpm，4℃，离心5min， 弃上清，室温干燥5～10min，使其变为无色、透明胶状；加入10～20μl DEPC 水溶解，充分混匀，检测RNA浓度。

[0053] (2)RNA逆转录为cDNA(TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR,TransGen Biotech)

[0054] 根据试剂盒的说明要求，配制逆转录反应体系，具体配制方法如表1所 示：

[0055] 表1逆转录反应体系

[0056]

[0057]

[0058] 逆转录反应程序如表2：

[0059] 表2逆转录反应程序

[0060]

[0061] 反应结束后，可直接进行qPCR操作或保存于-20℃待用。

[0062] 引物设计与合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成，具体序 列如表3：

[0063] 表3qPCR引物组

[0064]

[0065]

[0066] (3)RT-qPCR检测(TransStart Top Green qPCR SuperMix,TransGen Biotech)[0067] 根据试剂盒的说明要求，配制逆转录反应体系，具体配制方法如表4：

[0068] 表4逆转录反应体系

[0069]

[0070] 逆转录反应程序如表5：

[0071] 表5逆转录反应程序

[0072]

[0073]

[0074] 获取CT值并进行统计学分析。

[0075] 倒置相差显微镜下显示的细胞形态如图1a所示，P2MSCs生长状态好， 胞体呈明显的长梭形，与邻近细胞之间边界清晰，呈鱼群样排列；而P10MSCs 生长状态较差，胞体呈不规则形，细胞多铺展，立体感消失，边界模糊，胞 浆颗粒感明显。

[0076] 如图1b所示，对细胞的形态学进行统计分析发现，与P2MSCs相比， P10MSCs的表面积明显增加而长宽比显著降低。

[0077] SA-β-gal染色结果如图1c所示，P10MSCs中蓝染细胞数目明显多于 P2MSCs。经统计学分析发现，与P2MSCs相比，P10MSCs中SA-β-gal阳性 率明显增加，说明P10MSCs中衰老细胞显著增多。因此，我们后续的实验 将以P2MSCs作为年轻细胞，P10MSCs作为复制衰老细胞。

[0078] 图1d为实时荧光定量PCR检测年轻与衰老MSCs中衰老相关因子P16INK4a和Rb1mRNA表达水平的结果，其中年轻MSCs中P16INK4a和Rb1的相对表达量 为1，衰老MSCs中P16INK4a和INK4aRb1的表达量分别为8.2和2.4，说明衰老MSCs中 衰老相关因子P16 和Rb1mRNA的表达水平明显上调。

[0079] 实施例2衰老MSCs的糖代谢水平及HK1表达的检测

[0080] 2.1葡萄糖消耗量的检测

[0081] 以3.5×103个细胞/孔的密度将细胞接种于96孔板，37℃，5％CO2细胞恒温培 养箱培养。待细胞贴壁生长后，弃上清，加DMEM/F-12培养原液50μl/孔，24h后 收集细胞培养液。收集的培养液，室温，1200prm，离心3min，弃沉淀，收集上 清于新EP管中待测。具体操作流程见表6：

[0082] 表6葡萄糖消耗量检测操作流程

[0083]

[0084]

[0085] 混匀，37℃水浴5min，酶标仪测定各孔吸光度值(505nm)。

[0086] 2.2乳酸水平的检测

[0087] 收集细胞培养液上清，方法同葡萄糖消耗量检测。具体操作流程见表7：

[0088] 表7乳酸水平检测操作流程

[0089]

[0090] 混匀，ddH2O调零，测定各管吸光度值(530nm，1cm光径)。

[0091] 2.3ATP含量的检测

[0092] 300～500μl热ddH2O重悬收集的细胞团，热水浴(90～100℃)匀浆破碎后，沸 水中加热10min，取出后立即漩涡混匀1min，待测。操作流程见表8：

[0093] 表8ATP含量检测流程

[0094]

[0095] 混匀，于室温下静置5min，波长636nm，酶标仪测定吸光度值。

[0096] 2.4ECAR水平的检测

[0097] 以8×104个细胞/孔的密度将细胞接种于96孔板，37℃，5％CO2恒温培养箱培 养；次日，按照ECAR检测实验说明书进行药物处理，设置3个重复孔。将96孔板 置于无CO2的37℃恒温孵箱中孵育3h，上机检测3～4h。将检测到的时间荧光信号 进行线性回归处理，计算斜率，进行统计学分析。

[0098] 2.5年轻与衰老MSCs中HK1表达的检测

[0099] 实时定量荧光PCR方法检测年轻与衰老MSCs中HK1的表达，方法同1.5。

[0100] 引物设计与合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成，具体序 列如表9所示：

[0101] 表9实时定量荧光PCR方法检测引物组

[0102]

[0103] 结果如图2a所示，年轻MSCs的相对葡萄糖消耗量为1，衰老MSCs的葡萄糖 消耗量为0.46。结果说明衰老MSCs的葡萄糖消耗量明显低于年轻MSCs。

[0104] 图2b所示为细胞外液的乳酸水平，年轻MSCs的相对乳酸水平为1，衰老MSCs 的乳酸水平为0.42。结果反映了衰老MSCs分泌乳酸的能力减弱，说明了衰老细胞 的糖酵解水平降低。

[0105] 结果如图2c所示，年轻MSCs的相对ATP含量为1，衰老MSCs的ATP含量为 0.56。结果说明了衰老MSCs的能量产生低于年轻MSCs。

[0106] 图2d所示为细胞外泌酸率，年轻MSCs的相对ECAR值为1，衰老MSCs的 ECAR值为0.78。结果反映了衰老MSCs的糖酵解水平降低。

[0107] 图2e为实时荧光定量PCR检测年轻与衰老MSCs中HK1表达水平的结果， 其中年轻MSCs中HK1的相对表达量为1，而衰老MSCs中HK1的相对表达量 为0.7。可以看出，随着衰老的发生，HK1的表达逐渐降低。

[0108] 实施例3以慢病毒为例：慢病毒转染衰老MSCs以获得改良的衰老 MSCs[0109] 3.1构建改良的衰老MSCs(高表达HK1的衰老MSCs)

[0110] 3.1.1委托上海吉凯基因化学技术有限公司构建滴度、稳定表达HK1的 慢病毒GV358，得到HK1慢病毒载体。所得HK1慢病毒载体病毒滴度为 2.5E+8，HK1的表达量是转染前的3倍左右。

[0111] 3.1.2确定最佳感染复数(即MOI值)

[0112] 将HK1慢病毒载体分别以1、25、50、75和100梯度MOI值感染衰老 MSCs，48h后感染效率超过80％且细胞毒性最小的MOI值(MOI＝75)为最 佳MOI值，用于后续实验。

[0113] 3.2确定构建稳定高表达HK1的衰老MSCs

[0114] 3.2.1将HK1慢病毒载体以MOI＝75来感染步骤1.2中培养得到的衰老 MSCs，感染72h(LV-HK1)，并设置阴性对照组(LV-Vector)：LV-Vector 为转染携带对照序列的慢病毒，培养72h。

[0115] 3.2.2通过实时荧光定量PCR检测慢病毒感染后与阴性对照组相比，过 表达组中HK1的表达增高倍数。

[0116] 检测结果如图3a和图3b所示，由图3a可以看出按照不同MOI 值感染携带HK1的慢病毒后，各组衰老MSCs中均有绿色荧光蛋白 表达，且MOI值为75时，绿色荧光蛋白表达最强，细胞毒性最小。 由图3b可以看出慢病毒感染72h后，过表达组与阴性对照组中均有 绿色荧光蛋白表达；与阴性对照组相比，过表达组中HK1的表达量 提高2.9倍。说明衰老MSCs感染慢病毒后其HK1能够稳定高表达。

[0117] 实施例4改良的衰老MSCs的糖代谢水平及衰老检测

[0118] 4.1检测过表达HK1对细胞糖代谢水平的影响

[0119] 4.1.1检测基因水平变化

[0120] 改良的衰老MSCs(LV-HK1)：按照MOI值为75，将携带HK1的慢 病毒载体感染步骤1.2培养的衰老MSCs(P10MSCs)感染72h，得到HK1 表达量为提高3倍的改良的衰老MSCs(P10MSCs)。

[0121] 4.1.2检测细胞葡萄糖消耗量

[0122] 结果如图4a所示，与LV-Vector组相比，LV-HK1组的葡萄糖消耗量上 调了1.6倍左右。说明改良的衰老MSCs葡萄糖消耗量明显上调。

[0123] 4.1.3检测细胞ATP含量

[0124] 结果如图4b所示，过表达HK1后，衰老MSCs的ATP含量上调了6 倍左右。相对于阴性对照组而言，改良的衰老MSCs的ATP含量显著上调。

[0125] 4.1.4检测细胞乳酸水平

[0126] 结果如图4c所示，与LV-Vector组相比，LV-HK1组的细胞乳酸水平上 调了1.5倍左右。说明改良的衰老MSCs的乳酸水平明显上调。

[0127] 4.1.5检测细胞ECAR水平

[0128] 结果如图4d所示，过表达HK1后，衰老MSCs的ECAR水平上调了 1.5倍左右。相对于阴性对照组而言，改良的衰老MSCs的ECAR水平显著 上调。

[0129] 4.2检测过表达HK1对细胞衰老的影响

[0130] 4.2.1通过倒置相差显微镜观察细胞形态学特点并进行统计分析

[0131] 结果如图4e所示，与LV-Vector组相比，LV-HK1组细胞呈长梭形，立 体感增强，边界清晰。如图4f所示，对两组细胞的形态进行统计学分析发 现，LV-HK1组的细胞表面积下调3倍而长宽比上调了2倍。说明了改良的 衰老MSCs的细胞形态呈现“年轻态”的变化。

[0132] 4.2.2通过SA-β-gal染色检测细胞衰老情况

[0133] 如图4g所示，LV-HK1组中的蓝染细胞数目明显减少，SA-β-gal阳性率 下调了2倍左右。由图可以看出，相对于阴性对照组而言，改良的衰老MSCs 的衰老情况得以改善。

[0134] 4.2.3通过RT-qPCR检测衰老相关因子的表达

[0135] 如图4h所示，通过实时荧光定量检测衰老相关因子P16INK4a和Rb1的 表达，发现LV-HK1组中P16INK4a和Rb1的表达分别下调了1.25和1.67倍。 说明相对于阴性对照组而言，改良的衰老的MSCs中衰老相关因子的表达明 显下调。

[0136] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。